בגלל חיידקים הם כל כך קטנים, אנשים לעתים קרובות לשכוח שהם אובייקטים תלת מימדיים. הפרוטוקול שלנו מאפשר שחזור מדויק של הצורות של תאים שטוחים ומעוקלים. פרוטוקול זה דורש רק שינויים קלים במיקרוסקופ סטנדרטי והם זמינים בקבצי Script של MATLAB.
לפני תחילת הניסוי למקם שתי ערימות של כל אחד משלושה 20 על ידי 20 מילימטר כיסוי מחליק על הקצוות הנגדיים של שקופית מיקרוסקופ זכוכית אחת. פיפטה 200 microliters של פתרון כרית agarose על השקופית מיד ובתקיפות למקם שקופית שנייה על ערימת מחליקי כיסוי כדי לשטח את agarose. לאחר שאיפשר את agarose להתגבש במשך כדקה בטמפרטורת החדר בזהירות להחליק את השקופית העליונה ולהשתמש בקצה גדול של קצה פיפטה 200 מיקרוליטר לחתוך רפידות בודדות בקוטר חמישה מילימטר מן הג'ל.
כאשר כל הרפידות הושגו פיפטה תרבות התא E.coli מספר פעמים כדי לשבש את כל גושי התא כדי להבטיח כי התאים מופצים הומוגנית לפני הוספת מיקרוליטר אחד של תת תרבות על כל כרית. לאחר מתן לדגימות אוויר יבש במשך חמש עד 10 דקות לאשר כי טיפות נספגו לחלוטין לתוך רפידות לפני הנחת להחליק כיסוי על הרפידות. לאחר מכן השתמשו במטלית כותנה כדי להבריש בעדינות איטום מתאים סביב קצה החלקת הכיסוי, תוך שמירה על איטום הרחק מהחלק העליון של החלק העליון של החלק העליון של המכסה.
מיד לאחר איטום החלקת המכסה מניחים את השקופית על שלב מיקרוסקופ ולאחר חמש דקות של שיווי משקל תרמי משתמשים בגלגלי המיקוד של המיקרוסקופ כדי להביא את אמצע התא לפוקוס. בתוכנת המיקרוסקופ המשויכת תחת רכישת ND, סמן את התיבה Z כדי להשיג מחסנית Z ולחץ על לחצן בית כדי להגדיר את מרכז התא כנקודת ההתחלה. הגדר את גודל השלב ל- 0.1 מיקרומטר ואת הטווח לארבעה מיקרומטרים וודא שהתקן Z מוגדר לשלב ה- Piezo.
זה קריטי כי יש טשטוש מספיק על החלק העליון והתחתון של התא, כך התא הוא כמעט בלתי ניתן להבחנה מן הרקע. הגדר את ערוצי הפלואורסצנט מתחת לחלון lambda להגדרות עבור מולקולות פלואורסצנטי להיות בתמונה ולאשר כי סדר הניסוי מוגדר lambda כך מחסנית Z מלאה תושג בכל ערוץ צבע לפני המעבר. לאחר מכן לחץ על הפעל כעת כדי להתחיל ברכישת התמונה.
כאשר כל התמונות נרכשו לפתוח את הקבצים בתוכנה המתאימה לניתוח תמונה. צייר תיבה מסביב לתא בודד ושכפל תא זה פעמיים, פעם אחת עבור כל ערוץ, ודא שהתיבה שכפל היפרסטאק מסומנת ושנה את הערוץ לתא אחד או שניים. לאחר ששתי הערימות זמינות, בחרו 'תמונות', 'ערימות', 'כלים' ו'שרשור' לשילוב התמונות.
עם ערוץ החלבון הראשון ואת ערוץ הצורה השני. לאחר שמירת התמונה החדשה כקובץ TIFF, הפוך תיקיה בתוך תיקיה בשולחן העבודה המכילה את התמונות שנחתכו ואת cell_shape_settings_tri. קובץ txt מ- shae-cellshape-exampleData_tri.
ערוך את cell_shape_settings_tri. קובץ txt כדי לקבל את ההגדרות הנכונות עבור הניסוי של עניין. והפעל את Cell_shape_detector3dConvTriFolder הפונקציה עם המחרוזת למיקום התיקיה ואחריה את מספר התא שבו יש להתחיל ואת מספר התאים שיש להפעיל.
כדי לאשר שהתאים שוחזרו כראוי, הפעל את ScreenFits. כאשר ממשק המשתמש הגרפי נפתח, לחץ על לחצן בחר תיקיה ובחר את התיקיה עם קבצי נתוני השחזור כדי לסנן באופן חזותי את שחזורי התאים הבודדים. עבור כל תא שנראה מעוות או חסר כיסוי מלא, בחר את התיבה לצד השחזור כדי לצרף את FLAG לשם כך שניתן יהיה לא לכלול אותו בכל ניתוח במורד הזרם.
הפעל העשרהSmothingSpline כדי ליצור פרופיל העשרה של הריכוז היחסי של חלבון העניין כפונקציה של העקמומיות הגאוסית על פני השטח. לאחר מכן בחר כל תיקיה עם TRI שנוצר זה עתה. בחרו בקובץ מחצלת העקומה החדש שנוצר.
שיטה זו שימושית במיוחד כאשר עוסקים בתאים מעוקלים או בצורה חריגה כייצוג דו-מימדי אינם יכולים לשקף את העקמומיות של התאים במדויק. בניסוי זה נוצר חלבון היתוך פלואורסצנטי ירוק לחלבון אקטין חיידקי MreB כדי לחקור את לוקליזציה מדויקת של חלבון actin הן בסוג הבר והן בתאי E.coli מוטציה. על ידי ביצוע מדידות אלה בתמונות שנתפסו 3D הצורות של סוג הבר ותאי מוטנט rodZ הצליחו להיות משוחזרים.
לוקליזציה של MreB נקבע אז להיות מועשר עקמומיות גאוסית קטנה, תכונה גיאומטרית שניתן למדוד רק 3D באופן תלוי rodZ. זכור לוודא מחסנית Z הוא גדול מספיק כי התאים מטושטשים בחלק העליון והתחתון, כי התאים הם במים היטב אחד מהשני. אנו מראים כיצד למדוד את לוקליזציה גיאומטרית של חלבונים ב 3D אבל מידע אחר ניתן לחשב מנתונים אלה כגון גודל של מכלי חלבון תג.
