אנו מודים הביולוגית הדמית מרכז הפיתוח (BIDC) מאוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו לשימוש בImaris, Imaris XT ו Matlab. אנו מודים V. Kharazia לסיוע הטכני ועל הנרי, LK פלורן, L. ךייטש על תרומתם לעריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממדינת קליפורניה מחקר רפואי על אלכוהול התעללות וסמים דרך קליפורניה בסן פרנסיסקו לSEB, המכונים הלאומיים לבריאות: 1R21DA029966-01 ופרס NIH מסלול המהיר להקרין את אוסף MLSMR לSEB, קליפורניה בסן פרנסיסקו בית הספר לרוקחות ( משרד הדיקן ורוקחות קליניות) ובית הספר לרפואה (פרמקולוגיה קלינית &amp; Therapeutics ניסיוני) לCLHK.

1. ניתוח מורפומטריות תלת ממדי של שינויים פנוטיפי תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (HEK293) תאי כליה עובריים אנושיים היו transfected עם hemagglutinin (HA) מתויג-corticotropin משחרר factor receptor-2 (CRF-R2), הקולטן G-חלבון בשילוב (GPCR) כפי שתואר לעיל 4, 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים היו מטופלת כראוי (ללא טיפול, NT), מגורה עם ליגנד CRF-R2 אנדוגני, גורם משחרר corticotropin, CRF (1 מיקרומטר, 30 דקות), או pretreated עם אנטגוניסט CRF-R2 סלקטיבית, 30 נגד sauvagine (AS -30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים אז היו נעוצים, permeabilized וטופלו באנטי HA. CRF-R2 היה דמיין באמצעות Alexa 594 ננומטר המצומד נגד עכבר (1 IgG) נוגדנים. DAPI שמש כדי להמחיש את השלב המיטוטי גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביל את הסובייקטיביות הנסיין, את תנאי הניסוי לא היו ידועים עד לאחר התמונות נרכשו ונותחו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו רכשנו תמונהשל מHEK293 תאים קבועים באמצעות מיקרוסקופ Zeiss LSM 510 META confocal מטרת תכנית-apochromat 63x/1.4 שמן דסק&quot;ש ומחובר למערכת קוהרנטית משולבת שני פוטוני ליזר המורכבת מורדים-V5 ליזר ומירה 900-F מערכת ליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תהליך רכישת הנתונים, התאים היו ממודרים הוא על ידי חתך multispectral, 488 ננומטר, ו790 ננומטר (ננומטר ~ Ex 350 2ph.) ומחיצות z (0.5 מרווחי מיקרומטר) כדי לכלול נתונים מקרום הגרעין לרצפטור התאי החיצוני גפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני הקרינה עובדו ראשונים באמצעות Imaris, המאפשר הדמיה והפילוח של בסיס נתוני מיקרוסקופיה 3D, ומודל 3D המורכב מvoxels מעוקבים נוצר עבור ניתוח מורפומטריות. ואז, Imaris XT מודול נוצל לImaris ממשק עם שפת תוכנת מחשב MATLAB כדי לקבוע את נקודת ציון של רחבות GPCR. לקחת בחשבון השתנות סלולרית, השיג ונתחתי פלואורסצנטי תמונות takבדרכו מ22 תאים: ללא טיפול (NT) (n = 7), אגוניסט טיפול (CRF) (n = 8) וטיפול מראש עם יריב (AS-30) לפני טיפול אגוניסט (n = 7) (איור 2) . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האזור של עניין (ROI) צריך לכלול תא אחד שהוא לא בשלב המיטוטי פעיל ולא לסגור לתאים אחרים. באופן זה, הניתוח יכלול תאים בעלי גרעין אחד בלבד ושלוחות הקולטן אינם מוטרדים קרבה של תאים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המבנה שוחזר 3D הסלולרי ראשון מנתוני קרינת multispectral באמצעות Imaris (v.7.1.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות האלגוריתם שתוכנן על ידי Imaris, 1 עיבוד פני השטח נוצל כדי לייצג את קרום הגרעין. Imaris יקבע אם יש יותר מגרעין אחד בהחזר על ההשקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז אלגוריתם כתמי יצירה נוצל כדי לאתר את סיומת CRF-R2. זיהוי כתמים נוצל כי זה מפצה על רעשי רקע ועצמה חריגה שלרשת מורכבת של תאי אמורפי בצורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למקסם את ההכללה של כל יחידת איתור קרינה של CRF-R2, בקוטר של הכתמים נקבע ל 0.2 מיקרומטר, המהווה את היחידה הקטנה ביותר בתוך התמונה על מנת להסיק מידע ייחודי בצורה של עצמה נמדדת באמצעות גאוסי מסנן. סינון ספוט התאגד בתהליך יצירת הנקודות האוטומטיות. התוכנה, לעומת זאת, נותנת למשתמש את הגמישות להשתמש במסננים כדי להגדיר את הפרמטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מחיתוך נתונים, ערכת הנתונים הוסבה מ8-bit (לא חתום) נקודה קבועה, לעשרוני 32-bit. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני עוצמות voxel הוחלפו לזהות נתוני קואורדינטות באמצעות מודול Imaris XT interfaced עם MATLAB ואת המיקום המרחבי המדויק של כל נקודה נקבע על ידי ביצוע שינוי מרחק באמצעות קרום הגרעין כנקודת התייחסות (איור 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים שיתקבלו ניתן לכמת ומוצגים בפורמט גרפי ליםניתוח tatistical. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות דו כיוונית ANOVA וBonferroni posttest. נתונים מוצגים כממוצע ± SD. הבדלים נחשבים משמעותי ב* p &lt;0.05. חישובים נעשו עם פריזמה GraphPad 5.02 (איור 4). </li></ol> 2. נציג תוצאות כדי להדגים את כוחה של הגישה שלנו, לכמת את השינויים התאיים הנובע מהאינטראקציה של קולטני G חלבון מצמידים (GPCRs) וגורם משחרר corticotropin הקולטן-2 (CRF-R2) עם CRF יגנד אנדוגני בHEK293 תאי transfected. אנו מראים כי רצפטורים CRF-R2 ממוקמים בקרום הפלזמה ופרויקט מאזורים סופיים של הקרום של התאים (האיור 2A וסרט 1). באמצעות ניתוח 2D קונבנציונלי, ניתן לזהות קבוצת משנה של קולטני תאי CRF-R2 רק אם אנו מנתחים את הקולטן הידבקות points על הזכוכית הקדמית. כתוצאה מכך אנו מאבדים את כל מידע אחר הנגזר מZ-נערמו נתוני multispectral (איור 5). כאשר תאי מטופלים עם CRF, הקולטנים התאיים מופחתים מאוד, כפי שמוצגים על ידי הירידה במרחק של כתמים מקרום הפלזמה. הם גם מחולקים מחדש ממקומות בעיקר סופיים למספר המקומות נפרדים (2B איור וסרט 2). ההשפעה של CRF על חלוקת קרום קולט נמנעת על ידי טיפול מקדים באנטגוניסט CRF-R2 הספציפי, 30 antisavagine (AS-30) ואנו מוצאים כי הרחבות CRF-R2 לא משתנות (האיור 2C וסרט 3). ההפצה הדיסטלי של כתמים, זממה ב 5 המרווחים המקודדים ספקטרום צבעי מיקרומטר, מנוצלת כדי להמחיש את המרחק מvoxels מקרום הגרעין. לא pretreatm טיפול ואנטגוניסטאף אוזן גרון (AS-30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לא הראה הבדל משמעותי (NS) בהתכווצות GPCR. טיפול בתאים עם אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) בהדרגה מפחית את מספר voxels-R2 המכיל CRF בהשוואה לכל טיפול, 0-5 מיקרומטר (NS), 6-15 מיקרומטר (** p &lt; 0.01) ו&gt; 15 מיקרומטר (*** p &lt;0.005), או בהשוואה לכמות ש- 30 לטיפול, 0-10 מיקרומטר (NS), 11-15 מיקרומטר (** p &lt;0.01) ו&gt; 15 מיקרומטר (*** p &lt;0.005) (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" /> איור 1. תרשים של טכניקות הזמינות הנוכחיות והגבלתם לנתח תמונות פלואורסצנציה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" /> <strong&gt; איור 2. תמונות פלואורסצנציה multispectral 3D של HEK293 תאי transfected עם HA-CRF-R2 לפני ואחרי אגוניסט אנטגוניסט וטיפול. תמונות ממוזגות מראות HA-CRF-R2-חקרו באמצעות אנטי HA ו מדמיינים באמצעות 488 אנטי עכבר (1 IgG) נוגדנים מצומדות אלקסה משניים; DAPI שמש כדי להמחיש את הגרעינים. התמונות שנרכשו עם ליזר confocal מיקרוסקופ סריקה (CLS). 5 מיקרומטר סרגל קנה מידה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" /> איור 3. מודל 3D של HEK293 תאי transfected עם HA-CRF-R2 שחזר מתמונות CLS באמצעות תוכנת Imaris. עיבוד פני שטח של הגרעין ויצירת כתמים מתאר רחבות GPCR הומרו לשלפוחית ​​קטנה. נתוני הקרינה עובדו ראשון באמצעות Imaris המאפשר הדמיה והפילוח של נתונים להגדיר מיקרוסקופיה 3D. ואז, Imaris XT נוצל לImaris ממשק עם MATLAB. עוצמות voxel הוחלפו לתוךנקודת המרכזת. כתמי צבע קשת מקודד (0-5 מיקרומטר הכחול, ירוק, 6-10 מיקרומטר, מיקרומטר 11-15 צהוב והאדום&gt; 15 מיקרומטר) מייצגים את צורת מרחק קרום הגרעין. הסולם של 5 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" /> האיור 4. ייצוג גרפי של ההפצה הדיסטלי של כתמים זמם בספקטרום הצבעים המקודדים ב 5 מרווחי מיקרומטר מנוצל כדי להמחיש את המרחק מvoxels מקרום הגרעין. אין טיפול וטיפול מקדים ביריב (AS-30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לא הראה הבדל משמעותי (NS) בהתכווצות GPCR. טיפול בתאים עם אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) מפחית בהדרגה את המרחק של מספר voxels-R2 המכיל CRF בהשוואה לשום טיפול 0-5 מיקרומטר (NS), 6-15 מיקרומטר (עמ ** &lt;0.01) ו&gt; 15 מיקרומטר (*** p &lt;0.005); או 0-10 מיקרומטר הטיפול AS-30 (NS), 11-15<html> מיקרומטר (** p &lt;0.01) ו&gt; 15 מיקרומטר (*** p &lt;0.005). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" /> איור 5. הגבלת ניתוח מורפומטריות 2D של 293 תאי transfected HEK עם HA-CRF-R2. סעיף מטוס האמצע של תאים (3-4μm מעל זכוכית coverslip) מראה את מרכז הגרעינים דמיין בDAPI וHA-CRF-R2 חקר באמצעות אנטי HA ו דמיין באמצעות Alexa 488nm מצומדת אנטי עכבר (1 IgG) משני נוגדנים ורכש עם CLS מראים שום הבדל בין () ללא טיפול (NT) ו (ב) אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות), ואילו את נקודתי ההדבקה הקולטן הן שונות באופן דרמטי. סרט 1. הסתובב בחופשיות, מודל 3D במצב &quot;לעלות&quot; לHEK 293 תאי transfected עם HA-CRF-R2, ללא טיפול, כדי להעריך את ההבדלים בין פנוטיפ סלולריים חלבוני הקולטן. סרגל קנה מידה 5-20 מיקרומטר.&quot;Target =&quot; / files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בסרט. סרט 2. הסתובב בחופשיות, מודל 3D במצב &quot;לעלות&quot; לHEK 293 תאי transfected עם HA-CRF-R2, טיפול אגוניסט, CRF (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) כדי להעריך הבדלי פנוטיפ סלולריים בין חלבוני הקולטן. סרגל קנה מידה 5-20 מיקרומטר. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a> סרט 3. הסתובב בחופשיות במצב 3D &quot;לעלות&quot; לHEK 293 תאי transfected עם HA-CRF-R2, טיפול מקדים ביריב (AS-30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות &#39;) כדי להעריך הבדלי פנוטיפ סלולריים בקרב חלבוני הקולטן. סרגל קנה מידה 5-20 מיקרומטר. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a>

<ol>
	<li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereological+methods+for+counting+neurons.">Design-based stereological methods for counting neurons.</a> Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).</li><li>Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowing+what+counts:+unbiased+stereology+in+the+non-human+primate+brain.">Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain.</a> J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).</li><li>Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+morphometry+and+cell-cell+communication+of+the+osteocyte+network+in+chick+and+mouse+embryonic+calvaria.">The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria.</a> Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).</li><li>Vickery, R. G., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamin-dependent+and+-independent+mechanisms+target+structurally+homologous+dopamine+receptors+to+different+endocytic+membranes.">Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes.</a> J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).</li><li>Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+responsiveness+is+regulated+by+targeted+sorting+of+D2+receptors.">Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors.</a> Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).</li><li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry.">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).</li><li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial+morphogenesis.">Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).</li><li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis.">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> J. Microsc. 227, 140-156 (2007).</li><li>Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+single-cell+dynamics.">Measurement of single-cell dynamics.</a> Nature. 465, 736-745 (2010).</li><li>Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+multivariate+profiling+of+drug+responses+from+single+cells.">Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells.</a> Nat Methods. 4, 445-453 (2007).</li><li>Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+cell+migration+inhibitors+via+automated+microscopy+reveals+a+Rho-kinase+inhibitor.">Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor.</a> Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנחנו הראינו כי טיפול CRF מושרה שינוי משמעותי במורפולוגיה ומיקום של CRF-R2. השינוי בCRF-R2 נבלם על ידי טיפול אנטגוניסט סלקטיבי. אנחנו הראינו כי שינויי הקולטן הם לא אותרו ולא ניתן למדוד באמצעות טכניקות multispectral 2D הסטנדרטיות. היכולת ללמוד תמונות 3D מורכבות היא קריטית כדי לשלב את המורכבות של פרמטרים ביולוגיים לצורך ניתוח מורפומטריות. היינו מסוגלים לבצע מדידות 3D של תאים ללא צורה מוגדרת מראש עם רכיבי רשת קרינה הבלתי עקביים. החבילה של שיטות המשתמש modifiable האוטומטי שלנו מאפשרת לנו לכמת דינמיקה מולקולרית בתאים בודדים אמורפי דמויים בסביבתם במטרה לחלץ מידע אודות דינמיקה סלולרית. כלי זה יכול לעזור להפוך את התחזיות לגבי ההשפעות של מתחם תרופתי על מסלולים סלולריים ושינויי מורפולוגיה תאיים בנוכחות מעכבים ולספק מידע על הישרדות תא. יתרונה של שיטת כימות 3D שלנו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים עם מומחיות רבה במנגנוני ביולוגיה, אבל לא מכיר את קודי מחשב, לשיטות מיקרוסקופיה ממשק עם יישומי מחשב. אנחנו עשינו מדידות תא בודד כדי לחשוף מידע המשקף אוכלוסייה של תאים 6. מדידה מתא בודד מספקת לנו אנליזה של תאים בצורה מורכבת ואינם נרתעים מקירבה עם תאים אחרים. שיטה זו תסייע למדענים בחקר שינויים בצורת תא ואת המיקום של חלבוני קרום בכריכה לאחר stimualtion הכימי 7, 8. הניתוח של תא צריך לכלול נתונים מתאי הליבה הפנימיים הסלולריים לגפיים התאיים שלה. הכללת הנתונים המרבית שניתן להשיג מתמונת 2D היא מעבר לאמצע המטוס של תא, אולם הגרעין והמיקום החיצוני של קרום הפלזמה ממוקמים על מטוסי z שונים; הדמית 2D חותכתתמונה. כגרעין ממוקם בין 3 ל 4 מיקרומטר מעל נקודתי ההידבקות הסלולר, אשר ממוקמות על coverslip הזכוכית, כמות מוגדלת של נתונים הולכים לאיבוד. הארגון מחדש מרחבית הקולטן הזה ניתן לראות רק בתמונות 3D, והוא לא מסוגל לכימות ללא ניתוח. כלי זה מספק גישה חדשנית כדי לחזות ולמדוד את שינויים תאיים שלא התגלו תוך שימוש בטכניקות אנליטיות 2D מסורתיות, מתן מידע המתייחס למערכת התאית בכללות במקום מקוטעת על ידי נתוני 2D. גישה זו למדידת תאים בודדים יחד, עם טכנולוגיות שתוארו אחרות 9, מאפשרת לנו לחקור את המורכבות של דינמיקה הסלולר ובסיס הפלסטיות סלולרית. שיטה זו אינה מוגבלת לImaris ויכולה להיות מיושמת על כל תוכנת הדמית נתוני ממשק עם תוכנת שפת מחשוב. שיפורים עתידיים במערכת יכללו ניתוח מורפומטריות של 3D תאים שנלקחו מהחייםתאים למאפשרים בחינה של כל התא במצבו הטבעי, ללא קיבעון כימי או צביעה כימית. רכישת תמונות של תאי חיים יהיה גם לחסל שונות בין תאית, מאז שאנחנו יכולים לכמת מדידות פנוטיפי באותו התא לאורך זמן. אנו מאמינים שטכנולוגית הפלטפורמה שלנו, בפוטנציאל שלה כדי למדוד את המבנים של תאים בצורה בלתי מוגדרים, יסייעו למדענים אחרים כדי למלא את פער בשיטות הדמית כימות. גישה חדשנית זו ישימה לאפיון של שינויים בתא בודדים רבים פנוטיפי, מה שהופך assay המבוסס תא זה, כאפיון אחר תא בודד 10, כלי נוסף לתהליך גילוי התרופות. מאז מורפולוגיה תא כבר מנוצל בתפוקה גבוהה הקרנה לזיהוי מעכבי מולקולה קטנה 11, כפלטפורמה זו מתפתחת, אנו מצפים בשיטה זו כדי להיות שימושית לקביעת עקומת מנת תגובה מתאים בודדים המשפיעים על אותו pharmacologiיעד קלוריות אבל עם מנגנוני פעולה שונים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> הכליה עוברית אנושית (HEK293) </td><td> אוסף תרבות סוג אמריקאי </td><td> CRL-1573 </td><td></td></tr><tr><td> של Dulbecco שינוי הנשר הבינוני (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965118 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי בסרום שור (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor-488 (IgG2b) </td><td> Invitrogen </td><td> -11001 </td><td></td></tr><tr><td> חד שבטי אנטי HA.11 (1 IgG) </td><td> Covance </td><td> 16B12 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> מעבדות וקטור </td><td> H-1200 </td><td>; </td></tr><tr><td> CRF </td><td> סיגמא </td><td> C2917 </td><td></td></tr><tr><td> Antisauvagine-30 (AS-30) </td><td> סיגמא </td><td> A4727 </td><td></td></tr></tbody></table>

an analytical tool that quantifies cellular morphology changes from three-dimensional fluorescence images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

Watch this Scientific Journal Video about An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images at JoVE.com

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

פתחנו פלטפורמת תוכנה שמנצלת Imaris Neuroscience, ImarisXT וMATLAB כדי למדוד את השינויים במורפולוגיה של צורה מוגדרת נלקחה מפלואורסצנטי confocal תלת ממדי של תאים בודדים. זו גישה חדשנית יכולה לשמש כדי לכמת את השינויים בצורת התא בא הפעלה קולטנית ולכן מייצגת כלי נוסף אפשרי לגילוי סמים.

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

an-analytical-tool-that-quantifies-cellular-morphology-changes-from

Google

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Views.  University of California, San Francisco. פתחנו פלטפורמת תוכנה שמנצלת Imaris Neuroscience, ImarisXT וMATLAB כדי למדוד את השינויים במורפולוגיה של צורה מוגדרת נלקחה מפלואורסצנטי confocal תלת ממדי של תאים בודדים. זו גישה חדשנית יכולה לשמש כדי לכמת את השינויים בצורת התא בא הפעלה קולטנית ולכן מייצגת כלי נוסף אפשרי לגילוי סמים.

Video: An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

שינויים במורפולוגיה בלוטת החלב ואת הסיכון לסרטן השד אצל חולדות

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...