המחברים מבקשים להודות לליזה Dailey לתשומות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (ES013611 וHL095163), דיילת מכון מחקר רפואי (FAMRI), והסוכנות להגנת הסביבה (CR83346301) ומצהירה שאין ניגוד העניינים. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. למרות שהמחקר המתואר במאמר זה כבר מומן בחלקו על ידי המשרד להגנת הסביבה בארה&quot;ב דרך CR83346301 הסכם שיתוף פעולה עם המרכז לרפואה סביבתית, אסטמה וביולוגיה ריאות באוניברסיטת צפון קרוליינה, צ&#39;אפל היל, זה לא היה נתון ל סוכנות עמיתים הנדרשים וביקורת מדיניות, ולכן אינו בהכרח משקף את הדעות של הסוכנות, ואין אישור רשמי צריכה להיות מוסקת. להזכיר oשמות המסחריים f או מוצרים מסחריים אינו מהווים אישור או המלצה לשימוש. לורטה Müller נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע השוויצרי עם מענק אישי.

1. הכן את כלי פלסטיק: צלחת מעיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת PureCol 500 μl (1:100 דילול עם מים סטריליים) היטב בכל צלחת 12 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C בחממה במשך 30 דקות, להסיר את PureCol ולשטוף עם זכות HBSS לפני התאים מתווספים לצלחת (ראה שלב 3.1 בהמשך). </li></ol> 2. קבלת וpretreating ביופסיה של NECs האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביופסיה לגרד באף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ECs השטחי המצפה את האף turbinates תחת חזון ישיר באמצעות ספקולום 9 מ&quot;מ לשימוש חוזר באף פוליפרופילן (דגם 22009) באוטוסקופ הפעלה עם ספקולום (דגם 21700). מכשיר זה מספק להדמיה אופטימלית של turbinates והגמישות של תנועה באף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ביופסיות בנושא יושב זקוף בכיסא בגב ישר עם הראש מוטה לאחור מעט או שוכב בתנוחת פרקדן על שולחן בדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את ספקולום Otoscope לתוך הנחיר וturbi הנחותיםנייט דמיינו עם תאורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מגרד תרמופלסטיים סטרילי דרך ספקולום עם הקצה הרחיב distally לחלק האחורי של חלזוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בלחץ עדין על פני השטח הנחות של חלזוני, המגרד נמשך על פני 5x המשטח הרירי וחזר בו. שליפה מוצלחת של תאים הריריים שנערכו על ידי פעולת נימים תהיה ניכרה בכוס המגרד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח לדוגמא בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של RPMI 1640, תחבורה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי לאחזר את הבדיקה, לסלק רקמה מחללית קרנף עם טפטפת P-1000, לבטל בדיקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה לגלולה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), לשאוב supernatant (תשומת לב: היזהר שלא לשאוב את הכדור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר BEGM עם 10 μl של 100x DNase 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), לא לשאוב supernatant! </li></ol> 3. Seed על התאים בפלסטיק (יום 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PureCol מהצלחת ולשטוף עם HBSS (ראה גם צעד 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מינימאלי של BEGM + + תקשורת (80-100 μl, עד המניסקוס של תקשורת מופיע במרכז גם) ל1-4 בארות (תלוי בגודל ביופסיה) של הצלחת המצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה P-1000 להסיר בזהירות את גלולה של רקמת הביופסיה מהצינור, בלי הנשיפה יותר מדי תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הכדור לאמצע הבארות, לשמור יחד הביופסיה כמו מקבץ של תאים, ולא לשבור את לעשות השעיה תא בודדת. תשואות ביופסיה טובות עד 4 בארות שניתן זורעים. שים את הצלחת לתוך תרבות רקמות חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2,&gt; 90% לחות יחסית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק לאחר שעות כדי להבטיח שיש מספיק מדיה (מבלי להפריע את המניסקוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Day1, 24 שעות לאחר זריעה: לאסוף את כל התאים שאינם חסיד של כל הבארות (צלחת הטיה ולאסוף תקשורת עם תאים בP-1000, גollect כל הבארות בצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צנטריפוגה השעיה תא: להוסיף כ -250 μl של BEGM + + ו250 μl של תערובת מדיה BEGM + לתאים שנזרעו ביום: 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.5 לתאים שאינם חסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2-5: שינוי בתקשורת של התאים יומיים; להוסיף 500 תקשורת μl היטב כל אחד, להפחית את כמות BEGM + + בשלבים תקשורת (יום 2 לאחר זריעה: 125 μl BEGM + + בתוספת 375 μl BEGM +, Day3 לאחר זריעת והימים הבאים: 73 μl + תוספת + 427 μl BEGM + BEGM). </li></ol> 4. הרחבת התאים בצלוחיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקוב אחר תאים יומיים; ברגע שהם הגיעו confluency 80-90% (בדרך כלל 5-7 ימים לאחר הביופסיה, אם הם ייקחו זמן רב יותר שהם לא יגדלו בהצלחה) תאי מעלית כבא: תקשורת לשאוב בזהירות; להוסיף 500 μl של טריפסין 0.25% לכל טוב, לשמור אותם על 37 מעלות צלזיוס עד התאים מנותקים (זה בדרך כלל לוקח 2-3 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הצורךed נפח של סויה שעועית טריפסין מונעי (SBTI) (750 μl לכל 1 מיליליטר טריפסין) בצינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסלק תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה שוב ושוב את פתרון טריפסין; תאים מנותקים העברה בצינור חרוטי 15 מיליליטר עם SBTI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כל הבארות בסך 1 מיליליטר HBSS, להוסיף HBSS לצינור עם התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה לגלולה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), לשאוב את התקשורת, resuspend ב 1 מיליליטר BEGM + תקשורת ומערבולת הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב את התאים בבקבוק T25 או T75 תלוי בגודל גלולה (זה P1; כשתי בארות מחוברות להיכנס לבקבוק T75 אחד, מחוברות אחת גם היא מספיק לT25 אחד, בדרך כלל 2 בארות מחוברות להניב T75 אחד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת BEGM + לצלוחיות (5 מיליליטר כל אחד עבור T75, 3 מיליליטר כל אחד עבור T25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את ההשעיה התא לצלוחיות. העבר את צלוחיות לחממה בתרבית רקמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר בקבוק-זריעה: להוסיף מדיה BEGM + נוספת לצפחה (3 מיליליטר לT25, 10 מיליליטר לT75). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><strong&gt; לשמור על התאים בצלוחיות: הסר תקשורת (לשאוב מהפינה) ולהוסיף BEGM + תקשורת (5 ml/T25, 20 ml/T75). התקשורת צריכה להיות שונה בכל 2-3 ימים. לשמור על התאים בבקבוק עד שהם% ומחוברות על 80 (confluency לא יכול להיות אפילו לאורך כל הבקבוק; בדרך כלל זה לוקח בין 7-10 ימים, ואם הם לא מחוברות לאחר 10 ימים שהם לא יגדלו בהצלחה). </li></ol> 5. זרע על התאים ברקמות תרבות מוסיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהבקבוק ולהוסיף טריפסין (3 מיליליטר לT25, 4 מיליליטר לבקבוק T75). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד התאים מנותקים (כ 2-3 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן SBTI (750 μl לכל 1 מיליליטר טריפסין&gt; 2.25 מיליליטר לT25, 3 מיליליטר לT75) בצינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסלק תאים על ידי מקליט את הבקבוק וpipetting למעלה ולמטה ולהעביר לצינור חרוטי עם SBTI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הבקבוק עם HBSS (1 מיליליטר לT25, 2 מיליליטר לT75), מוסיף את HBSS לצינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזתלגלולה (4 ° C, 400 XG, 5 דקות), להסיר supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הצלחות: להחליט כמה צלחות הולכים להיות seeded, לתייג את הצלחות עם דוגמאות קוד ומספר, מספר קטע (כלומר P2) ותאריך. הוסף 700 BEGM + תקשורת μl לתא הבסיסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר תקשורת BEGM ALI ידי vortexing הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים עם hemocytometer (T25 בדרך כלל מייצר כ -4 מיליון תאים; T75 יכול לקבל עד 20 מיליון תאים בהתאם לאיון; להשתמש 1-2 מיליון של תאים לצלחת 12 גם אחד) ולדלל את ההשעיה התא עם תקשורת BEGM ALI לסך הנפח הדרוש לכמות של צלחות שיש זרע (1.2 x 10 6 תאים ב2.5 מיליליטר תקשורת לכל צלחת) (הערה:. אם חלק מהתאים רוצה להיות קפוא, לתייג את הצינור ולהסיר תאים כאן: אנחנו בדרך כלל להקפיא 2 x 10 6 תאים ב2 מיליליטר של הקפאת תקשורת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 השעיה תא μl לצד הפסגה של כל תא 12well קורנינג ללא ציפויהכנס (&gt; זה יהיה על 80,000-150,000 תאים / הוספה; 12 transwells מ&quot;מ עם 0.4 מיקרומטר פוליאסטר הנקבובית (terephthalate פוליאתילן (PET)) להוסיף קרום); להעביר לתוך חממה בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשנות את תקשורת הפסגה (200 בינוני הרחבת μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על תרביות תאים: שנה את התקשורת (מדיה BEGM ALI; 700 μl basolateral ו200 פסגת μl) בכל יום אחר. מוסיף צריכה להישמר שקוע במים עד התאים ומחוברות לחלוטין (אין חורים בmonolayer נראים לעין). בהתאם למספר תא זה בדרך כלל לוקח בין 2-6 ימים, אם זה לוקח יותר זמן התאים סביר להניח שלא יהיו בת קיימא. </li></ol> 6. להקים אוויר נוזלי ממשק ברגע שהתאים לחלוטין מחוברות (כאשר התאים בTranswells לחלוטין מחוברות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים הם מחוברות לחלוטין להחליף גם תקשורת הפסגה וbasolateral עם תקשורת BEGM ALI בתוספת חומצה רטינואית 500nm ל48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר הוספת החומצה הרטינואית בתוספת תקשורת BEGM ALI: הכן PneumaCult-ALI תחזוקה בינונית (הוראות היצרן הבא): חישוב נפח בינוני צורך (לצלחת אחת בדרך כלל 8.5 מיליליטר לתאים הבזליים), להוסיף לכל 1 מיליליטר PneumaCult בסיס בינוני מלא : מוסף תחזוקת 100x PneumaCult 10 μl 2 μl הפרין (של פתרון מניות 2 מ&quot;ג / מיליליטר) 5 μl הידרוקורטיזון (של פתרון מניות 96 μl / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל התקשורת ולהוסיף 700 μl תקשורת תחזוקת PneumaCult-ALI לצד basolateral בלבד (ללא בינוני בצד הקודקוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרביות תאים במשך 4 שבועות בALI: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את התקשורת בכל יום אחר (יום שני, רביעי ושישי בלוח זמנים עובד היטב עבורנו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבוע אחד בALI, פעם בשבוע (ימי רביעי) משטח הפסגה הוא שטף: להוסיף 200 μl HBSS לצד הפסגה, לשמור אותם ל10 דקות בחממה, לשאוב בזהירותHBSS (השתמש 9 בפיפטה זכוכית מחוברת למלכודת האבק בארון הבטיחות הביולוגית, השתמש 200 טיפים μl על קצה פיפטה כדי לשאוב את HBSS). </li></ol></li></ol> הערה: טיפים שינוי בין לוחות, כמו גם לשנות את הטיפים כשהולכים ממשטח הפסגה לעומת basolateral. לאחר כ -2 שבועות בALI, תאים מתחילים להתמיין וcilia מופיע. תרביות תאים להגיע לבידול מלא לאחר כ -4 שבועות בALI.

<ol>
	<li>Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+decision+makers:+in+search+of+the+'epimmunome.">Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome.</a> Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses.">The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).</li><li>Muller, L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cells,+the+"switchboard"+of+respiratory+immune+defense+responses:+Effects+of+air+pollutants.">Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants.</a> Swiss Med. Wkly. , (2012).</li><li>Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+epithelial+cells+in+innate+immunity+to+influenza+virus+infection.">Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection.</a> Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).</li><li>Robertson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+biology+of+natural+killer+cells.">Role of chemokines in the biology of natural killer cells.</a> J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).</li><li>Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cytokines+on+human+bronchial+epithelial+cells+induced+by+influenza+virus.">Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus.</a> A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).</li><li>Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+are+expressed+on+stressed+human+airway+epithelial+cells.">NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costimulation+of+CD8alphabeta+T+cells+by+NKG2D+via+engagement+by+MIC+induced+on+virus-infected+cells.">Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells.</a> Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).</li><li>Obeidy, P., Sharland, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands.">NKG2D and its ligands.</a> Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).</li><li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Cells+From+Smokers+Modify+Dendritic+Cell+Responses+in+the+Context+of+Influenza+Infection+1.">Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1.</a> Am. J. Resp. Cell. , (2010).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+exposed+epithelial+cells+modify+co-cultured+natural+killer+cells.">Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells.</a> AJP Lung. , (2013).</li><li>Turi, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+activates+anion+exchange+protein+2+and+AP-1+in+airway+epithelial+cells.">Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).</li><li>Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+effects+of+antibacterials+on+human+Bronchial+epithelial+cells.">Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells.</a> Respir. Res. 10, 89 (2009).</li><li>Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cultures+of+human+airway+epithelium+from+nasal+scrapings+and+bronchial+brushings.">Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).</li><li>Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+differentiation+of+serially+passaged+normal+human+tracheobronchial+epithelial+cells.">Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).</li><li>Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Chamber+System+for+Maintaining+Differentiated+Guinea-Pig+Respiratory+Epithelial-Cells+between+Air+and+Liquid-Phases.">A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases.</a> Biotechniques. 5, 462 (1987).</li><li>Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biphasic+chamber+system+for+maintaining+polarity+of+differentiation+of+cultured+respiratory+tract+epithelial+cells.">A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).</li><li>Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+expression+of+IRF7+in+nasal+epithelial+cells+from+smokers+after+infection+with+influenza.">Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+exposed+epithelial+cells+modify+cocultured+natural+killer+cells.">Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).</li><li>Ochs, M., Weibel, E. R., Fishmanetal, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. 4, 23-69 (2008).</li><li>Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+Ozone+Modulates+Human+Airway+Protease/Antiprotease+Balance+Contributing+to+Increased+Influenza+A+Infection.">Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection.</a> PLoS ONE. 7, e35108 (2012).</li><li>Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+enhances+influenza+virus+infections+in+respiratory+epithelial+cells.">Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells.</a> Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).</li><li>Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+IL-8+expression+and+transcription+factor+binding+in+respiratory+epithelial+cells.">Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+grass+pollen+exposure.">Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure.</a> Eur. Respir. J. , (2012).</li><li>Bauer, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+enhances+caspase-1+in+bronchial+epithelial+cells+from+asthmatic+volunteers+and+is+associated+with+pathogenesis.">Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).</li><li>Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+stimulates+accumulation+of+gas+phase+nitric+oxide+in+differentiated+cultures+of+normal+and+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cells.">Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells.</a> Lung. 190, 563-571 (2012).</li><li>Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+microRNA+expression+in+human+airway+cells+by+diesel+exhaust+particles+is+linked+to+tumorigenesis-associated+pathways.">Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways.</a> Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).</li><li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Attenuated+Influenza+Virus+(LAIV)+induces+different+mucosal+T+cell+function+in+nonsmokers+and+smokers.">Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers.</a> Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).</li><li>Horvath, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lavage+natural+killer+cell+function+is+suppressed+in+smokers+after+live+attenuated+influenza+virus.">Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus.</a> Respir. Res. 12, 102 (2011).</li><li>Noah, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke+exposure+and+altered+nasal+responses+to+live+attenuated+influenza+virus.">Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus.</a> Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ECs הנשימה לספק לא רק מכשול פיזי כדי להגן על גוף האדם מפני גירויים אקסוגניים 20, אלא גם לפעול כמרכזייה ליזום ולווסת את תגובות הגנה חיסונית בדרכי הנשימה 1-3 באמצעות הפרשה של מתווכים מסיסים או תאי תאי אינטראקציות רצפטור ליגנד ישירים. כדי ללמוד עוד יותר את תפקיד?...

מטרה של הטכניקה תאי אפיתל (ECs) בדרכי הנשימה הם בין האתרים הראשונים שנחשפו באופן ישיר ללחץ סביבתי בשאיפה, כגון פתוגנים, אלרגנים או מזהמי אוויר. ECs יותר ממכשול מבני: הם מתנהגים כמו מרכזייה ליזום ולווסת את התגובה החיסונית בדרכי הנשימה 1-3 באמצעות השחרור של מתווכים מסיסים 4-6 ואת הביטוי של ליגנד / קולטנים על surfac 7-9. בעוד שניתן להשתמש שורות תאים הנציחו כמודלים ללמוד ECs נשימה במבחנה, הם אינם מצליחים להתמיין לאוכלוסיות תאים הטרוגנית מורכבות מריסים מקוטבים ותאי ריר ייצור, בדומה למה שרואה בגוף חי. כדי לשחזר מאפיינים חשובים של אפיתל הנשימה נצפה in vivo, ניתן להשתמש ECs דרכי הנשימה העיקרי. לכן, המטרה שלנו הייתה לייעל את השיטה שלנו תוך ניצול האף ECS (NECs) המתקבלת ממתנדבים אנושיים. NECs מורחבים ותרבית במבחנה, מניב מודל תרבית תאים של NECs המובחן אשר מחקה רבות מהתכונות של אפיתל האף ראה in vivo. רציונל השימוש במודלים חוץ גופית עם ECs האנושי העיקרי מחקה במצב vivo - כפי שתואר במחקר זה - נותן אפשרויות ייחודיות ללמוד את הבדלי מחלה ספציפיים של ECS, פרמטרים פיסיולוגיים הקשורים לאפיתל דרכי הנשימה, או האינטראקציות בין ECS ו סוגי תאים אחרים, כגון תאים דנדריטים 10, תאים טבעיים רוצח 11 או מקרופאגים. שיטות קיימות כמה לנצל ECs הסימפונות, אשר ניתן להשיג פולשני באמצעות ביופסיות מברשת במהלך bronchoscopies, או מרקמת ריאה שהושלכה אחרת 12-17. בנוסף, מקורות מסחריים כדי להשיג תרביות תאי אפיתל דרכי הנשימה אנושית מובחנות באופן מלא קיימים (מודל EpiAirway מMatTek, אשלנד, MA, CloneticsמLonza, באזל, שוויץ, MucilAir מEpithelix סארס, ז&#39;נבה שוויץ), שבו חוקרים יכולים לבחור מתורמים שונים. עם זאת, בגלל המאגר המצומצם של תאים זמינים מסחרי אפיתל, מוגבלים או סט קבוע של פרמטרים, העלות כרוכה בהשגה באופן מסחרי בדרכי הנשימה אנושיות ראשוניות ECS, והגישה המוגבלת לרקמת ריאה שהושלכה או רקמת ביופסיה הסימפונות טריים הושגה אנושית, אוסרים על חוקרים רבים ממנהלת מחקרים בECs נשימה האנושית המובחן באופן מלא. לכן, אנו יצאנו לפתח טכניקה ש1) לנצל NECs אדם הלא פולשני הושג, 2) מספק פרוטוקול מניב תרבויות של אפיתל דרכי הנשימה אנושית המובחן, ו3) להיות לשעתקו ברוב הגדרות מעבדה עם תשתית תרבית רקמה הקיימת. יתרונות על פני שיטות / מודלים קיימים קבלת NECs הטרי, בהשוואה לסימפונות או דרכי הנשימה קטנה ECS, הוא הרבה פחות פולשני, פרטים יכול להיות ביופסיה מספר פעמים ללא תופעות לוואי משמעותיים, ויכולה להיות שנערכו ביופסיות לגרד באף שטחיות באוכלוסיות חולות שאחרת לא היה זכאיות לbronchoscopies הקשורות למחקר. ביופסיות לגרד שטחיות פולשנית כדי להשיג NECs מאפשרות לחוקר לקבוע מפרט תורם מראש, כולל גיל, מין, מצב מחלה, וכו &#39;בהתאם למטרת המחקר כדי להיות מושלם. לפיכך, בעת תכנון מחקרי חוקרים אינם מוגבלים על ידי רקמות זמינות קליני / דגימת אפיתל, לרכוש מודלים תא תרבות מובחנים יקרים מספקים מסחריים, או לימודים ברונכוסקופיה פולשנית עיצוב. בנוסף, הקלות להשיג NECs מגבירה את היכולת לבצע ניסויים בתאים מתורמים שונים, אשר משפר את האימות סטטיסטית של ממצאים שנצפו. לבסוף, האף הוא אחד האתרים הראשונים שנחשפו לכל סוג של לחץ באוויר נישא. לפיכך, יצירת organotypic במבחנה מערכות תרבות מחקות את האפיתל האף שימושיות ללימוד שאיפה של חלקיקים נגיפיים, מזהמים, אלרגן, או גזים, אשר יכול להיות מושגת בקלות על ידי שימוש במערכת תרבית תאים זה.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nasal speculum</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 22009</td>
 <td>9 mm, reusable polyproylene</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating otoscope</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 21700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhino probe cell cuvette</td>
 <td>Arlington Scientific</td>
 <td>SY-96-092</td>
 <td>bend the head of the cuvette a little more</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-well culture plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3512</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transwell membrane cell culture inserts</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3460</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flask </td>
 <td>Corning</td>
 <td>430639 and 430641</td>
 <td>T25 and T75 vented flask</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 media (with L-Glutamine)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11875</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Cell applications</td>
 <td>511-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3170</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25080</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NuSerum</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>355104</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAMBANKER freezing media</td>
 <td>BAMBANKER</td>
 <td>302-14681</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoolCell </td>
 <td>Biocision</td>
 <td>HTBCS-136</td>
 <td>(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureCol</td>
 <td>AdvancedBioMatrix</td>
 <td>5005-B</td>
 <td>dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 &mu;l/well of a 12-well plate</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS with Ca2 and Mg2+</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse 1</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>DN25</td>
 <td>Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 &mu;l to each ml of media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200-056</td>
 <td>Use at it is</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td>Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retinoic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R7632</td>
 <td>Make it up 100 &mu;M stock solution (see below), dilute to 10 &mu;M with absolute alcohol, take 5 &mu;l of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). 
 
 All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its' dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 &deg;C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media.
 Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Pituitary Extract</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>13028-014</td>
 <td>Used for BEGM ALI media.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nystatin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N4014-50 mg</td>
 <td>Make up a solution of 3.3 mg/ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1600-100</td>
 <td>Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PneumaCult-ALI media</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>5001</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrocortisone </td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7904</td>
 <td>Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7980</td>
 <td>Use at it is. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter flasks (500 ml)</td>
 <td>Corning</td>
 <td>431097</td>
 <td>0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter tubes (50 ml)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>SCGP00525</td>
 <td>Steriflip, 0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette tips - ART Barrier Tips</td>
 <td>Molecular Bioproducts</td>
 <td>2139RI, 2069RI, 2179RI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O, absolute ethanol, ice</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>refrigerated centrifuge</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>biological safety cabinet</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>gloves</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>lab coat with tight cuffs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Media and solutions used:</td>
 <td>Recipe</td>
 <td>Used for</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">General remark: always warm the media to room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="2">BEGM media</td>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid</li></ul> </td>
 <td>(mix them half-half and filter )</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements </li></ul></td>
 <td><ul><li> digestion of the biopsy</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM+ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml BEGM media </li></ul></td>
 <td><ul><li> maintaining cells on plastic in the plates (passage0) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l retinoic acid (working solution)</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td><ul><li> maintain the cells in the flask </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM++ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml Lonza's BEGM media with supplements</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding fresh cells in 12-well plate on plastic</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Sodium BiCarb</li></ul> </td>
 <td><ul><li> maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2.5 ml NuSerum</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">BEGM ALI media</td>
 <td><ul><li> 250 ml DMEM-H </li></ul></td>
 <td rowspan="5"><ul><li> Maintaining cells on the transwell before they go ALI</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 250 ml BEGM including supplements</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 75 &mu;l BSA (10 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">200X Hydrocortisone Stock Solution (96 &mu;l/ml solution)</td>
 <td><ul><li> 200 &mu;l dissolved hydrocortisone</li></ul> </td>
 <td rowspan="5"><ul><li> As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 4250 &mu;l dissolved sodium chloride </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 540 &mu;l ddH2O</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l absolute ethanol</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter solution through 0.22 &mu;m filter, aliquot solution and store at -20 &deg;C, avoid additional freeze/thaw cycles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">PneumaCult-ALI Complete Base Media</td>
 <td><ul><li> 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium</li></ul> </td>
 <td><ul><li> Base medium for all three PneumaCult-ALI media </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 50 ml PneumaCult 10x Supplement </li></ul></td>
 <td><ul><li> The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(this is stable for 2 weeks at 2-8 &deg;C or for up to 6 months at -20 &deg;C)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="4">PneumaCult-ALI Maintenance Medium</td>
 <td>Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:</td>
 <td rowspan="4">ALI culture on inserts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l PneumaCult 100x Maintenance Supplement </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 &mu;l Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 5 &mu;l Hydrocortisone (of a 96 &mu;l/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface

במודלים של מבחנה באמצעות תאי האפיתל אנושיים עיקריים חיוניים בהבנת פונקציות עיקריות של האפיתל בדרכי הנשימה בהקשר של זיהומי חיידקים או סוכנים בשאיפה. השוואה ישירה של תאים המתקבלות מאוכלוסיות חולות מאפשרת לנו לאפיין פנוטיפים שונים ולנתח את מנגנוני תיווך שינויים בתפקוד תאי אפיתל. Culturing תאי האפיתל מאזור tracheobronchial האנושי תועד היטב, אך מוגבל על ידי הזמינות של רקמה אנושית ריאות או הפולשנות הקשורים בקבלת ביופסיות מברשות הסימפונות. מתקבלים תאי אפיתל באף באמצעות ביופסיות לגרד באף שטחיות הרבה פחות פולשנית ויכולים להיות ביופסיה נושאים מספר פעמים ללא תופעות לוואי משמעותיים. בנוסף, האף הוא נקודת הכניסה למערכת הנשימה, ולכן אחד מהאתרים הראשונים שנחשפו לכל סוג של לחץ באוויר נישא, כגון סוכני חיידקים, מזהמים, או אלרגנים. בקצרה, תאי אפיתל באף שהתקבלו ממתנדבים אנושיים מורחבים על צלחות תרבית רקמה מצופים, ולאחר מכן מועברים על גבי מוסיף תרבית תאים. בהגיעם confluency, תאים ממשיכים להיות מתורבת בממשק האוויר הנוזלי (עלי), למשך מספר שבועות, שיוצרים יותר מבחינה פיזיולוגית תנאים רלוונטיים. מצב תרבות ALI משתמש בתקשורת מוגדרת מובילה לאפיתל הבדיל שמפגין מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים דומים לאפיתל באף אדם, עם תאי שני ריסי וריר ייצור. מוסיף תרבית רקמה עם תאי אפיתל באף מובחנים ניתן להשפיע במגוון דרכים בהתאם לשאלות המחקר (טיפול עם סוכנים תרופתיים, התמרה עם וקטורי lentiviral, חשיפה לגזים או זיהום עם סוכני חיידקים) וניתחתי עבור נקודות קצה שונות ומשונות החל מסלולים תאיים ומולקולריים, ch הפונקציונליAnges, מורפולוגיה, וכו &#39; במודלים של מבחנה של תאי אפיתל באף אנושיים מובחנים יאפשר לחוקרים לכתובת חדש ושאלות מחקר חשובות על ידי שימוש במודלים ניסיוניים organotypic כי במידה רבה לחקות את האפיתל האף in vivo.

NECs תרבית בעקבות הפרוטוקול שתואר כאן מחדש להתמיין לשכבה הטרוגנית של ECs המורכב של תאי ריסי ולא ריסי, המייצגים את המצב vivo (איור 1). חלק מNECs המובחן הוא ריר הפקה (תאים מכתים בכחול באמצעות א.ב. / PAS, איור 1). למרות שהפרוטוקול שהוצג כאן הוא מותאם, בידול יכול ?...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface at JoVE.com

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

תאי אפיתל באף, שהושגו באמצעות ביופסיה לגרד שטחית של מתנדבים אנושיים, הם התרחבו ומועברים על גבי מוסיף בתרבית רקמה. בהגיעם confluency, תאים גדלים בממשק נוזל האוויר, מניב תרביות של תאי ריסי ולא ריסי. תרביות תאי אפיתל באף מובחנות לספק מודלים ניסויים מעשי ללימוד הרירית בדרכי הנשימה.

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

culturing-of-human-nasal-epithelial-cells-at-the-air-liquid-interface

Research

JoVE Journal

Biology

36.6K Views.  The University of North Carolina at Chapel Hill.  תאי אפיתל באף, שהושגו באמצעות ביופסיה לגרד שטחית של מתנדבים אנושיים, הם התרחבו ומועברים על גבי מוסיף בתרבית רקמה. בהגיעם confluency, תאים גדלים בממשק נוזל האוויר, מניב תרביות של תאי ריסי ולא ריסי. תרביות תאי אפיתל באף מובחנות לספק מודלים ניסויים ...

Video: Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

הבליעה של פלורסנט, חלקיקים מגנטיים לקביעת יכולת ספיגת הנוזלים חרקים

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

האף הפרש הפוטנציאלים לכמת תחבורה טרנס-אפיתל יון בעכברים

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic exposure conditions. This puts specific demands on the cell culture models. Many cell types are negatively affected by exposure to air (e.g., drying out) and only remain viable for a few days. This limits the exposure conditions that can be used in these models: usually relatively high concentrations are applied as a cloud (i.e., droplets containing particles, which settle down rapidly) within a short period of time. Such experimental conditions do not reflect realistic long-term exposure to low concentrations of particles. To overcome these limitations the use of a human bronchial epithelial cell line, Calu-3 was investigated. These cells can be cultured at ALI conditions for several weeks while retaining a healthy morphology and a stable monolayer with tight junctions. In addition, this bronchial model is suitable for testing the effects of repeated exposures to low, realistic concentrations of airborne particles using an ALI exposure system. This system uses a continuous airflow in contrast to other ALI exposure systems that use a single nebulization producing a cloud. Therefore, the continuous flow system is suitable for repeated and prolonged exposure to airborne particles while continuously monitoring the particle characteristics, exposure concentration, and delivered dose. Taken together, this bronchial model, in combination with the continuous flow exposure system, is able to mimic realistic, repeated inhalation exposure conditions that can be used for toxicity testing.

Described is the cell culture and exposure method of an in vitro bronchial model for realistic, repeated inhalation exposure to particles for toxicity testing.

מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was performed on the day of DF harvest. The DF was washed three times with DPBS and then dissected with tissue scissors until the tissue had a pulpy or squishy consistency. Single-cell populations were pelleted by centrifugation and washed with keratinocyte serum-free medium. Heterogeneous cell populations were distributed in a culture dish. Keratinocyte serum-free medium was used to select the epithelial cells. The culture medium was changed daily until no floating debris or dead cells were observed. Epithelial cells appeared within 7-10 days after cell population distribution. Epithelial cells survived in serum-free medium, while &#945;-modification minimal essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum allowed the proliferation of mesenchymal-type cells. The DF is a tissue source for the isolation of dental epithelial cells.
The purpose of this study was to establish a method for the isolation of epithelial cells from human DF. Periodontal ligament (PDL) was used for the isolation of human dental epithelial cells. Procuring epithelial cells from human PDL is not always successful due to the small tissue volume, leading to low numbers of epithelial cells. DF has a larger volume than PDL and contains more cells. DF can be a tissue source for the primary culture of human dental epithelial cells. This protocol is easier and more efficient than the isolation method using PDL. Procuring human dental epithelial cells may facilitate further studies of dental epithelial-mesenchymal interactions.

The dental follicle contains an epithelial population and mesenchymal cells. The epithelial population was selected from the heterogeneous dental follicle cell population by providing a distinct culture medium. Epithelial cells survived and formed colonies in a serum-free medium.

בידוד תאי אפיתל מזקיקי השיניים האנושיים

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...