עבודה זו נתמכה על ידי Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) של Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), המשרד הפדרלי לכלכלה וטכנולוגית פרויקט לצים-KF 2727801MD0 והמרכז לכשירות חדשנות - תגובות חיסוניות הומורלית במחל לב וכלי דם ( זיק בטרמפים, BMBF FKZ 03Z2CN12) של המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר, גרמניה. שיכון וניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות של החברה למעבדה בבעלי חי מדע (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) והפדרציה של מעבדה אירופית למדע בעלי חיים אגודים (FELASA).

1. בידוד נוגדנים מדגימות מטופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עמודות המיני immunoadsorption ידי מילוי 3 מ&quot;ל אנטי IgG sepharose לכל 2 מיליליטר מטופל EDTA פלזמה לעמודה ריקה Econo פאק. IgG בידוד דורש לפחות 2 מ&quot;ל של פלזמת חולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח על גבי מסנן אנטי IgG sepharose, חתכת את הקצה התחתון של העמודה ולחץ על המסנן להגיע לקצב זרימה של כ 1 טיפה / שנייה. בואו פתרון השימור הנגמר של העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם 3 כרכים 0.9% NaCl לנפח הפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פלזמה על העמודה. כאשר הפלזמה שקועה לחלוטין באנטי IgG sepharose, לשטוף עם אותו הנפח 0.9% NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח פיפטה 1 פלזמה של 0.2 M HCl גליצין, 2.8 pH על העמוד ובואו לטבול לתוך sepharose. הוסף עוד כרך של גליצין HCl על העמודה. לאסוף את הזרימה דרך בצינור מ&quot;ל 15 ולהתאים את ה-pH ל 7.3 עם 0.5 מ &#39;טריס-HCl, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחדש את העמודה, לשטוף עם 3 הפלזמה כרכים גליצין HCl. לאחר שטיפה סופית עם 2 כרכים 0.9% NaCl, העמודה עשויה לשמש לדגימת הפלזמה הבאה. לחלופין, העמודה יכולה להיות מלאה עם פתרון שימור ואוחסנה ב 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש בcardiomyocytes, שבריר IgG שנאסף צריך להיות דיאליזה נגד מאגר ניסויי (EB). להכנת EB, להוסיף 117 ​​mM NaCl, KCl 2.8 מ&quot;מ, 0.6 המ&quot;מ MgCl 2, 1.2 המ&quot;מ KH 2 4 ת.ד., 1.2 מ&quot;מ CaCl 2, 10 HEPES המ&quot;מ וגלוקוז 20 מ&quot;מ למי 1 ליטר מזוקקים על stirrer מגנטי ולהתאים את ה-pH ל -7.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את שבר IgG לצינור קרום דיאליזת אסתר תאית עם משקל מולקולרי לחתוך של 100 kDa. שים את הצינור בEB 1 ליטר ומערבב לאט עם stirrer מגנטי ב 4 ° C. לאחר שעה 8, להעביר את הצינור לדיאליזת 3 L של EB הטריה ודיאליזה עבור 20 שעות נוספות בשעת 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות דיאליזה, חום המדגם למשך 30 דקות ב 57 מעלות צלזיוס באמבט מים לinactivatגורמים משלים ה. קביעת ריכוז נוגדנים מוחלט ולהכין aliquots המכיל 330 מיקרוגרם IgG כל אחד. כאשר מוסיף את המדגם כדי cardiomyocytes למדידה (שלב 4.3), למלא את aliquots ל1 מ&quot;ל עם EB. aliquots החי ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol> 2. בידוד של cardiomyocytes Rat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת Ca 2 +-חיץ בידוד חופשי (IB), להוסיף 110 המ&quot;מ NaCl, KCl 2.6 מ&quot;מ, 1.2 המ&quot;מ 4 MgSO, 1.2 mM KH 2 4 ת.ד., 20 HEPES המ&quot;מ וגלוקוז 11 מ&quot;מ למים מזוקקים 1 ליטר באמצעות מגנטי stirrer. התאם pH ל -7.4 בטמפרטורת חדר ומסנן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר בקבוק עליון לעיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 80 מ&quot;ל של IB במאגר העליון של מערכת זלוף Langendorff thermostated. התאם את גדרות תרמוסטט כדי לשמור על טמפרטורת חיץ של 37 מעלות צלזיוס ולתחח חיץ עם 95% O 2/5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל כ 10,000 - 12,000 U של collagenase סוג השני, חומצות שומן חופשי BSA 175 מ&quot;ג ומתמוססים ב20 IB מ&quot;ל מכיל 22.5 μl של 100 פתרון mM CaCl 2 מניות. לשלוט על ה-pH של חיץ הבידוד במאגר העליון ולהתאים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את עכברוש Wistar של 175-200 גרם עם thiopental משקל 375 מיקרוגרם / קילו משקל הגוף. הוסף הפארין יחב&quot;ל 2500 לפתרון thiopental. לאחר פתיחת בית החזה, בלו הלב בקפידה עם קשת אב עורקים שלמה ולהעביר אותו לקר כקרח 0.9% NaCl. נקה את הלב מדם והרקמות והעברה לטרי 0.9% NaCl שמסביב. לחשוף את אב העורקים, פתח את מפחית הזרימה של מערכת Langendorff להשיג מהירות יורדת מ2-3/sec ולצרף את הלב לצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנקב את הלב לתקופה של עד 3 דקות בקצב זרימה של 1 טיפה / שניות לשטוף את הדם שנותר. התחל להפיץ את IB במערכת Langendorff. הסר חיץ מ&quot;ל 20 מהמאגר העליון, מלא את פתרון collagenase ולמלא כמה שיותר חיץ כפי שנדרש כדי להגיע ל80 מ&quot;ל. הפץ ג<html> פתרון לollagenase 27 דקות נוספות. קצב זרימה צריך להיות מבוקר תקופתי ומתוחזק בירידת 1 / שניות באמצעות מפחית הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הלב מהצינורית, הנקי מאטרייה ואב עורקים וקוצץ לחתיכות קטנות. אפשר פתרון collagenase לרוץ לתוך המאגר התחתון, להפחית את עוצמת קול למקסימום של 40 מ&quot;ל ועוד יותר לעכל את החדרים הקצוצים עבור 10 - 15 דקות מתחת לאוורור רציף עם 95% O% 2/5 CO 2. לאחר מכן, מסנן את השעית התא דרך גזת 200 מיקרומטר רשת גודל לתוך צינור מ&quot;ל 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור Ca 2 + התוכן של התאים ב3 שלבים: סרכזת השעית תא XG ב 43 עבור 2 דקות בטמפרטורת חדר ותאי resuspend ב 10 המ&quot;ל מכיל 200 IB מיקרומטר CaCl 2. צנטריפוגה שוב וresuspend תאים ב10 המ&quot;ל IB עם 500 מיקרומטר CaCl 2. לאחר צנטריפוגה סופית resuspend cardiomyocytes בEB המסוננת סטרילי (ראה 1.8) לצפיפות של 50,000 תאים / מ&quot;ל. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3.-2 Fura הכתמה של cardiomyocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעייל 4 coverglass קבורים היטב עם laminin 10 מיקרוגרם לטובים ולחכות עד שהוא יתייבש לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 1 מ&quot;ל של השעית cardiomyocyte לכל השימוש micropipette היטב עם קצה חתוך. אפשר התאים לדבוק לשעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 10 μl של 1 מ&quot;ג / המ&quot;ל Fura-02:00 פתרון מנייה בEB 5 מ&quot;ל. שמור את הפתרון המכתים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוריד את החיץ ורווק תאים מcoverglass ו0.5 מיליליטר פיפטה של ​​הפתרון המכתים לכל באר. דגירת התאים למשך 10 דקות ברעידות בינוניות. לאחר מכן, לוקח את הפתרון המכתים, לשטוף תאים פעם אחת עם EB 1 מ&quot;ל ולבסוף למלא EB 0.5 מ&quot;ל לכל באר. הימנע מאור ישיר בתהליך הצביעה ותמיד לשמור על תאים המוכתמים בחושך. </li></ol> 4. הקלטה של קיצור של תא ושל Ca 2 + ארעי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח coverglass נאוטילוס על מ &#39;פלואורסצנטי הפוךicroscope מחובר למערכת הקלטת contractility סידן וmyocyte. מקם אלקטרודה מנהג עשה עם זרם וצינור זרימה בבאר הראשונה. cardiomyocytes Superfuse עם EB 1 מ&quot;ל / דקה ולהתחיל גירוי החשמלי (20 וולט, 1 הרץ, 5 אלפיות משך). לאפשר לתאים להסתגל לגירוי כ 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר cardiomyocyte צורת מוט שלם עם תלמים ברורים והתכווצות מתמדת. מקם את התא במרכז שדה הראייה ולפתוח את ערוץ המצלמה. להתמצא התא אופקי בתחום הווידאו על ידי סיבוב מתאם מסגור התא והתנועה את במת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את קצה איתור רכיבי בקרה של אזור הווידאו (איור 2), לפתוח את ערוץ 10 ולהקליט הניאון - 15 צירים כדי להשיג קיצור התא הראשוני וCa 2 + ארעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את ערוץ מיקרוסקופ האור, כדי למנוע הלבנת כתם פלואורסצנטי. כבה את הזרימה דרך מEB למדגםלעקוף עם שסתום 3-way וcardiomyocytes superfuse עם 1 מ&quot;ל של מטופל נוגדנים. עצור את המשאבה ממש לפני האוויר מגיע גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את ערוץ האור ולהקליט עוד 10-15 צירים כדי לקבל את תגובת התא החריפה. להשהות את ההקלטה ולסגור את ערוץ האור שוב. חזור על הקלטה לאחר 2 ו 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את האלקטרודה של הבאר. נקה את הצינורות ביסודיות עם EB ולהמשיך בבאר הבאה של coverglass נאוטילוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את קיצור התא וCa 2 + ארעי עם תוכנת IonWizard באמצעות &quot;Edge-Length/Length&quot; והחלון &quot;Fura 2-מספריים נגרע / יחס&quot;, בהתאמה. לחשב את אחוז השינוי שחל מהקיצור הראשוני התא וCa 2 + הארעי של גובה השיא התייחס לנקודת ההתחלה (% bl השיא ח) לאקוטי, 2 דקות ותגובת 5 דקות. </li></ol>

<ol>
	<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18 (2011).</li><li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy.">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy.">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602 (2009).</li><li>Felix, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+effects+of+immunoadsorption+and+subsequent+immunoglobulin+substitution+in+dilated+cardiomyopathy:+Three-month+results+from+a+randomized+study.">Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).</li><li>Staudt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+immunoglobulin+G3+subclass+in+dilated+cardiomyopathy:+results+from+protein+A+immunoadsorption.">Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption.</a> Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).</li><li>Nikolaev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorescence+method+for+the+rapid+detection+of+functional+beta1-adrenergic+receptor+autoantibodies+in+heart+failure.">A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+activating+human+beta1-adrenergic+receptors+are+associated+with+reduced+cardiac+function+in+chronic+heart+failure.">Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure.</a> Circulation. 99 (5), 649 (1999).</li><li>Gocayne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+of+rat+cardiac+beta-adrenergic+and+muscarinic+cholinergic+receptors+obtained+by+automated+DNA+sequence+analysis:+further+evidence+for+a+multigene+family.">Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).</li><li>Jaenicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+human+beta-myosin+heavy+chain+gene+and+a+comparative+analysis+of+its+product.">The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product.</a> Genomics. 8 (2), 194 (1990).</li><li>Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+endothelial+cells+remodel+cultured+adult+cardiomyocytes+and+increase+their+survival.">Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival.</a> Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).</li><li>Magnusson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.+Characterization+of+antibodies+against+the+beta+1-adrenoceptor+with+positive+chronotropic+effect.">Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect.</a> Circulation. 89 (6), 2760 (1994).</li><li>Wakefield, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+in+vitro+methods+to+safety+pharmacology.">The application of in vitro methods to safety pharmacology.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).</li><li>Kajzar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+physiological+conditions+for+cell+analyses:+forces+of+heart+muscle+cells+suspended+between+elastic+micropillars.">Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars.</a> Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה הוצגה מציעה דרך מתאימה כדי לזהות נוגדנים עצמיים לבביים יעילים תפקודיים בחולים עם DCM ממוצא לא ברור. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל זיהוי של נוגדנים פעילים נגד פונקציונליים β1-adrenoceptor לפי חשיבותם ברמות cAMP 6, השיטה שלנו אינה תלויה בepitope ספציפי. כמובן שיש מבחני...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב / הציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פתרון Immunosorba שימור </td><td> Fresenius טיפול רפואי </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> סוג collagenase 2 </td><td> מערכת תא </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, חומצות שומן חופשי </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-02:00 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> F0888 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO </td></tr><tr><td> עמודות Econo פאק כרומטוגרפיה </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> ספקטרה / פור יוטק התאי אסתר דיאליזת Membranדואר </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4 גם הקבורים Coverglass </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> סיד Myocyte ומערכת הקלטת contractility </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תוכנת ניתוח IonWizard 6.0 </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes

קרדיומיופתיה המורחבת (DCM) היא האחד הגורמים העיקריים לאי ספיקת לב במבוגרים הצעירים 1. למרות נטייה גנטית וחשיפה לחומרים רעילים ידועות סיבות למחלה זו כבשליש מהחולים, מקורו של DCM נותר במידה רבה בלתי ברור. במספר לא מבוטל של חולים אלה, נוגדנים העצמיים נגד אפיטופים לב שכבר זוהה וחשודים לשחק תפקיד מרכזי בתחילת ההתקדמות של המחלה 2,3. החשיבות של נוגדנים עצמיים לב מודגשת על ידי שיפור המודינאמית נצפה בחולי DCM נטרול נוגדנים עצמיים על ידי immunoadsorption 3-5. מגוון רחב של אנטיגנים ספציפיים כבר זוהה 2,3 ונוגדנים נגד יעדים אלה עשויים להיות מזוהים על ידי immunoassays. עם זאת, המבחנים הללו אינם יכולים להבחין בין הגירוי (ולכן פונקציונליים יעיל) וחסימת נוגדנים עצמיים. יש גובר evidence כי הבחנה זו היא חיוני 6,7. כמו כן, ניתן להניח כי היעדים למספר נוגדני cardiotropic עדיין לא מזוהים ולכן אינו ניתן לגילוי על ידי immunoassays. לכן, הקים שיטה לגילוי נוגדנים תפקודיים פעילים cardiotropic, עצמאיים של אנטיגן החוקי. הרקע לשיטה הוא ההומולוגיה הגבוהה בדרך כלל נצפתה לאזורים פעילים של חלבונים בלב בין יונקים 8,9. הדבר מצביע על כך נוגדני לב הופנו נגד אנטיגנים אנושיים יחצו-מגיבים עם תאי המטרה שאינם בני אדם, המאפשרים בדיקה של נוגדנים מחולי DCM על cardiomyocytes חולדות בוגרות. השיטה שלנו כוללת 3 שלבים: הראשון, IgG מבודד מפלזמת מטופל באמצעות נוגדני sepharose מצמידים אנטי IgG מתקבלים מעמודות immunoadsorption (PlasmaSelect, Teterow, גרמניה). cardiomyocytes שנית, למבוגרים מבודדים על ידי זלוף collagenase במנגנון זלוף Langendorff באמצעות aprotocol שונה מעבודות הקודמות של 10,11. את cardiomyocytes מתקבל מצורפים לcoverglasses הקבורים laminin המצופה ומוכתם בFura-2, צבע פלואורסצנטי סידן סלקטיבית אשר יכולה להיות מובא בקלות לתוך התא כדי לבחון הסידן תוך תאי (Ca 2 +) תוכן 12. בשלב האחרון, ההשפעה של מטופל על IgG קיצור התא וCa 2 + ארעי של cardiomyocytes שדה מגורה מנוטר באופן מקוון באמצעות מערכת ניטור התכווצות (IonOptix, מילטון, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב) סיד myocyte מסחרי ומחובר לניאון הפוך סטנדרטי מיקרוסקופ.

שתי דוגמאות למדידת inotropy הסלולרי בתחום מגורה cardiomyocytes הבוגר (איור 2) באמצעות myocyte Ca + ומערכת הקלטת contractility 2 הם כדלקמן. איור 3 נותן רושם של מדידת שליטה, ואילו באיור 4 ההשפעה של נוגדני cardiodepressive של חולה עם DCM מוצג. <p class="jove_content" style=";text-al...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes at JoVE.com

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

השיטה הוצגה מציעה דרך לזהות נוגדנים עצמיים cardiotropic יעילים פונקציונליים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה המורחבת, ללא קשר לאנטיגן הספציפי, על ידי ניתוח ההשפעה של אימונוגלובולין חולה המבודד בקיצור הסלולר וארעי סידן תאי בcardiomyocytes חולדה המבודדת.

מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

measurement-antibody-effects-on-cellular-function-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Views.  University Medicine Greifswald. השיטה הוצגה מציעה דרך לזהות נוגדנים עצמיים cardiotropic יעילים פונקציונליים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה המורחבת, ללא קשר לאנטיגן הספציפי, על ידי ניתוח ההשפעה של אימונוגלובולין חולה המבודד בקיצור הסלולר וארעי סידן תאי בcardiomyocytes חולדה המבודדת.

Video: Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

מדידה של Cytosolic Ca 2 + ב lymphatics כויץ מבודד

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that may facilitate the development of vaccines and peptide drugs. Peptide scanning is a simple and efficient method that straightforwardly maps the linear epitope recognized by a monoclonal antibody (mAb). Here, the authors present an epitope determination methodology involving serially truncated recombinant proteins, synthetic peptide design, and dot-blot hybridization for the antigenic recognition of nervous necrosis virus coat protein using a neutralizing mAb. This technique relies on the dot-blot hybridization of synthetic peptides and mAbs on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The minimum antigenic region of a viral coat protein recognized by the RG-M56 mAb can be narrowed down by step-by-step trimmed peptide mapping onto a 6-mer peptide epitope. In addition, alanine scanning mutagenesis and residue substitution can be performed to characterize the binding significance of each amino acid residue making up the epitope. The residues flanking the epitope site were found to play critical roles in peptide conformation regulation. The identified epitope peptide may be used to form crystals of epitope peptide-antibody complexes for an x-ray diffraction study and functional competition, or for therapeutics.

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן, מדידה של תפקודי ריאה של קיבעון של הריאה לחקור את ההשפעה של השמנת יתר, חילוף חומרים לקוי על תוצאות ריאתי

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

הערכה של נוגדן מבוססי תרופות השפעות על מח העצם מאתר והפעלה מקרופאג הצפק

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb development since its first report in 1975. As an alternative technology, phage display methods for mAb development are increasingly attractive since Humira, the first phage-derived antibody and one of the best-selling mAbs, was approved for clinical treatment of rheumatoid arthritis in 2002. As a non-animal based mAb development technology, phage display bypasses antigen immunogenicity, humanization, and animal maintenance that are required from traditional hybridoma technology based antibody development. In this protocol, we describe a method for construction of synthetic phage-displayed Fab libraries with diversities of 109-1010 obtainable with a single electroporation. This protocol consists of: 1) high-efficiency electro-competent cell preparation; 2) extraction of uracil-containing single-stranded DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel&#39;s method based oligonucleotide-directed mutagenesis; 4) electroporation and calculation of library size; 5) protein A/L-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for folding and functional diversity evaluation; and 6) DNA sequence analysis of diversity.

This protocol describes a detailed procedure for the construction of a phage-displayed synthetic antibody library with tailored diversity. Synthetic antibodies have broad applications from basic research to disease diagnostics and therapeutics.

בניית Phage סינתטי מוצגת ספריית Fab עם גיוון המותאמים

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...