אנו מודים לאדם קוסטר וכל חברים האחרים של מעבדות אלטשולר והוו לקבלת משוב ודיונים מועילים. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01 GM085442 וCA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), וולטש קרן I-1619 (SJA) ואני-1644 (LFW).

1. דוגמאות והדמיה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תרבויות באופן שיגרתי ולשמור במפגש 20-70%. יום אחד לפני הניסוי, לגדל תאי הלה בDMEM (הנשר בינוני השתנה Dulbecco, ראה טבלה של חומרים) ותוספת 10% FBS (בסרום שור עוברי) ו1x פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של ניסוי, תאי פיצול גדל בתרבות (מחוברות כ -50%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם PBS (בופר פוספט), לחשוף לכ 2 מיליליטר של טריפסין / EDTA (חומצת ethylenediaminetetraacetic) לכמה שניות. לשאוב טריפסין עודף / EDTA ולשמור על תאים שטופים בשכבה דקה של טריפסין / EDTA בשכונה ב RT ל~ 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני לנער צלוחיות פעמיים ולנתק תאים עם תקשורת בסרום בתוספת. ספירת תאים ו לדלל את 5,000 cells/50 μl של תקשורת ומייד צלחת 50 μl / גם על צלחת זכוכית תחתונה 384 גם באמצעות רובוט נוזל טיפול אוטומטי (רק 30 היטבים של הצלחת משמשים כאן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת על RT במשך 30 דקות כדי למזער את השפעות קצה בבארות 5. לאחר צלחות הדגירה RT, מקום בC 5% CO חממה 37 ° / 2 לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל תרופה תהיה assayed בשני עותקים. הוסף 25 μl של תרופה לבארות המתאימות על הצלחת כבר מכילה מדיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הצלחת עם 4% פתרון paraformaldehyde ב-PBS בטיפול תרופתי שלאחר שעות 24. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתמה הנוגדנים הספציפיים הראשוניים, נוגדנים משני שכותרתו fluorescently וכתמי ניאון אחרים ששמשו כאן מפורטים בטבלה של חומרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize קבוע תאים עם 0.2% טריטון ב TBS פתרון X-100 (שנאגר מלוח טריס) במשך 3 דקות, ולשטוף עם TBST (שנאגר מלוח טריס + Tween 20) 3x. הוסף 5% פתרון BSA (שור הסרום אלבומין) ב TBST לחסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת ב RT במשך שעה 2 ולאחר מכן לשטוף עם 3x TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך dilut נוגדן הראשונייוני BSA 5% ב TBST (ראו טבלה של חומרים) ולהוסיף 10 μl / טוב. דגירה צלחת ב RT במשך שעה 2, ולאחר מכן לשטוף 3x עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך BSA dilutionin נוגדנים משני 5% ב TBST (ראה טבלה של חומרים) ולהוסיף 10 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת בחושך ב RT עבור שעה 2 ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים לHoechst וphalloidin (ראה טבלה של חומרים) בPBS ולהוסיף 10 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת בחושך במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 washes TBST, פרוניט רדיד חנות 4 ° CO / נ </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות מטרת 20X עם binning המצלמה 1x1. לרכוש תמונות שש עשרה לכל טוב, עבור סכום כולל של 480 תמונות (ערוצי x3). </li></ol> 2. ניתוח תמונות הורד והתקן את PhenoRipper מphenoripper.org, ולהשיק PhenoRipper להתחיל ניתוח של הר&quot;יGES. PhenoRipper תומך TIFF כיום, PNG, ו-JPEG וכל הפורמטים האחרים הנתמכים על ידי MATLAB (תוכנת מיקרוסקופ תומכים בדרך כלל ביצוא לTIFF). 2.1 טוען נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין ועידת שמות / ארגון סטנדרטי קיימת לתמונות מיקרוסקופית, אשר יכול להפוך את טעינת תמונות ומטה שיוך (כלומר הסברים ניסיוניים כגון סוג טיפול, גם מספר וכן הלאה) חלק המאתגר ביותר של זרימת העבודה. בחר באחת מהשיטות שהוצגו (שיפורט להלן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PhenoLoader: בחר באפשרות זו כדי למחצה באופן אוטומטי לטעון את הנתונים כאשר שם הקובץ ו / או מבנה ספרייה מכיל מספיק מידע לתמונות קבוצה כרצוי (למשל B16 HeLa_Drug5-DAPI.png מצביע על אפשרות שהתמונה היא מגם B16, טיפול בתאים עם הסמים זיהוי שלו הוא 5, ואת התמונה לוכדת את כתם DAPI הגרעיני - עם יום אמנה זו, את כל תמונות מהיטב A1 או שטופלו בתרופות 5 יכולה להיות מקובצים בקלות). האשףמוביל את משתמש השלב אחר שלב כדי לשייך מטה עם קבוצות תמונה ולהגדיר את הסמנים באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;מבנה קובץ&quot; לגשת חלון PhenoLoader. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;הגדרת מדריך שורש&quot; כדי לבחור את הספרייה המכילה את בסיס נתוני תמונה. ואז לסנן לניתוח (לא חובה, ניתן להשאיר ריק) קבצים שאינם בשימוש (קבצים שאינם בשימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;סמני הגדר&quot; כדי לציין את הסמנים הביולוגיים המשמשים בניסוי ולקשר אותם עם התמונות. באופן ספציפי, לחץ על קובץ תמונה ולאחר מכן בחר בחלק משם הקובץ שמזהה באופן ייחודי את הסמנים הביולוגיים. לבסוף, הזן שם עבור כל סמן ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מידע נוסף על הגדר&quot; כדי לשייך את המידע עם כל תמונה. באופן ספציפי, לחץ על קובץ תמונה ולאחר מכן בחר בחלק משם קובץ זיהוי מידע על תמונה (&quot;B16&quot; למשל לשם טוב). חלון המבקש לשם קבוצה (לדוגמא &quot;אנחנוll &quot;) יצוץ, הזן שם. חברי הקבוצה חולץ מהקובץ יוצגו בטבלת הקבוצות (לדוגמא את הרשימה המלאה של שמות כן). כדי להוסיף פרטים נוספים שלא קיימים בקובץ, לחץ על&quot; (לא חובה) הבא &quot;כפתור. לחץ על&quot; הוסף קבוצת מידע &quot;, הזן את שם קבוצה נוסף (למשל,&quot; תרופות &quot;) ולכל ערך של הקבוצה המוגדרת מראש (למשל&quot; טוב &quot;), הזן את הערך שלו (למשל&quot; טקסול &quot;) . אין הגבלה למספר קבוצות נוספות שניתן להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לחץ על &quot;Metadatafile צור&quot; כדי ליצור את הקובץ מטה ולהמשיך את הניתוח. אם קובץ metadata כבר נוצר בעבר, ניתן להימנע מהשלבים שלעיל ישירות על ידי טעינת הקובץ באמצעות האפשרות &quot;קובץ מידע&quot; (מתואר ב3 להלן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבניות ביטוי רגיל בהתבסס: ביטויים רגולריים הם גישה סטנדרטית לדפוסי התאמהבטקסט. בחר באפשרות זו כאשר שם הקובץ ו / או מבנה ספרייה מכיל מספיק מידע לתמונות קבוצתיות ואמנת השמות מתאימה לאחד מהתבניות קיימים מראש. תבניות מותאמות אישית המבוססות על ביטויים רגולריים עשויות גם להיות מוגדרות באופן ידני ולשימוש חוזר. אפשרות מתקדמת זו מומלצת רק עבור משתמשים מכירים ביטויים רגולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבצי מידע נוסף: בחר באפשרות זו להתאמה אישית אולטימטיבית. להגדיר ולטעון ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) המכילים שמות קבצים ומטה הקשורים לכל תמונה. דוגמא לקובץ בפורמט נגיש בחלק להורדה של אתר האינטרנט (phenoripper.org). פשוט לטעון את הקובץ באמצעות הממשק כדי להציג את המידע שהוא מכיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את השדה מטה שמגדיר משכפל בניסוי כדי למנוע דגימה מיותרת. עבור ערכות נתונים המכילות משכפל (למשל את כל התמונות ובצריכות להיות דומות), לקבץ אותן יחד (למשל על ידי היטב) יכול הופעותביצועים אובים. ברוב המקרים זה סביר לבחור את ברירת המחדל &quot;אקראי (לא יודע)&quot;, שבוחרת תת קבוצה אקראית. </li></ol> 2.2 הגדרת פרמטרי ניתוח לחץ על &quot;פרמטרים שנקבע&quot; כדי להגדיר את הפרמטרים הדרושים כדי לעבד את הנתונים. הפרמטרים להגדרה הם בפנל השמאלי. הפנל הימני מציג מדגם ממוזג של בסיס הנתונים. לחץ על החצים שמאלה / ימינה כדי לעבור בין תמונות שונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצמת סף: בחר ערך סף מתאים לזהות בערך מנות הסלולריות (ולא רקע, אזורי noncellular) של תמונות. סף precalculated ידי PhenoRipper, אבל יכול להיות מותאם כדי לשפר את ההדגשה של אזורים הסלולריים באמצעות פס הגלילה נגיש בחלק העליון של התמונה. אם סף בחר לא עובד בכל התמונות, להוריד את הסף כך שיכלול אזורי noncellular ולא יורדים אזורים סלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלוק Size: בחר בגודל מתאים לחסום (בפיקסלים) לרשת את התמונה. בלוקים של גודל שצוין יהיו על גבי התמונה. להתאים את גודל בלוק כדי להשיג ממוצע של 20-30 בלוקים / תא. כדי להרכיב את הרשת מעל קליק התמונה על תיבת הסימון מול השדה &quot;גודל הבלוק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים אופציונליים: אם תמונות בקנה מידה האוטומטית לא להציג סמנים עם עוצמות יחסי רצויים (למשל צבע אחד רווי) או אם סמנים צריכים להיות ירד מהניתוח, השתמשו באפשרות &quot;להתאים את עוצמת ערוץ&quot;. כדי לזהות אזורים סלולריים על קבוצת משנה של סמנים להשתמש &quot;ערוצים המשמשים לסף&quot; אפשרות. אפשרויות ברירת מחדל של פרמטרים אחרים הן בדרך כלל נאותות, אבל אם נדרשו, התאימו אותם באמצעות &quot;ניתוח מתקדם אפשרויות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הניתוח על ידי לחיצה על &quot;PhenoRip&quot; בלוח היישום הראשי. PhenoRipper יזהה באופן אוטומטי סוגים חוזרים בלוק בתמונות. פרופילים פנוטיפי יופקו עבורכל תמונה המבוססת על שברים מהסוגים השונים בגוש זה. </li></ol> 3. תוצאות היכרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקור את יחסי הגומלין בין הפרופילים פנוטיפי של התמונות באמצעות PhenoBrowser (איור 1). ממשק PhenoBrowser מורכב מארבעה פנלים: הפנל השמאלי העליון הוא ייצוג גרפי (עלילת פיזור) של הדמיון היחסי בין תמונות / תנאים שונים, שני פנלים בתמונות מימין מדגם תצוגה של תנאים שנבחרו, והפנל הסופי (תרשים בר ) משווה פרופילים פנוטיפי שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;בטל מסגרות ריקות&quot; שימוש בתפריט &quot;עיבוד נתונים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תמונות באיכות ירודה: ראשית, ללמוד תמונות בודדות לבטל את הקיבוץ מהתפריט &quot;עיבוד נתונים&quot;. לאחר מכן, לחץ בנקודות החריגות בעלילת הפיזור ולהשליך תמונות באיכות נמוכות (לדוגמא, מחוץ לפוקוס, חפץ צביעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חקור את הנתונים: החלט שמטה מגדיר שדהיחידה בסיסית של השוואה (למשל כדי להשוות תרופות, תמונות עם אותו הערך של השדה מטה &quot;תרופה&quot; צריכים להיות מקובצים יחד). כווץ את כל התמונות עם אותו הערך של שדה זה metadata לנקודת נתונים יחיד עם &quot;קיבוץ לפי&quot;. לדוגמא, קיבוץ לפי תרופה יהיה בממוצע התמונות בתוך כל תרופה להניב נקודה אחת לכל תרופה. נקודות סמוכות (או רחוקות) בעלילת הפיזור משקפות תנאים שיעוררו פנוטיפים סלולריים דומים (או שונים). נקודות צבע או תווית (תפריט תצוגת נתונים) המבוסס על מטה זמין כדי לסייע interpretability. עלילת 3D היא rotatable על ידי לחיצה על תיבת הסימון &quot;rotatable&quot; ועל ידי לחיצה על הכפתור השמאלי וגרירת העכבר מעליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שתי נקודות שונות כדי להשוות אותם ישירות. פנלי התמונה יציגו תמונות לדוגמא עבור כל נקודה, ופנל תרשים העמודות יציג את הסוגים לחסום תדרי התרחשותם שונים ביותר בין שתי נקודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את גlustergram מ&quot; תפריט Clustergram &quot;כדי לספק מבט גלובלי יותר של מערכת היחסים בין סוגי אבן ותנאי ניסוי. על ידי קיבוץ שני סוגי הבלוק ותנאים, ייצוג זה מדגיש את פנוטיפים הסלולריים בצורה הטובה ביותר להבחין בין קבוצות של תנאים (איור 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

זרימת העבודה המתוארת כאן מאפשרת אפיון והשוואה של תמונות מיקרוסקופיה מהירים וקל. אנחנו הראשונים הוכיחו עד כמה זרימת עבודה זו יכולה לעזור אופטימיזציה של ניסוי, למשל על ידי ביצוע בקרת איכות במהירות בתמונות במיקרוסקופ. בשלב בא, שהראינו את הפוטנציאל שלה לניתוח נתונים הק?...

במהלך העשור האחרון, התקדמות מהירה בטכנולוגיית הדמיה נתנו מעבדות רבות את היכולת לבצע מיקרוסקופיה תפוקה גבוהה. האתגר כעת עבר מאחד לאחד של הדמיה של ניתוח. איך אנחנו יכולים לאפיין, להשוות, ולחקור את סיקור של פנוטיפים אך עדינים מורכבים שנוצרו על ידי מסך הדמיה תפוקה גבוהה טיפוסי? מספר פלטפורמות דימוי ניתוח ואינפורמטיקה נתן ארגזי כלים מתוחכמים משתמשי 1-3 לחילוץ מידע ביולוגי מאוספים גדולה של תמונות. עם זאת, רבי מכשולים משמעותיים להישאר בניתוח נתונים ממסכים מבוסס תמונת תפוקה גבוהה. קשיים כרוכים בבחירת אפיונים מתאימים של התמונות וכוונון עדין של פרמטרים אלגוריתמיים (למערכת של עניין) לעתים קרובות לגרום להתקנה פעמים רבות, במיוחד עבור משתמשים ללא מומחיות דימוי ניתוח. בפרט, פילוח תא, התהליך של זיהוי תאים בודדים בתמונת n, היא צוואר בקבוק עיקרי בעניין זה. פילוח יכול להיות רגיש מאוד לפרמטרים ניסיוניים כגון סוג תא, צפיפות תאים וביו סמנים, ולעתים קרובות דורש התאמה חוזרת ונשנית לערכת נתונים גדולה. מסיבות אלה, ניתוח תמונה הוא לעתים קרובות צעד עצמאי, מסוף שבוצע על ידי מומחים ולא חלק משולב של זרימת העבודה הניסיונית. זה מונע את מחזור המשוב המהיר בין הניתוח וניסוי, חלק חיוני של פיתוח assay. כאן אנו מתארים זרימת עבודה חלופית כי הוא מותאם למיקרוסקופ פלואורסצנטי תפוקה גבוהה ומונעת הרבה מהקשיים האמורים לעיל. לשם כך, אנו עושים שימוש 4 PhenoRipper, פלטפורמת תוכנה בקוד פתוח לחיפוש וניתוח של תמונות מיקרוסקופ מהירים. באופן משמעותי, PhenoRipper נמנע רבים מהאתגרים כרוכים בפילוח תא על ידי לא מנסה לזהות תאים בודדים. במקום זאת, PhenoRipper מחלק תמונות לתוך פיקסלבלוקים של גודל subcellular ומאפיינים את הדמויות במונחים של בלוקים שהם מכילים. באופן ספציפי, PhenoRipper פרופילי לוקים במונחים של-מבוסס colocalization סמן תכונות ומזהה באופן אוטומטי 4 הסוגים לחסום הנציג ביותר בתמונות אימונים. PhenoRipper לאחר מכן מקצה לכל בלוק סוג בלוק נציג הדומה ביותר, ולבסוף מאפיין תמונות המבוססות על סוגים בלוקים שהם מכילים. בהשוואה ליותר יחידה מבוסס תאי גישות מסורתיות, גישה זו דורשת כוונון עדין ומומחיות מינימאליים. ככזה, משתמשים רק צריכים להגדיר שני פרמטרים: גודל הבלוק ועוצמת סף (להשליך חלקי noncellular של תמונה), אשר שניהם נקבעים עם משוב גרפי. חשוב מכך, זרימת העבודה שתוארה כאן הוכח 4 בקנה מידה בקלות לערכות נתונים גדולים בהרבה, שבו המהירות והכוונון עדין מינימאלי מספקת זמן גדול ורווחי אמינות. בפועל, אנו מוצאים כי יישום זהמקק מפחית את הזמן הנדרש הן להתקנה ולהפעלתו על ידי צווים שונים של גודל 4. התפוקה העיקרית של PhenoRipper היא ייצוג חזותי של דמיון תמונה, המאפשרת למשתמש לזהות קבוצות של תנאי ניסוי שגורמים לתאים להציג פנוטיפים דומים. יש הקבוצות PhenoRipper מוצאת בדרך כלל &quot;interpretability ביולוגי&quot; דומה לאלה שנוצרו על ידי יותר, שיטות מבוססות תאי זמן רב 4. בפועל, זה אומר כי לעתים קרובות, בתוך חצי שעה של ביצוע ניסוי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 96 היטב טיפוסי, הנסיין ללא ניסיון דימוי ניתוח לפני יכול לקבל קריאת נתונים אמינות לגבי הביצועים של הניסוי שלו או שלה. הנסיין אז יכול להתחיל לחקור את יחסי הגומלין בין תנאי ניסוי שונים ומתייחס ליחסים אלה פנוטיפים תמונה. אנו מדגימים זרימת עבודה זו לכאן על ידי ניתוח ההשפעותשל תרופות בכיתות מכניסטית מובחנות בתאי הלה מוכתמים עבור סמני DNA וcytoskeletal. תמונות של תאים שטופלו באותה הכיתה של תרופות קובצו יחד, ותמונות באיכות ירודה (חפצים מכתים, מתוך תאי מיקוד וכן הלאה) הופיעו כחריגים, מה שהופך אותם קלים לזהות ואפשרות למחוק. בעוד זרימת עבודה זו היא שימושית עבור מספר רב של מבחני המבוסס על תמונה, יש מצבים רבים שבם בבירור בגישה שונה עלולה להיות יותר אינפורמטיבי. לדוגמא, הפלט מPhenoRipper הוא בעיקר השוואה היחסית של דפוסי הקרינה על פני תנאי ניסוי. אם אפיון מוחלט של תכונת תא בודדת ספציפית נדרש במקום (לדוגמא מספר הכתמים בתא), יידרש-מבוסס תא בודד ניתוח. עם זאת, גם בסוג זה של מצב, PhenoRipper עשוי לזהות שינויים בפנוטיפים תא בודד האלה, ולכן להיות כלי שימושי עבור opti assaymization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

למרות התקדמות מהירה במיקרוסקופיה תפוקה גבוהה, מבחני מבוססי תמונת כמותית עדיין להוות אתגר משמעותי. בעוד מגוון רחב של כלים לניתוח תמונה מיוחדים זמין, רוב זרימות עבודה המבוססת על דימוי ניתוח מסורתי עקומות תלולות למידה (לכוונון עדין של פרמטרים ניתוח) ולגרום לזמני אספקה ​​ארוכים בין ההדמיה וניתוח. בפרט, פילוח תא, התהליך של זיהוי תאים בודדים בתמונה, הוא צוואר בקבוק עיקרי בעניין זה. כאן אנו מציגים חלופי,-ללא פילוח תא זרימת עבודה המבוססת על PhenoRipper, פלטפורמת תוכנה בקוד פתוח המיועדת לניתוח והבדיקה של תמונות מיקרוסקופיה מהירים. הצינור שהוצג כאן הוא מותאם לתמונות מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרביות תאים ודורש התערבות משתמש מינימאלית. תוך חצי שעה, PhenoRipper יכול לנתח נתונים מניסוי 96 היטב טיפוסי וליצור פרופילי תמונה. משתמשים יכוליםאז מבחינה ויזואלית לחקור את הנתונים שלהם, לבצע בקרת איכות בניסוי שלהם, להבטיח תגובה להפרעות וסמנו את שחזור של משכפל. זה מקל על מחזור משוב מהיר בין הניתוח וניסוי, שהוא חיוני במהלך assay אופטימיזציה. פרוטוקול זה שימושי לא רק כניתוח ראשון לעבור לבקרת איכות, אלא גם יכול לשמש כפתרון קצה לקצה, במיוחד להקרנה. זרימת העבודה המתוארת כאן מאזניים לערכות נתונים גדולים כמו אלה שנוצרו על ידי מסכי תפוקה גבוהה, והוכחה תנאי ניסוי קבוצה על ידי פנוטיפ מדויק על פני טווח רחב של מערכות ביולוגיות. ממשק PhenoBrowser מספק מסגרת אינטואיטיבי כדי לחקור את חלל פנוטיפי ומתייחס מאפייני תמונה להסברים ביולוגיים. יחדיו, הפרוטוקול המתואר כאן יוריד את החסמים לאימוץ ניתוח כמותי של מסכי מבוססי תמונה.

כאן אנו בדקנו את היכולת של זרימת עבודה זו לסמים קבוצה המבוססת על מנגנון הפעולה שלהם. תאי הלה היו זורעים ב30 בארות של צלחת 384 גם ומוכתם עבור ה-DNA / אקטין / α-טובולין. הנוגדנים הספציפיים הראשוניים, נוגדנים משני fluorescently שכותרתו, וכתמי ניאון אחרים שהיו בשימוש מפורטים בטבלה של ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

כאן אנו מתארים זרימת עבודה עבור מהירות ניתוח ולחקור את האוספים של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות PhenoRipper, פלטפורמת דימוי ניתוח שפותחה לאחרונה.

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

rapid-analysis-and-exploration-of-fluorescence-microscopy-images

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  UT Southwestern Medical Center.  כאן אנו מתארים זרימת עבודה עבור מהירות ניתוח ולחקור את האוספים של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות PhenoRipper, פלטפורמת דימוי ניתוח שפותחה לאחרונה. 

Video: Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These processes are characterized by the gradual appearance of essential structures in the megakaryocyte cytoplasm such as a polyploid and polylobulated nucleus, an internal membrane network called demarcation membrane system (DMS) and the dense and alpha granules that will be found in circulating platelets. In this article, we describe a standardized protocol for the in situ ultrastructural study of murine megakaryocytes using transmission electron microscopy (TEM), allowing for the identification of key characteristics defining their maturation stage and cellular density in the bone marrow. Bone marrows are flushed, fixed, dehydrated in ethanol, embedded in plastic resin, and mounted for generating cross-sections. Semi-thin and thin sections are prepared for histological and TEM observations, respectively. This method can be used for any bone marrow cell, in any EM facility and has the advantage of using small sample sizes allowing for the combination of several imaging approaches on the same mouse.

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Here, we present a protocol to analyze ultrastructure of the megakaryocytes in situ using transmission electron microscopy (TEM). Murine bone marrows are collected, fixed, embedded in epoxy resin and cut in ultrathin sections. After contrast staining, the bone marrow is observed under a TEM microscope at 120 kV.

בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ranging from solid-state, O2-sensitive coatings to live animal tissue samples stained with soluble O2-sensitive probes. In particular, the nanoparticle-based near-infrared probe NanO2-IR, which is excitable with a 625 nm light-emitting diode (LED) and emits at 760 nm, was used. The imaging system is based on the Timepix3 camera (Tpx3Cam) and the opto-mechanical adaptor, which also houses an image intensifier. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) is commonly required for various studies, but current platforms have limitations in their accuracy, general flexibility, and usability.
The system presented here is a fast and highly sensitive imager, which is built on an integrated optical sensor and readout chip module, Tpx3Cam. It is shown to produce high-intensity phosphorescence signals and stable lifetime values from surface-stained intestinal tissue samples or intraluminally stained fragments of the large intestine and allows the detailed mapping of tissue O2 levels in about 20 s or less. Initial experiments on the imaging of hypoxia in grafted tumors in unconscious animals are also presented. We also describe how the imager can be re-configured for use with O2-sensitive materials based on Pt-porphyrin dyes using a 390 nm LED for the excitation and a bandpass 650 nm filter for emission. Overall, the PLIM imager was found to produce accurate quantitative measurements of lifetime values for the probes used and respective two-dimensional maps of the O2 concentration. It is also useful for the metabolic imaging of ex vivo tissue models and live animals.

This paper describes the use of a new, fast optical imager for the macroscopic photoluminescence lifetime imaging of long decay emitting samples. The integration, image acquisition, and analysis procedures are described, along with the preparation and characterization of the sensor materials for the imaging and the application of the imager in studying biological samples.

Fluorescence Lifetime Macro Imager עבור יישומים ביו-רפואיים

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...