Name: subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye
Uploaded: 2012-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

מחקר כדי למנוע עיוורון; סיוע ניסויי מטקיוקי נגסאקי; מחקר זה תואם את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזותי. KJW נתמך על ידי מענקי NIH 5T32EY013933 ו5T32DK007647-20. VBM נתמך על ידי מענק NIH K08EY020530.

1. להרכיב מכשירים להזרקת subretinal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש או לבצע מחט קוטר 100 מיקרומטר מצינור נימי זכוכית. ניתן לעשות זאת באופן ידני באמצעות חולץ סאטר P-97 pipet או ציוד דומה אחר. קצה צינורית הנימים יהיה מחומם ומשך עד שהוא מגיע לקוטר הרצוי (100 מיקרומטר). מחט קוטר קטנה יותר יכולה לשמש לוקטורים בריפוי גנטי, אך זה הוא הקוטר המומלץ להזרקת תאים ללא פגיעה בתאים או בעיניים. בהשוואה למחטי פלדה, מחט נימי הזכוכית יש קצה דק מאוד, אבל בוטה, כדי לאפשר הדמיה של נוזל ההזרקה וגישה למרחב subretinal מבלי לגרום לשבירה של רשתית. נקה המחטים נשלפו האלה במידת הצורך באמצעות אתנול 70%, ולאחסן במכל סטרילי. צלחת 15 סנטימטר סטרילי רקמת תרבות עם קלטת להחזיק את המחטים במקום היא דרך אחת שבי לשמור את מחטי הזרקה ומכוסות בסביבת סטרילית. בשלב זה, Complete ההגדרה בתוך חדר הניתוח שבו ההליך יתקיים. זה קל ביותר לשמור על כל הציוד בחדר הניתוח בכל העת על מנת שזה יישאר סטרילי, במיוחד אם הליך זה נעשה בתוך מתקן מכשול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב סיליקון לתוך המזרק ולהוציא סיליקון לעזוב ציפוי לאורך הקירות הפנימיים של המחט. ציפוי סיליקון מגדיל את המעבר של תאים ווירוסים דרך קדח המחט, שאחרת להיצמד לקירות נימי הזכוכית הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג כ 8 סנטימטר אורך צינור פלסטיק סטרילית על ידי חיתוך 25 איסוף דם ¾ מד להגדיר עם נעילת luer בנקודה ישירות לאחר המחט (מוציא את המחט מהצינור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 1 26 מיליליטר מזרק תת ש 5/8-gauge להחליק עצה עם תמיסת מלח סטרילית ולהוציא את המחט מהמזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מחט הזריקה לסוף הקיצוץ של צינורות הפלסטיק ולצרף את המזרק לluer הנעילה בקצה השניהסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב סליין סטרילית, כדי למלא את השטח המת במחט הצינורות ונימים, ולהוציא קצת מלחים דרך המחט על מנת להבטיח שהוא מחובר כראוי ללא כל דליפה. בשלב הבא, לשאוב קטן כ 1 סכום, μl של אוויר, בקצה מחט הזריקה. זה יהיה להפריד מליח מנוזל ההזרקה ולספק רמז חזותי יציין את סוף נוזל ההזרקה בהליך כירורגי. מנגנון ההזרקה יש לשמור על משטח נקי ונגב אותה עם 70% אתנול בהליך כירורגי. בנוסף, כל הציוד המשמש במהלך ההליך כירורגי יש לנקות לפני ואחרי עם אתנול 70%, לחריג של מחטי הזרקה שכבר יש להקפיד לקיים סטרילית ומוכן לשימוש. מחטים אלו צריכות להיות מסולקות לאחר ניתוח, ולא שימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לשאוב פתרון זריקה המכיל את הווקטור הרצוי הארוז הריפוי הגנטי הנגיפי או תאי גזע. ניתן לעשות זאת על ידילוקח את הזריקה לפתרון קצה pipet סטרילי, אז pipetting הפתרון על פני השטח של צלחת תרבות תא סטרילי. הפתרון עכשיו עלול להישאף בקלות לתוך מחט הזריקה באמצעות המזרק. הסכום הדרוש משתנה בהתאם לגילו של העכבר. למטרות שלנו אנו משתמשים 5 עכברי יום שלאחר לידה, שיהיה ניתן להזריק עם 0.5-0.8 μl של נוזל הזרקה. כמויות קטנות יותר, 0.5 μl או פחות, ניתן להשתמש בם לעכברים צעירים וסכומים גדולים יותר, כמו μl 1, יכולות לשמש לעכברים בוגרים. כייל הנגיף או מספר תאים צריך להיות נקבע על בסיס הווירוס / תאים שהוזרקו ורקמות היעד הרצוי שלהם, כמו גם רבים חלקיקים נגיפיים או תאים בנפח קטן יכולים להוביל לרעילות לתאי הרשתית. בסרטון, למטרות המחשה, יש לנו להשתמש 1.5 μl, כמות גדולה יותר של צבע מהצורך להזריק לתוך העין. </li></ol> 2. גישת חלל subretinal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך חדר ניתוח סטרילי,לייצב או להרדים את העכבר על פי הפרוטוקול שאושר באופן מקומי חית הטיפול, המשתנה בהתאם לגילו של העכבר. הרדמה משותפת לעכברים בוגרים כוללת שימוש בגז isoflurane או הזרקה תוך הצפק ממשקל גוף של 0.1 ml/10g קטמין (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל) וxylazine (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) בסליין סטרילי. לעכברים סביב לידה, טכניקות הרדמה נפוצות כוללות שימוש בגז isoflurane או cryoanesthesia (היפותרמיה). כל טכניקות ההרדמה חייבות להיות מאושרות על ידי הוועדה המקומית IACUC לפני השימוש. אנו משתמשים בדרך כלל ביום שלאחר הלידה (P) 5 עכברים, למרות שניתן ליישם טכניקות דומות לעכברים צעירים כמו P0 או לעכברים בוגרים. ההליך כירורגי לא יכול להתחיל עד שהעכבר הפסיק להזיז את הגפיים וכבר לא מגיב לכף רגל וצביטות. לעכברים סביב לידה, הם יהפכו לקלים יותר במידה ניכרת מאז צבע זרימת הדם תהיה להאט, מפתח נוסף לידיעה כי הם תחת הרדמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעכברים סביב לידה, השתמש Vannas מספריים ישרים למ &#39;AKE חתך משוער 1.5 מ&quot;מ לאורך סדק המכסה הסגור. היזהר לחתוך בכניסה, שבו העין באופן טבעי לפתוח בעתיד. הדבר מבטיח שהעפעפיים יהיו לרפא ולפתוח כראוי במהלך ההתפתחות של העכבר. להב כירורגים יכול לשמש למטרה זו, למרות שאנחנו מעדיפים מספרי Vannas שכן הם מפחיתים את הסיכון לניקוב העין במהלך הליך זה. בסרטון, את המספריים שמשו ישירות לנקב וחתך לאורך שולי העפעף. כאשר לומדים את הטכניקה הזו, יש להשתמש במלקחיים כדי להרים את העפעף לפני החיתוך ולהפחית את הסיכון לפגיעה בעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את העפעפיים עם מלקחי הלבשה מעוקלים לproptose את העין וצובט את העפעפיים מעט מתחת לעין כדי להחזיק אותו proptosed להזרקה. אם חתך המכסה בצע בשלב 2 הוא גדול מדי, העיניים תגלושנה שוב אל מתחת לעפעפיים ולמנוע חשיפה נאותה במהלך הליך ההזרקה. לעכברים בוגרים, תוך הפעלת לחץ קל מסביב לעין עם ד&quot;רessing מלקחיים יכול להחזיק את עיני proptosed להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן או בscleral אחורי לקו המשווה של כדור הארץ על ידי מגרד את פני השטח עם להב microsurgery 15-מעלות. חתך זה צריך להיות גדול מספיק כדי לעבור רק את קצה מחט הזריקה, אבל לא יותר מזה. אם העדיף, מחט קטנה, חד כגון מחט דיקור יכולה לשמש כדי להפוך את החתך הזה לתוך חלל subretinal במקום להב microsurgery. בבעלי חי פיגמנט כהה, חום כהה רקמה-פיגמנט (אפיתל הפיגמנט ברשתית דמה-) תהפוך לגלויה בנקודת החיתוך. בעכברי פיגמנט או לבקן מצית, עט סימון כירורגית יכול להיות מיושם על קצה להב microsurgery להשאיר כתם דיו מציין אתר החתך. אם (זגוגית) refluxes נוזל השקוף מתוך אתר החתך, הלהב הוצב עמוק מדי ונכנס לחלל הזגוגית ווירוס או תאים הטיפוליים יכול להיכנס למקום הזגוגית במהלך זריקה. לvisualizatiעל מטרות, עשו חתך לנקודה זו בוידאו. זה עדיין אפשרי כדי להשלים זריקת subretinal במקרה זה, לעומת זאת היפרדות הרשתית נגרמת על ידי הנוכחות של נוזל הזריקה עלולה לא להחלים באופן מלא בעכבר הזה. לכן, יש להקפיד לחתוך רק את פני השטח החיצוניים של העין ולא דרך הרשתית לפני ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס את מחט הזריקה לאתר החתך ולקדם אותה במקביל לקיר העין החיצוני להיכנס למקום subretinal. קידום קרוב מדי לקיר החיצוני או עמוק מדי בתוך העין תביים את ההזרקה למיקום הלא הנכון. השיטה הטובה ביותר להבין אם המחט היא במיקום הנכון היא לתרגל את הטכניקה. תרגול בעכברים בקלילות פיגמנט או לבקן יכול לעזור לעשות זריקות מדויקות ומדויקות לתוך חלל subretinal. הסיבה לכך היא נוזל המחט והזרקה הוא גלוי בתוך העיניים האלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ קל לבוכנת המזרק ולהיותהזרקת ג&#39;ין של הנוזל הרצוי. אם המחט ממוקמת כראוי בתוך מרחב subretinal, backpressure המתון יורגש. אם המחט היא בזגוגית, יהיה משמעותי פחות backpressure ופוטנציאל כלשהו ריפלוקס נוזלים במהלך הזריקה. אם יש backpressure המשמעותי, החזק את המחט במקום ללפחות 15 שניות נוספות לפני הסרת המחט באיטיות. זה יאפשר לחץ התוך העיני הגבוה לשיווי במקום refluxing וירוס או התאים מוזרק בחזרה את אתר החתך. חלק מהאוויר והמלוח ניתן להזריק לתוך חלל subretinal בשל הלחץ המוגבר הנדרשים במהלך הליך ההזרקה. יש להקפיד שלא לבצע להזריק אוויר או תמיסת מלח, שכן הוא יכול לשטוף את הווירוס או תאים המוזרקים מהעין. אפשר גם לגרום להיפרדות רשתית קבועה מהנוכחות של יותר מדי נוזלים שהוחדרו לתוך חלל subretinal. לצורך ההמחשה, צבע והאוויר עודף הוזרק into מרחב subretinal בוידאו. ניתן לראות בבירור כיצד חלק של הצבע יהיה סמוק בחזרה מתוך חלל subretinal אם יותר מדי מוזרק, אלא גם כיצד בועת האוויר נשארת בתוך מרחב subretinal ולא להיעלם לתוך הזגוגית. זה שמש כדי להדגיש כי הזריקות האלה היו במסגרת את המיקום הנכון של העין, כך שאפשר לדמיין איך המחט צריכה להיכנס לאתר החתך. כל הזריקות לתוך חלל subretinal לגרום היפרדות רשתית זמנית בשל הנוכחות של נוזל ההזרקה. אם הליך ההזרקה הושלם כראוי, היפרדות רשתית זמנית זה תהיה לרפא בתוך 24 שעות ועכברים יכולים לשמש לכל ניסויים נוספים. העין עשויה להישאר רכה למשך כשבוע בשל ההליך כירורגי, ולכן הזרקה שנייה יש להימנע בתקופה זו של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכברים ילודים, להשתמש במלקחי ההלבשה המעוקלים בעדינות לדחוף את העין מאחורי המכסים ולמסלול. זה עשוי להיות שימושילהמתין לרגע כדי לאפשר לווירוס להתיישב בתוך מרחב subretinal ולא לגרום לו להיות סמוק מתוך אתר החתך כאשר דחף בעדינות את העין חזרה למסלולו. לאחר ניתוח, ירידה של 0.5% bupivacaine אחד (marcaine) דוללה ל -0.25% בסליין סטרילי ממחט 25-מד יכול להיות ממוקמת באזור ההזרקה. עכברים לא מראים סימנים גלויים של מצוקה לאחר ניתוח subretinal והשימוש בbupivacaine כמשכך כאבים מקומי ארוך טווח היה מספיק לשלוש השנים הקודמות. עכברים תמיד צריכים להיות במעקב אחרי ההליך כירורגי כדי לחפש סימנים של מצוקה; כגון זיהום, נפיחות או ירידה בפעילות היומית הרגילה של העכבר. אם אלה מתרחשים, הווטרינר יש להודיע ​​ותרופות לשיכוך כאבים נוספות כגון עצירות (0.05 מ&quot;ג / ק&quot;ג) יכולות להינתן כזריקת intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעיר את העכבר מהרדמה על פי פרוטוקול טיפול בעלי חיים אושר באופן מקומי. העכבר צריך להיות כל זמן בעמ חימוםמודעה כדי לשמור על טמפרטורת גוף תקינה כפי שהוא מתעורר מההרדמה. הניתוח צריך לקחת פחות מחמש דקות עד לסיום, לא סופר את הזמן לעכבר כדי לעבור הרדמה. לכן, כרית חימום אין צורך בהליך בפועל, אך ייתכן שיהיה צורך בעוד אחד לומד טכניקה כמו ההליך יכול לקחת משך הזמן ארוך יותר. העכבר לא צריך להיות ממוקם בחזרה לכלוב נקי עד שהחל לנוע בכוחות עצמו. לילודים, צובט בוהן עדין יעזור להם להתאושש מן ההרדמה, והם צריכים להחזיר את הצבע ותנועתם הוורודים לפני שיוצב בחזרה עם האם. עכברים צריכים להיות במעקב לאורך זמן עבור כל סימנים של מצוקה, כמפורט לעיל. </li></ol>

<ol>
	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טכניקת וידאו זה מספקת הוראות השלמת ההליך כירורגי הזרקת subretinal בהצלחה, ולהבטיח שוקטור הריפוי הגנטי או תאי גזע ממוקם במיקום הנחוץ יעילות לטיפול במחלה העינים. טכניקה זו מאפשרת למיקוד של תאי רשתית כגון רשתית או קולטני אור, שכן הוא מציב את וקטורי הריפוי הגנטיים או רקמות של...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> קטלוג </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 0.8-1.10 Tube x 100 מ&quot;מ נימים (זכוכית) </td><td> קימבל זכוכית, Inc </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / בראון micropipette פולר </td><td> מכשיר סאטר </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge יכול לשמש במקום. קטלוג # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> SL2-25ML </td><td> סיליקון </td></tr><tr><td> פוספט של Dubecco נאגר מלוח עם סידן כלוריד ומגנזיום כלוריד </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> בטיחות-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; סט דם אוסף </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 המ&quot;ל Sub-Q 26מזרק 5/8G מתלבש טיפ </td><td> קיטון דיקינסון- </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5-10 Pipetter Finnpipette השני μl מתכוונן נפח </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 טיפים משופעים טבעיים μl </td><td> ארה&quot;ב מדעית, Inc </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 מיקרוסקופ סטריאו </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 מ&quot;מ x דיש תא התרבות פוליסטירן מטפל בסגנון 15 מ&quot;מ </td><td> קורנינג Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> מספרי סטרייט Vannas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> מלקחי הלבשה מעוקלים עם serrations העדין </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> סכין Microsurgery תואר 15 </td><td> Wilsברפואת העיניים קורפ </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> קטמין </td><td> Ketaset III </td><td> נדא # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> מעבדות לויד </td><td> נדא # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaine (Marcaine) </td><td> חברת AstraZeneca </td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td> עצירות </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

אובדן הראייה משפיע על כ -3.4 מיליון בני אדם בארצות הברית והוא צפוי לגדול בשנים הקרובות. 1 לאחרונה, ריפוי גנטי והשתלות תאי גזע הפכו לכולים טיפוליים מרכזיים לטיפול בעיוורון כתוצאה ממחל ניווניות של רשתית. ישנם מספר סוגים של השתלה עצמית לניוון מקולרי גיל (AMD), כגון השתלת תאי אפיתל קשתית פיגמנט, יצרו תוצאות מעודדות, וניסויים בבני אדם החלו לצורות אחרות של טיפולים בתאי גזע וגנים. 2 אלה כוללים החלפת הגן RPE65 הטיפול בחולים עם amaurosis המולד של Leber והשתלת תאי רשתית באמצעות תאי גזע עוברי אנושיים (ES) במחלת Stargardt. 3-4 עכשיו שקיימים נתיבי ריפוי גנטיים ותאי גזע זמינים לטיפול בחולים עם מחלות רשתית, חשוב לוודא הטיפולים הפוטנציאליים הללו במודלים של בעלי חיים לפני שיחולוing במחקרים בבני אדם. העכבר הפך מודל מדעי חשוב לבדיקת היעילות הטיפולית של וקטורי גן טיפוליים והשתלת תאי גזע בעין. 5-8 במאמר זה וידאו, אנו מציגים טכניקה להזריק וקטורי ריפוי גנטיים או תאי גזע לתוך החלל של subretinal עין העכבר תוך מזעור ניזק לרקמות שמסביב.

ציור של עין העכבר מוצג עם מבנים הגדולים שכותרתו לעיון, עם חצים המציגים את המיקומים לפעולות כירורגיות הזרקה הן זגוגית וsubretinal (ראשי חץ, איור 1). וקטורי גן טיפולי, כגון lacZ lentiviral וקטור (איור 2), ניתן להזריק באמצעות מקומות אלה. בנוסף, תאי גזע, כגון תאי עכ...

Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

33.1K Views.  Columbia University. טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

Video: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biology

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal<i&gt; דרך</i&gt; בגישה אחורית Transcleral

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית העכבר הרזולוציה על קוליים כדי לסייע הזרקה תוך-עיני במחקר ריפוי גנטי ברשתית

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

השתלה טרנס-סקלרלית מונחית אישונים של שתלים תת-רשתית במודל עכבר ניוון רשתית

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...