המחברים מודים א בנהם לסיוע בפיתוח של פרוטוקול. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענק NS06747 אל באב

1. הכנת תולעים הדמיה קטע זה של פרוטוקול מבוסס על פורסם C. טכניקות elegans תרבות 1,2, ו מתואר באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תולעים על צלחות peptone גבוהה NGM אגר (10 ס&quot;מ) עם זרע NA22 א &#39; החיידק אשריכיה קולי עד כמעט גוועה ברעב. אם immunostaining, 1 צלחת יהיה אמין לייצר תולעים מספיק לאדם 1 כתם, תוך הפסדים בחשבון לאורך הדרך, וכן את אמות המידה המחמירות נהגו לבחור תולעים עבור דימות (ראה חלק 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים קציר ידי שפיכת מ&quot;ל כמה DDH 2 0 לצלחת, מסתחררים לרגע, לשפוך נוזל לתוך צינור מ&quot;ל 15 חרוטי (חוזר במידת הצורך להעביר את רוב התולעים אל הצינור). גלולה בצנטריפוגה קליני 3 דק &#39;, ג&#39;1000x. לשטוף גלולה 1-3x עם DDH 2 O עד supernatant ברור להסיר חיידקים שיורית. להשתמש ב &#39;העברה בטפי להחדרת נוזלים פוליפרופילן להסיר supernatants, כמו תולעים מקל זכוכית(למן שלב זה הוא קריטי כדי לצמצם את זמן בין הצעדים כדי למנוע הפסדים הכדאיות ביצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכביסה האחרון, resuspend תולעת גלולה בפתרון hypochlorite 5 מ&quot;ל בסיסי כדי lyse תולעים וביצים שחרור. לטלטל בעדינות, ולבחון צינורות תחת מיקרוסקופ לנתח על אחת לדקה. כאשר כ - 50% של תולעים זה lysed (הם יופיעו כפופות שבר פתוח), לסיים תמוגה ידי מילוי צינור למעלה עם מאגר ביצה, מספר פעמים היפוך, ו pelleting במשך 3 דקות, גרם 1000x. זמן תמוגה לא יעלה על 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant עם העברת פיפטה, ולשטוף גלולה 3x עם מאגר ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד ביצים מן ההריסות, צפים להם על כרית של סוכרוז 30% ב DDH 2 O: לאחר שטיפת הסופי משלב 1.4, להסיר בזהירות גלולה supernatant ו resuspend ב 5 מ&quot;ל DDH 2 0. הוסף 5 מ&quot;ל סוכרוז סטרילית 60% ב DDH 2 O, ומערבבים היטב. ספין בצנטריפוגה קליני 6 דק &#39;, ג&#39;1000x. הביצים יאספו את המניסקוס (הם האיש עכירות), בעוד הלכלוך גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברת פלסטיק, למצוץ את הביצים בהיקף מינימלי להעביר צלחות אגר unseeded NGM. ביצים כל דבקות בצד של הצינור ניתן לשטוף בעדינות והועברו גם כן. אחד 10 ס&quot;מ unseeded צלחת לכל זן ניתחו מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות unseeded עם הביצים לילה (~ 16 שעות) ב 20 מעלות ג לפרוק את הצלחת על השעות הראשונות כדי לייבש אותו על ידי השארת את המכסה מעט לסירוגין במשך כמה שעות, אך הקפד לכסות לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבקיעה, להעביר את הזחלים L1 לצינור קוני 15 מ&quot;ל בסל S (Basal להוסיף לצלחת מ&quot;ל S כמה, מערבולת, שופכים לתוך הצינור). גלולה בצנטריפוגה קליני (3 דק &#39;, ג&#39;1000x), resuspend בהיקף מינימלי של Basal S, והעברה NGM 10 ס&quot;מ צלחות אגר שנזרעו עם NA22 חיידקים. השתמש 2 צלחות כאן כל צלחת המקורי משלב 1.1. דגירה עד תולעים מגיעים לגיל הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על תרבויות פעם או פעמיים ביום. אם הם נמצאים בסכנה OF רעב, להעביר NA22 צלחות חדשות. עבור wild-type תולעים N2, רעב מקדים להקמת הקו או גל של תולעים שזז על צלחת כמו בעלי חיים נודדים בהמוניהם מן המזון מדולדל אזורי. ברגע זה צורות, האוכל יהיה מדולדל לחלוטין בתוך מספר שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים זה מוכן כעת immunostaining או הדמיה חיה. תיקון ו מכתים תולעים ההשעיה הוא אופטימלי, כי מספר רב של תולעים שלמים ניתן הדמיה בקלות. נהלים צביעה המבוססות על פיני ו Ruvkun פרוטוקול 3-6 עדיף להקפיא לפיצוח הליכים בשל מספר רב של תולעים יש צורך הדמיה. </li></ol> 2. Confocal הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תולעים בשקופיות עבור הדמיה confocal. התאם את צפיפות התולעים כדי כמה מאות לכל microliter. לעשות בלוק agarose 2% ב-S הבסיס מוקף בטבעת דקה של וזלין כדי למנוע אידוי במהלך ההדמיה (מיושם באמצעות מזרק 3 מ&quot;ל מצויד במחט 25 ניתוק מד). טפטפתמיקרוליטר של כמה ההשעיה תולעת על גבי תלוש כיסוי (שימוש בהרדמה אם תולעים חיות הדמיה), ולהפחית את הפנקס agarose על פתק את המכסה, להפיץ את התולעים באופן שווה על פני משטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תולעים עבור דימות. בחר שם תולעים הסינפסות של עניין מכוונים לכיוון העדשה אובייקטיבי, עם עקירה הרדיאלי של לא יותר מ ± 45 ° (כאשר 0 ° אומר מכוונת ישירות לכיוון המטרה). לבצע הערכה במהירות (כמה שניות), כדי למנוע photobleaching. בקנה מידה של התרבויות הראשוניות הוא מותאם על מנת להבטיח מספיק תולעים יספק קריטריונים אלה גיאומטריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את ההדמיה confocal של הדגימה. דגימות שטוח יחסית, כי אפשר להכיל בתוך כ 14 חלקים עבים 0.4 מיקרומטר לייצר את התוצאות הטובות ביותר. מהירות גבוהה, תמונות ברזולוציה נמוכה (512 x 512 פיקסלים) מספיקים איסוף נתונים מהיר ומדויק. הימנע להרוות את גלאי עם עוצמות אות מוגזמות, כמו זה יגרום הערכה נמוכה מדי של הקרינהאותות. </li></ol> 3. זיהוי וניתוח אוטומטי של אשכולות סינפטיים אישיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח רב TIF פלט קבצים באמצעות מיקרוסקופ confocal Volocity 4.0 (ומעלה) תוכנה (PerkinElmer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היבול משם אזורים של התמונה, כי אינם מכילים את המבנה של עניין (Image -&gt; פוקוס מורחב -&gt; אזור בחר עניין באמצעות הכלי &quot;Freehand ההחזר על ההשקעה&quot; -&gt; פעולות -&gt; חתוך הבחירה; 2A איור). , הערה פוקוס מורחב מייצרת השלכה Z-המטוס על מסך המחשב כדי לסייע בניתוח שלך, אבל לא משפיע על הנתונים המשמשים כבסיס, אותו הדבר נכון גם עבור התאמות הבהירות והניגודיות, במידת הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אורך האזור נותחו באמצעות כלי הקו. אורך הקו יהיה מחושב נוסף בטבלת הנתונים (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי עצמים באמצעות &#39;אובייקטים לפי עוצמה &quot;המסנן (מצב מדידות). ציון סף כזה אשכולות סינפטיים הםמודגש ולא סינפטית הרקע לא (איור 2 ג). הכללת סמן הסינפטי עצמאית שכותרתו עם צבע אחר יכול לעזור לזהות באופן חד משמעי סינפסות. סינפסות אופייניים נעים בין כמה מאות ל ווקסלים ספורות. הגדרת הסף פעם אחת באמצעות מדגם הבקרה, ולהשתמש בו עבור כל דגימות הבאות. Thresholding כל דגימה בנפרד אינו מתקבל על הדעת משום שהוא מציג את הפוטנציאל הטיה הניסוי. אובייקטים נבחרים נספר באופן אוטומטי (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר ולייצא את הנתונים. לחסל את האובייקטים של 2 או פחות ווקסלים, שכן אלה הם בדרך כלל כתמים ברקע. אלה ניתן למנוע על ידי סינון נוספות, או במהלך ניתוח שלאחר מכן. כדי להקל על הזרם הוצאתם מחדש, למיין את קובץ הנתונים של &quot;גודל האובייקט&quot; אז הם קבוצה כל רצון יחד. לייצא את הנתונים בפורמט CSV, אשר ניתן לפתוח על ידי Microsoft Excel או בתוכניות גיליון אלקטרוני אחרות. כל תמונה יוצרת, בהיעדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם Volocity רכהכלי אינו זמין, שיטות חלופיות לניתוח Z-המטוס תחזיות של נתונים confocal עשוי להיות מנוצל (נ&quot;צ למשל. 7, או ניתוח הוראות שימוש ImageJ), אם כי 3 מימדי מידע הולך לאיבוד (ראה דיון). </li></ol> 4. נציג תוצאות שיטת כימות הציג אמור להיות מסוגל להבחין בין אוכלוסיות מצרר של בהירות שונה כרכים שונים. תמונות מייצגות ונתונים כמותיים המתאימים המוצגים באיור 3 להפגין דוגמאות של בידול על בסיס פרמטרים אלה. ככלל התוצאות צריך לעקוב אחרי מה בולט לעין. במקרה של הקולטן UNC-49 GABA immunostaining כבל עצב הגחון של C. elegans, כל בעלי החיים בדרך כלל נראה דומה מאוד בגודל בגרות, וסך ערכי הקרינה סינפטיים עבור קבוצה של חמש תולעים (מנורמל לאורך של חוט העצב ניתח) הראה שגיאת התקן<html> ערכים של כ -10% של ממוצע 4. מוטציה גנטית טיפולים ניסיוניים אחרים (כגון: חשיפה לתרופה) עשוי לשנות לא רק את עוצמת הקול ערכי העוצמה הפצות בתדירות של אשכולות סינפטיים, אבל אולי ההתפתחות בזמן הקורס בתיאום של התולעים, המוביל שונות גבוהה יותר. עם זאת תוצאות כמותיות תמיד צריך לשקף מה יכול להיות מוערך באופן חזותי ואם לא, בדיקת התמונות והחפצים שזוהו על ידי Volocity תגלה היכן אירעה השגיאה ולהציע פעולה מתקנת כגון thresholding מחדש או הסרה של אובייקטים artefactual. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> באיור 1. הכנת סינכרוני ג elegans תרבויות. תרבויות סינכרוני מתקבלים בהליך זה משום ג elegans מעצרים פיתוח בשלב הזחל L1 בהיעדר מזון, ממשיכה להתנהל, כאשר האוכל הוא הציג. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> איור 2. לכמת את puncta הסינפטי. <ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורים זרים של התמונה נחתכות כדי להפחית את גודל הקובץ ולהגדיל הספציפיות. לוח יד שמאל מראה מתחיל התמונה, באמצע הפאנל מראה האזור שנבחר, לוח הזכות מראה התמונה לאחר החיתוך. האות האדום הוא UNC-49 immunofluorescence GABA רצפטור, אות ירוק synaptobrevin-GFP (סמן presynaptic) הביע בנוירונים גאבא presynaptic 4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קו מצויר אורך קטע העצב בחוט להיות מנותח, ואת אורכו נרשם באופן אוטומטי בטבלת התוצאות. מידע זה דרוש כדי לנרמל את הנתונים סינפטיים בשל אורכו של חוט העצב analyzable, אשר יכול להשתנות פי כמה וכמה אם תולעים להיות מקוטעת במשך מכתים.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סף מוחל לזהות אשכולות סינפטיים בודדים. הלוח השמאלי מציג את התמונה לפני thresholding, דוגמאות של רמות thresholding שונים מוצגים לוחות נפרדים (אות ירוק מושמט). כל אובייקט מזוהה מתואר על התמונה של אזור צבעוני. הערה התכתבות בין אשכולות סינפטיים שנרשמה חזותית בלוח השמאלי ביותר לבין אזורים צבעוניים על לוח העכבר הימני ביותר. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל אובייקט מזוהה מופיע בנפרד בטבלת התוצאות. אובייקטים בודדים ניתן לבחור, ואת מודגשים על התמונה לבדיקה אם תרצה בכך. הערה טבלה המכילה מידע על אדום (&quot;rhodamine &#39;) וירוק (&quot; EGFP&#39;) ערוצים: ערוץ מידע ירוק מטעה פוטנציאל מאז היו אובייקטיםזיהו מבוסס אך ורק על פלואורסצנטי אדום. ניתוח זה יכול להתבצע גם על תמונות צבע יחיד. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> איור 3. נציג תוצאות. Micrographs נציג של wild-type C. elegans מוכתמים של UNC-49 עבור קולטני GABA לפני () ואחרי הטיפול (ב &#39;) עם muscimol, אגוניסט קולטן GABA שגורם קולטנים להיות downregulated לאחר חשיפה ארוכה. לוחות להראות תמונות שנחתכו לפני (משמאל) ואחרי thresholding (מימין) הסרת כתמים רקע קטנים. (ג) מגרשים של פרמטרים כמותיים סינפטיים עבור דגימות המוצגים (א) ו - (ב): הקרינה הכוללת מנורמל לאורך העצב בחוט (משמאל) היסטוגרמות ההסתברות המצטברת של תוכן סינפסה הפרט הקרינה (באמצע) ואת עוצמת הסינפסה (RighT), הוכחת ירידה משמעותית סטטיסטית בתוכן נפח הסינפטי ו הנגרם על ידי חשיפה אגוניסט (n = 60 סינפסות עבור מטופלים, N = 115 סינפסות עבור muscimol שטופלו, p &lt;0.001, קולמוגורוב סמירנוב, מבחן <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / סטטיסטיקות / KS-test.html</a> ).

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השיטה המוצגת כאן נועדה לחלץ כמותיים רב פרמטרים הנתונים על אוכלוסיות גדולות של סינפסות ב C. elegans, תוך מיקסום עקביות בתוך קבוצות הטיפול. שלוש תכונות לתרום יעדים אלה. ראשית, immunostaining מבוצע על אוכלוסיות תולעת סינכרוני על מנת להבטיח כי כל בעלי החיים הם בני אותו גיל. שלב ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם של התוכנה </td><td> חברה </td><td></td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> Volocity v4.0 ומעלה </td><td> PerkinElmer / Improvision </td><td></td><td> בדיקת הדמיה הליבה המקומי מתקן גישה לתוכנה זו. תוכנות הדגמה זמין בכתובת האינטרנט PerkinElmer. שיטה זו מחייבת רק את מודול לכמת את Volocity. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלה 2. חומרים כימיים ספציפיים וציוד. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ביצה חיץ </td><td> NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (התאם את ה-pH 7.3) </td> &lt;TD&gt; 118 mM 48 mM 2 מ&quot;מ 2 מ&quot;מ 24 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Hypochlorite אלקליין (עבור מ&quot;ל 5) </td><td> בית אקונומיקה טרי (להשליך בקבוק 30 יום לאחר הפתיחה) 10 N NaOH DDH 2 O </td><td> 1.0 מ&quot;ל 0.25 מ&quot;ל 3.75 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלה 1. פתרונות. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

עוצמת הסינפסה מתייחס משרעת של תגובות postsynaptic לאירועים presynaptic שחרור הנוירוטרנסמיטר, ויש לו השפעה משמעותית על התפקוד הכללי במעגל העצבי. עוצמת הסינפסה תלויה באופן קריטי שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות באתרים הסינפטיים על קרום postsynaptic. רמות הקולטן מבוססים מבחינה התפתחותית, והוא יכול להשתנות על ידי הקולטן סחר בין בריכות קרקע מקומי, subsynaptic, ו תאיים, המייצגים מנגנונים חשובים של פלסטיות סינפטית neuromodulation ו. שיטות מחמירות לכמת synaptically-מקומי הקולטן שפע הנוירוטרנסמיטר חיוניים ללמוד פיתוח הפלסטיות הסינפטית ו. מיקרוסקופ פלואורסצנטי היא גישה אופטימלית, כי היא שומרת מידע מרחבי, להבדיל מ - סינפטי לא סינפטיים בריכות, ומפלה בין אוכלוסיות מקומיות הקולטן לסוגים שונים של סינפסות. אורגניזם גנטי מודל Caenorhabditis eleganזה מתאים במיוחד עבור אלה מחקרים בשל גודל קטן הפשטות היחסית של מערכת העצבים שלו, השקיפות שלו, ואת הזמינות של טכניקות גנטיות רבות עוצמה, ומאפשר בחינה של סינפסות דובר בבעלי חיים שלמים. כאן אנו מציגים שיטה לכימות fluorescently שכותרתו קולטני הנוירוטרנסמיטר סינפטיים ב C. elegans. תכונת המפתח שלה הוא זיהוי וניתוח אוטומטי של סינפסות בודדות בשלושה ממדים רב המטוס confocal פלט קבצים מיקרוסקופ, מיקום tabulating, נפח, עוצמת הקרינה, וכן הקרינה הכוללת של כל סינפסה. גישה זו יש שני יתרונות עיקריים על פני ניתוח ידני של Z-המטוס תחזיות של נתונים confocal. ראשית, כי כל מטוס של סט נתונים confocal כלול, הנתונים לא הולכים לאיבוד דרך הקרנת Z-המטוס, המבוססת בדרך כלל על ממוצעים בעוצמה פיקסל או מקסימה. הזיהוי השני, של סינפסות היא אוטומטית, אבל יכול להיבדק על ידי לשעברperimenter עם התקדמות ניתוח נתונים, המאפשר מיצוי מהיר ומדויק של נתונים מתוך מספר רב של סינפסות. מאות עד אלפי סינפסות לפי המדגם יכול בקלות לקבל, ייצור ערכות נתונים גדולות, על מנת למקסם את כוח סטטיסטי. שיקולים להכנת ג elegans לניתוח, ולבצע הדמיה confocal כדי למזער את השונות בין בעלי חיים בתוך קבוצות הטיפול הם דנו גם. למרות שפותחה לנתח ג קולטנים elegans postsynaptic, שיטה זו היא בדרך כלל שימושית עבור כל סוג של חלבון synaptically, מקומית, או למעשה, כל אות הקרינה, כי הוא מקומי לאשכולות נפרדים, puncta או האברונים. ההליך מתבצע בשלושה שלבים: 1) הכנת דוגמאות, 2) הדמיה confocal, ו 3) ניתוח התמונה. שלבים 1 ו -2 הן ספציפיות ג elegans, ואילו בשלב 3 הוא בדרך כלל החל על כל אות הקרינה punctate ב micrographs confocal.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans at JoVE.com

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה ב<em&gt; ג elegans</em&gt;, המאפשר מאות סינפסות להתאפיין במהירות ללא עיוותים הציג תחזית Z-המטוס בתוך מדגם אחד.

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

10.2K Views.  University of Toledo. שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה ב ג elegans, המאפשר מאות סינפסות להתאפיין במהירות ללא עיוותים הציג תחזית Z-המטוס בתוך מדגם אחד.

Video: Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...