심혈관 질환의 체액 면역 응답 (-이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)의 Sonderforschungsbereich Transregio 19 일 (SFB/TR19, C2), 경제 및 기술 프로젝트 ZIM - KF 2727801MD0 연방 교육부 및 혁신 능력의 센터에 의해 지원되었다 ZIK - 하이킹, 교육 및 연구, 독일 연방 교육부의 BMBF FKZ 03Z2CN12). 동물과 주택과 실험은 유럽 연구소 동물 과학 협회 (FELASA)의 연구실 동물 과학 (Gesellschaft 털 Versuchstierkunde, GV-SOLAS)와 제휴를위한 학회의 권고에 따라 수행되었다.

1. 환자 샘플에서 IgG 절연 <ol><li> 빈 Econo 팩 칼럼으로 두 ML 환자의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 플라즈마 당 3 ML 항 IgG 세 파로스를 작성하여 미니 immunoadsorption 항목을 준비합니다. IgG 격리는 환자 플라즈마의 최소한 2 ML이 필요합니다. </li><li> 반 IgG 세 파로스 상단에 필터를 넣고, 열 아래 팁을 열고 잘라 약 1 방울 / 초의 유량에 도달 할 필터를 누르십시오. 열이 부족 보존 솔루션을 보자. </li><li> 3 권 플라즈마의 볼륨 당 NaCl 0.9 %로 열을 씻으십시오. </li><li> 열에서 플라즈마를 피펫. 플라즈마 완전히 반 IgG 세 파로스에 몰두했을 때, 같은 볼륨 0.9 % NaCl로 씻는다. </li><li> 피펫 한 플라즈마 열에서 0.2 M 글리신 HCL, pH를 2.8의 볼륨과 세 파로스로 잠그다 보자. 열에 글리신 HCL의 또 다른 볼륨을 추가합니다. 15 ML 관을 통해 흐름을 수집하여 0.5 M 트리스 - HCL, pH를 8.0로 7.3으로 산도를 조정합니다. </li><li> 열을 생성하려면3 플라즈마 볼륨 글리신 HCL을 씻는다. 2 권 0.9 % NaCl로 최종 세척 후, 열은 다음 플라즈마 샘플에 사용할 수 있습니다. ° C 최대 4 주까지 8 - 또는 열이 보존 솔루션으로 가득과 4에 저장할 수 있습니다. </li><li> cardiomyocytes에서 사용하기 위해, 수집 된 IgG 분획은 실험 버퍼 (EB)에 대해 dialyzed해야합니다. EB의 준비를 들어, 117 MM NaCl, 2.8 MM KCl, 0.6 MM MgCl 2, 1.2 MM KH 2 PO 4, 1.2 MM CaCl 2, 10 밀리미터 HEPES 및 자기 교반기에 20 밀리미터 포도당 1 L 증류수로 추가하고 pH를 조정 7.3 있습니다. </li><li> 100 kDa의 차단 분자량과 셀룰로오스 에스테르 투석 막 관에 IgG의 일부를 입력합니다. 1 L의 EB에 튜브를 넣고, 4에서 자기 교반기로 천천히 저어 ° C. 8 시간 후, 신선한 EB 3 L로 투석 튜브를 전송하고 4시에 또 다른 20 시간을위한 dialyze ° C. </li><li> inactivat 할 수있는 물 욕조에 57시 30 분 ° C에 대한 투석, 열에게 샘플을 따라전자 보완 요소. 총 IgG 농도를 결정 및 330 μg IgG 각을 포함하는 aliquots를 준비합니다. 측정 (단계 4.3)에 대한 cardiomyocytes에 샘플을 추가 할 때, EB 1 ML에 aliquots를 입력합니다. Undiluted aliquots는 더 이상 사용 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 쥐 Cardiomyocytes의 절연 <ol><li> 칼슘 2 + 무료 절연 버퍼 (IB)의 준비를 들어, 110 MM NaCl, 2.6 MM KCl, 1.2 MM MgSO 4, 1.2 MM KH 2 PO 4, 20 밀리미터 HEPES과 자기를 사용하여 1 L 증류수 11 으 포도당을 추가 교반기. 살균을위한 0.2 μm 병 톱 필터를 통해 실내 온도 및 필터에서 7.4로 산도를 조정합니다. </li><li> thermostated Langendorff 재관류 시스템의 상부 저수지에서 IB의 80 ML을 입력합니다. 37 ° C의 버퍼 온도를 유지하고 95% O 5분의 2 % 30 분에 CO 2와 버퍼를 폭기하는 온도 설정을 조정합니다. </li><li> 약 10,000 무게 - collag의 12,000 U를enase 유형 II, 175 MG 지방산 무료 BSA하고 100 MM CaCl 2 재고 솔루션의 22.5 μl를 포함하는 20 ML IB에 용해. 상단 저장소의 절연 버퍼의 pH를 제어하고 필요한 경우 조정합니다. </li><li> 375 μg / kg 체중의 thiopental 200 G - 175의 Wistar 쥐를 마취시키다. thiopental 솔루션에 2,500 IU의 헤파린을 추가합니다. 그대로 대동맥 활과주의 깊게 thoracotomy, 소비세 마음에와 얼음처럼 차가운 0.9 % NaCl로 전송. 혈액의 마음과 주변 조직과 신선한 0.9 % NaCl로 전송를 청소합니다. 대동맥을 노출, 2-3/sec의 하락 속도를 얻고 캐뉼라에 마음을 첨부 Langendorff 시스템의 흐름 감속기를 엽니 다. </li><li> 까지 남은 피를 씻어 한 방울 / 초의 유량과 3 분에 대한 마음을 Perfuse. Langendorff 시스템의 IB를 순환하기 시작한다. 상부 저수지부터 20 ML 버퍼를 제거 등의 80 ML에 도달하는 데 필요한 많은 버퍼로 collagenase 솔루션과 리필 입력합니다. C를 순환<html> 또 다른 27 분에 ollagenase 솔루션입니다. 유량은 흐름 감속기를 사용하여 한 방울 / 초에서 정기적으로 관리 및 유지 관리해야합니다. </li><li> 심방과 대동맥에서 깨끗한 캐뉼라의 마음을, 이탈 작은 조각으로 썰어. collagenase 솔루션은 낮은 저수지로 실행하도록 허용, 40 ML의 최대 볼륨을 줄이고 더 10 다진 심실을 소화 % - 95 % O가 5분의 2 %의 CO 2 연속 폭기에서 15 분. 그 후 50 ML 튜브에 200 μm의 메쉬 크기 거즈를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. </li><li> 200 μM에게 CaCl 2를 포함하는 10 ML의 IB의 객실 온도와 resuspend 세포에서 2 분에 43 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기 : 3 단계에서 세포의 칼슘 2 + 내용을 복원합니다. 다시 원심 분리기, 500 μM CaCl 2 10 ML IB에서 셀을 resuspend. 최종 원심 분리 50,000 세포 / ML의 밀도에 살균 필터 EB의 cardiomyocytes을 (1.8 참조) resuspend 후. </li></ol>Cardiomyocytes의 &quot;&gt; 3 e_title. Fura-2 염색법 <ol><li> 코트 10 μg의 당 잘 laminin과 완전히 건조 될 때까지 기다리과 4 잘 쏠 수 coverglass. </li><li> 각이 잘 커팅 팁과 micropipette를 사용하여에 cardiomyocyte 정지 1 ML을 입력합니다. 세포가 실온에서 1 시간에 준수 할 수 있습니다. </li><li> 10 일 MG / ML의 μl Fura-2 5 ML의 EB의 주식 솔루션입니다.를 희석 어둠 속에서 착색 솔루션세요. </li><li> coverglass 각도에 착색 솔루션의 피펫 0.5 ML의 버퍼와 무소속의 세포를 벗어. 적당한 흔들림에 따라 10 분에 세포를 배양. 그 후, 착색 솔루션을 벗고 일 ML의 EB를 한 번 세포를 씻어 마지막으로 각도에 0.5 ML의 EB를 채 웁니다. 착색 과정에서 직접 빛을 방지하고 항상 어둠 속에서 스테인드 세포를 유지. </li></ol> 4. 셀 단축 및 CA 2 + 과도의 기록 <ol><li> 역 형광의 m에 쏠의 coverglass를 삽입icroscope는 myocyte 칼슘, 수축성 기록 시스템에 연결되어 있습니다. 물론 처음에 유입 및 유출 관과 맞춤 제작 전극을 배치합니다. 1 ML / 분 EB와 (20 V, 1 Hz에서, 5 밀리 초 시간) 전기 자극을 시작으로 Superfuse cardiomyocytes. 세포가 약 2 분의 자극에 적응 할 수 있도록 허용합니다. </li><li> 분명 결 지속적인 수축과 손상로드 모양의 cardiomyocyte를 선택합니다. 시야의 중심에있는 셀을 위치와 카메라 채널을 엽니 다. 셀 프레임 어댑터를 회전하고 현미경 단계를 이동하여 비디오 영역에서 수평으로 셀을 일정한 방향으로 향하게. </li><li> 초기 셀 단축 및 CA 2 + 과도를 얻기 위해 15 수축 - 가장자리가 동영상 영역의 제어 요소 (그림 2)을 검출 조정, 형광 채널과 기록이 10여십시오. </li><li> 형광 얼룩의 표백 방지하기 위해 현미경 광 채널을 닫습니다. 샘플로 EB에서을 통해 흐름을 전환환자 IgG 1 ML과 3 방향 밸브 및 superfuse의 cardiomyocytes으로 우회. 공기가 잘 도달 전에 펌프를 중지합니다. </li><li> 빛 채널을 열고 또 다른 10 기록 - 급성 세포 응답을 얻기 위해 15 수축합니다. 녹화를 일시 중지하고 다시 조명 채널을 닫습니다. 이 후 녹음 및 5 분 반복합니다. </li><li> 우물의 전극을보십시오. EB와 철저하게 튜브를 청소하고 쏠 수의 coverglass의 다음 잘를 계속합니다. </li><li> 각각 세포 단축 및 CA 2 + &#39;Edge-Length/Length &quot;를 사용하여 IonWizard 소프트웨어와 과도하고&quot;fura 2 숫자는 / 비율을 뺀&#39;창을 분석합니다. 초기 셀 단축 및 CA 2 + 급성의 기준 (BL %에서 최대 H)에 언급 된 피크 높이의 과도, 2 분, 5 분 응답에서 변경 률을 계산합니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

제시 방법은 불분명 출신 DCM 환자에서 기능적으로 효과적인 심장 autoantibodies를 감지 할 수있는 적절한 방법을 제공합니다. 다른 방법에 비해, 캠프 레벨 6에 미치는 영향에 의해 β1-adrenoceptor에 대한 기능을 활성화 항체의 검출을 예를 들어, 우리의 방법은 특정 에피토프의 독립적입니다. 물론 문학에 설명 된 다른 에피토프 독립 assays는 IE 패치 클램프 기술 또는 절연 Purkinje ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Immunosorba 보존 솔루션 </td><td> Fresenius 의료 </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase 2 형 </td><td> 셀 시스템 </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, 지방산 무료 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F0888 </td><td> DMSO 1 MG / ML </td></tr><tr><td> Econo 팩 크로마토 그래피 열 </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> 스펙트럼 / 포 바이오 셀룰로오스 에스터 투석 Membran전자 </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 네 잘 쏠 수 Coverglass </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> Myocyte 칼슘과 수축성 기록 시스템 </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard 6.0 분석 소프트웨어 </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes

확장 성 심근증 (DCM)은 젊은 성인 1 심장 마비의 주요 원인 중 하나입니다. 독성 물질에 대한 유전 처분 및 박람회가 환자의 약 셋째에서이 질병에 대한 원인을 알려져 있지만, DCM의 출처는 대부분 불분명 남아 있습니다. 이 환자의 상당수에서 심장 epitopes에 대한 autoantibodies가 감지되었으며 질병 2,3의 발병과 진행에 중요한 역할을 의심하고 있습니다. 심장 autoantibodies의 중요성은 immunoadsorption 3-5로 autoantibodies의 제거 후 DCM 환자에서 관찰 hemodynamic 개선에서 빨간 밑줄이 있습니다. 특정 항원의 다양한 이미 2,3를 확인하고 있으며 이러한 목표에 대한 항체가 immunoassays에 의해 검출 될 수있다. 그러나, 이러한 assays은 자극 (및 따라서 기능적 효과)와 autoantibodies을 차단 구별 할 수 없습니다. eviden 명이 증가이 구별이 중요한 6,7입니다 CE. 또한 cardiotropic 항체의 수에 대한 목표는 여전히 미확인이며, 따라서 immunoassays에 의해 감지 할 수 있다고 가정 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 각각의 항원과는 독립적 기능 활성화 cardiotropic 항체의 검출하는 방법을 설립했습니다. 방법의 배경은 일반적으로 포유 동물 8,9 사이에 심장 단백질의 기능 영역에 대한 관찰 높은 호몰 로지입니다. 이 인간의 항원에 대한 감독이 심장 항체 성인 쥐 cardiomyocytes에 DCM 환자에서 IgG의 테스트를 할 수 있습니다 이외의 인간 대상 세포와 함께 상호 반응 제안한다. 우리의 방법은 3 단계로 구성 : 첫 번째는 IgG는 immunoadsorption 열 (PlasmaSelect, Teterow, 독일)에서 얻은 세 파로스 결합 항 IgG 항체를 사용하는 환자의 혈장에서 분리됩니다. 둘째, 성인 cardiomyocytes는 AP를 사용하여 Langendorff 재관류 장치에 collagenase 재관류에 의해 고립되어rotocol은 이전 작품에서 10,11을 수정했습니다. 획득 cardiomyocytes는 laminin 코팅 쏠의 coverglasses에 부착 Fura-2, 쉽게 (CA 2 +) 내용 12 세포 내 칼슘을 관찰하는 셀에 반입 할 수있는 칼슘 선택성 형광 염료를 물들입니다. 마지막 단계에서, 세포 단축 및 CA 2 환자 IgG의 효과 + 필드에 자극을 cardiomyocytes의 과도는 표준 역 형광등에 연결된 상업 myocyte 칼슘, 수축성 모니터링 시스템 (IonOptix, 밀튼, MA, USA)를 사용하여 온라인으로 감시하고 있습니다 현미경.

분야에서 세포 inotropy의 측정을위한 두 예제는 아래에 myocyte 칼슘 2 + 및 수축성 기록 시스템을 사용하여 성인 cardiomyocytes을 (그림 2) 자극. 그림 3은 제어 측정의 인상을줍니다, 그림 4에있는 동안 cardiodepressive 항체의 효과 있는 환자의 DCM가 표시됩니다. 에서 두 예, 초기 세포 단축 및 CA 2 + EB있는 superfusion 동안 과도은 분석...

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Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

제시 방법은 절연 쥐 cardiomyocytes의 휴대폰 단축하고 세포 내 칼슘 과도에 절연 환자의 면역 글로불린의 영향을 분석하여, 관계없이 특정 항원의, 확장 성 심근증 환자의 혈장에 기능을 효과적으로 cardiotropic autoantibodies를 감지 할 수있는 방법을 제공합니다.

절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

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11.8K 조회수.  University Medicine Greifswald. 제시 방법은 절연 쥐 cardiomyocytes의 휴대폰 단축하고 세포 내 칼슘 과도에 절연 환자의 면역 글로불린의 영향을 분석하여, 관계없이 특정 항원의, 확장 성 심근증 환자의 혈장에 기능을 효과적으로 cardiotropic autoantibodies를 감지 할 수있는 방법을 제공합니다.