פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לחוקרים להבשיל hiPSC-CMs מסחריים או מתוצרת בית לפנוטיפ דמוי מבוגר המשפר באופן משמעותי את הערך הניבוי של hiPSC-CMs בבדיקת רעילות לב. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק hiPSC-CMs בוגרים בפורמט תפוקה גבוהה למיפוי אופטי של סידן או שינוי מתח. פרוטוקול זה עשוי לשמש לחקירת מנגנוני מחלה או לבדיקת רעילות לב בתרופות.
מי שידגים את ההליך יהיה ג'פרי קריץ', עמית מחקר מהמעבדה שלי. התחילו בשטיפת הצלחות החוץ-תאיות מעוררות ההתבגרות, או MECM, פעמיים עם 200 מיקרוליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק, או HBSS, שעה אחת לפני ציפוי קרדיומיוציטים. שמור על בארות hydrated.
מעבירים את צינורות הקרדיומיוציטים ממיכל החנקן הנוזלי לייבוש קרח, ומשחררים את הלחץ על ידי פתיחה קלה של מכסי הצינורות. לאחר מכן, לאטום מחדש את כובעי הצינור ולהפשיר אותם באמבט המים במשך 4 דקות. לאחר הפשרת התאים, רססו את הצינורות באתנול 70% לפני פתיחתם.
מעבירים את התאים לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר עם פיפטה של 1 מיליליטר. מוסיפים 1 מיליליטר של ציפוי בינוני לקריוביאל ומעבירים את הכביסה לצינור החרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, לטפטף באיטיות 1 מיליליטר של ציפוי בינוני ולעורר את הצינור.
חזור על זה עד העברת 8 מיליליטר של ציפוי בינוני. צנטריפוגה את צינור 15 מיליליטר ב 300 x גרם במשך 5 דקות ו resuspend את הגלולה ב 1 מיליליטר של מדיום ציפוי. הסר aliquot, ולבצע ספירת תאים חיים עם hemocytometer לפני הוספת מדיום ציפוי כדי לקבל 7.5 x 10 לתאים 5 למיליליטר.
מוציאים 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת 96 באר מצופה MECM באמצעות פיפטה רב ערוצית, ודגרים על התאים במשך יומיים. לאחר מכן, להחליף את המדיום עם 200 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה, ולשמור על הצלחות במשך 7 ימים, עם שינוי של מדיום ביום 5. ביום השביעי, בצע EP assay, כמתואר בטקסט.
הקפד לשנות את המדיום כל יומיים כאשר בוחרים להרחיב את תרבית התא. כדי לטהר hiPSC-CM באמצעות מיון תאים המופעל על ידי מגנטית, או MACS, שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו את התאים עם מיליליטר אחד של HBSS-לאחר מכן, נתקו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטי, או EDTA, ודגרה על התאים למשך 10 דקות. לאחר מכן, נטרל את הטריפסין/EDTA על ידי שליחה מחדש וסינגולריזציה של התאים עם 2 מיליליטר של מדיום ציפוי.
מתוך שש הבארות, לאסוף את התאים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר באמצעות מסננת 70 מיקרומטר. לאחר שטיפת המסננת עם 3 מיליליטר של ציפוי בינוני, לספור את התאים. לאחר הספירה, צנטריפוגה ושטפו את גלולת התא עם 2 מיליליטר של חיץ הפרדת MACS קר כקרח לפני הגלולה ושליחה מחדש של התאים ב 80 מיקרוליטר של חיץ הפרדת MACS קר לכל 5 x 10 לתאים 6.
מוסיפים 20 מיקרוליטר של קוקטייל דלדול קר שאינו קרדיומיוציטים ומערבבים את התרחיף לפני הדגירה על קרח במשך 10 דקות. לאחר שטיפת התאים עם 4 מיליליטר של חיץ הפרדת MACS קר ב 300 x גרם במשך 5 דקות, להשעות מחדש את הגלולה ב 80 מיקרוליטר של חיץ הפרדת MACS קר. הוסף 20 מיקרוליטר של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין קרות לכל 5 x 10 לתאים השישיים, וערבב בעדינות את תרחיף התאים לפני הדגירה על קרח במשך 10 דקות.
בזמן הדגירה, מקמו את עמודות הדלדול החיובי המצוידות במסנני קדם-הפרדה של 30 מיקרומטר על מפריד MACS, והניחו את צינורות האיסוף המסומנים של 15 מיליליטר מתחת לעמודים. לאחר מכן, הפריימו כל עמודה עם 3 מיליליטר של מאגר הפרדת MACS קר. ערבבו את תרחיף התאים שטופל בנוגדנים עם 2 מיליליטר של מאגר הפרדת MACS והוסיפו אותו לעמודה.
הוסף 2 מיליליטר של חיץ הפרדת MACS לכל עמודה ואסוף 12 מיליליטר של השעיית קרדיומיוציטים זורמים. צנטריפוגות את הקרדיומיוציטים ומשליכים את הסופרנאטנט לפני השעיית הקרדיומיוציטים בתווך ציפוי של 1 מיליליטר. כדי לקבוע את הריכוז, ספור את התאים והתאם את הנפח לצפיפות הזריעה הרצויה לפני ציפוי תאי קרדיומיוציטים מטוהרים על לוחות MECM 96-well.
שאפו והחליפו את מדיום תחזוקת הקרדיומיוציטים ב-100 מיקרוליטר צבעים רגישים למתח, או VSD, או פלואורופורים רגישים לסידן, או CSF, לכל באר של צלחת 96 בארות. לאחר 30 דקות של דגירה, להחליף את הצבעים עם מדיום הבדיקה או HBSS. אזן את התאים ב- 37 מעלות צלזיוס לפני קבלת מיפוי אופטי של נתונים בסיסיים באמצעות התקן מיפוי אופטי בעל תפוקה גבוהה.
כדי לטפל בתאים עם תרופות לבדיקת חשיפה חריפה או למפות את התאים החשופים באופן כרוני לתרופות מעניינות, לדלל את התרופות בדימתיל סולפוקסיד, או DMSO, ולאחסן אותם כתמיסות מלאי ב 20 מעלות צלזיוס לפני דילול אותם HBSS לריכוזים הרצויים. לבדיקת רעילות לב בצלחות של 96 בארות, יש להוסיף ארבע מנות של תרכובת עם לפחות שמונה בארות בכל מנה. השתמש במינונים הנעים מלמטה ומעלה ריכוז הפלזמה הטיפולית היעילה מבחינה קלינית, כולל המינון היעיל.
בדומה למדידות האלקטרופיזיולוגיות הבסיסיות לפני יישום תרופות, לכוד רישומי אלקטרופיזיולוגיה לפחות 30 דקות לאחר הטיפול התרופתי במחקרים כרוניים. לאחר הקלטות בסיסיות, יש למרוח לפחות ארבע מנות של כל תרופה על חד-שכבות hiPSC-CMs בוגרות המבטאות GCaMP6m, עם לפחות שמונה בארות למנה. אזנו את התרופות על התאים למשך 30 דקות, וחממו את התאים ל -37 מעלות צלזיוס לפני ובמהלך איסוף הנתונים.
לאחר רישומים בסיסיים של צלחת שלמה, הוסף איזופרוטרנול ננו-מולארי לכל באר כדי לאפשר נתוני תגובה חזקים לתרופות ולכמת את ההשפעות של איזופרוטרנול על קצב פעימות חד-שכבתיות, משרעת התכווצות ומשך מעבר הסידן. כדי לקבל נתוני מיפוי אופטיים, פתח את המגירה הקדמית ומקם את הצלחת על מחמם הצלחות. לאחר פתיחת תוכנת הרכישה וקביעת מיקום שמירת הקבצים בתוכנה, בחר משך זמן של 10 עד 30 שניות וקצב פריימים של רכישה לקבלת רזולוציה זמנית גבוהה יותר, ולחץ על התחל רכישה.
פתח את תוכנת הניתוח ובכרטיסייה ייבוא מסנן, בחר אתר קובץ בודד או פרוס מרובים כדי לבנות מחדש לוחית. בחר את הקבצים והזן מספר שורות ועמודות ובחר אוטומטי. לאחר מכן, בחר עדכן גודל פיקסל, הזן מרחק לפיקסל והשתמש באשף הבארות כדי לקבוע את מיקום הבארות בתמונה לפני לחיצה על עבד שמירה ומעבר לכרטיסייה הבאה.
פתח את החזר ההשקעה, או את הכרטיסיה אזורי עניין, ובחר לצייר את החזר ההשקעה באופן ידני, אוטומטי, או לא להשתמש בהחזר השקעה כלל, אשר ייחשב לניתוח הצלחת כולה. לאחר בחירת האזור בבאר, לחץ על תהליך שמירה כפתור כדי לעבור לשלב הבא. סמן את התיבות הסתר בארות והצג רק מסוננים כדי להציג באופן חזותי את החזר ההשקעה.
פתח את הכרטיסיה ניתוח, בחר כל באר או החזר השקעה כדי לאשר את הדיוק של זיהוי פעימות אוטומטי. הוסף או הסר פעימות מהעקבות על-ידי בחירת פעימה בודדת והקשה על Delete בלוח המקשים. לאחר שתסיים, לחץ על שמור.
לאחר מכן, לחץ על לוח זמן-מרחב לחצן בכרטיסיה ניתוח והוסף את הקו כדי לקבוע את התוויית זמן-מרחב כדי להציג נתונים באופן חזותי עבור כל באר או החזר ההשקעה. לאחר בחירת קו אופקי או אנכי, לחץ על צור עלילה. לאחר הבטחת זיהוי הפעימות המדויק, המשך אל יצוא הכרטיסייה ובחר פורמט קובץ, הזן סטטיסטיקת פעימות אפשרות לפני לחיצה על יצא.
לאחר הייצוא, פתח קבצי נתונים והפעל את שגרת הניתוח הסטטיסטי שנבחרה. הדמיית ניגודיות פאזה הראתה כי hiPSC-CMs המצופים על MECM התבגרו ונבדלו מבנית מאותה אצווה של hiPSC-CMs שצופו מחדש ב- ECM של העכבר. תאים בוגרים הפכו לצורת מוט, בעוד שתאים לא בוגרים שמרו על צורה מעגלית.
קרדיומיוציטים מוכתמים בנוגדני אלפא-אקטינין הראו את הצורה האופיינית של התאים בתרבית בכל מצב ECM. בהתאם לצביעת ה-TnI, צביעת האלפא-אקטינין הצביעה על כך שה-hiPSC-CMs שהבשילו על ה-MECM קידמו פנוטיפ בוגר בצורת מוט וגרמו לארגון סרקומר גדול יותר. התוכן והפעילות של המיטוכונדריה היו שונים בין תאים שגודלו בתרבית בעכבר ECM ו-MECM.
הנתונים האלקטרופיזיולוגיים של פוטנציאלי פעולה שתועדו באמצעות VSD ומערכת המיפוי האופטי הראו כי לתאים הספציפיים לפרוזדורים יש קצב פעימות ספונטני מהיר משמעותית ומשך פוטנציאל פעולה קצר יותר, או APD80, מאשר התאים הספציפיים לחדר. מפות חום של צלחת שלמה עבור פרמטרים כגון APD80 חשפו את יכולת השחזור של פרמטר נתון בתוך לוחית. פוטנציאלי פעולה אופייניים של חד-שכבות hiPSC-CM בוגרות הצביעו על מורפולוגיית פוטנציאל הפעולה של קרדיומיוציטים בוגרים מבודדים ונבדקים.
כמו כן הוצג קצב ספונטני אופייני של פוטנציאל פעולה. בתגובה לאיזופרוטרנול, הפעלת קולטני בטא-1-אדרנרגי גרמה לכרונוטרופיה חיובית, אינוטרופיה חיובית ולוזיטרופיה חיובית. תגובת HiPSC-CM לגן אנושי הקשור לאתר, או hERG, חוסם תעלות, כולל E-4031, דומפרידון, ונדטניב וסוטלול, נחקרה באמצעות GCaMP6m סידן פלואורסצנטי לניטור קצב.
המחקר הראה זיהוי של לאחר דפולריזציה מוקדמת שנגרמה על ידי חסימת ערוץ E-4031 hERG. עבדו מהר עם התאים בתרחיף והימנעו מלחץ גזירה על ידי צנרת תאים בעדינות. בנוסף, בצע שינוי מדיה בזהירות כדי למנוע נזק לסינכרון hiPS.
לאחר הליך זה, התאים ניתנים לאיסוף חלבונים, רנ"א, דנ"א ושומנים לצורך ניתוח בטכניקה המועדפת על החוקרים. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לחקור מחלות ולבדוק רעילות לבבית של תרופות חדשות באמצעות קרדיומיוציטים דמויי מבוגרים.
