עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH הבאים: מענק NIH R01EY031596 (ל- C.M.); מענק NIH R01EY029985 (ל-C.M.); מענק NIH P30EY010572 (ל-C.M.); מענק NIH R01EY032564 (לב"ש). אנו מודים לתמי היילי על תמיכתה הטכנית בהכנת מקטעי הרשתית, ולד"ר צ'ארלס אלן על תרומתו הנדיבה של בדיקות mRNA FISH המשמשות בעבודה זו.

חקר תאים עצביים דו-קוטביים ואופקיים ברשתית המפוצלת של מורין

<ol>
	<li>Morgans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+ribbon+synapses+in+the+retina.">Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).</li><li>Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+bipolar+cells:+elementary+building+blocks+of+vision.">Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).</li><li>Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Cell+Feedback+to+Cone+Photoreceptors+in+Mammalian+Retina:+Novel+Insights+From+the+GABA-pH+Hybrid+Model.">Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li><li>Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+remove+photoreceptors+from+whole+mount+retina+in+vitro.">Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).</li><li>Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+retinal+preservation+in+the+photoinducible+I307N+rhodopsin+mutant+mouse,+a+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).</li><li>Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Ch&#233;dotal, A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+semaphorin+signaling+controls+laminar+stratification+in+the+mammalian+retina.">Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina.</a> Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).</li><li>Matsuoka, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance-Cue+Control+of+Horizontal+Cell+Morphology,+Lamination,+and+Synapse+Formation+in+the+Mammalian+Outer+Retina.">Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina.</a> Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).</li><li>W&#228;ssle, H., Puller, C., M&#252;ller, F., Haverkamp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+Contacts,+Mosaics,+and+Territories+of+Bipolar+Cells+in+the+Mouse+Retina.">Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina.</a> Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).</li><li>Thoreson, W. B., Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Cell+Types,+Circuits,+and+Mechanisms+for+Color+Vision+in+the+Vertebrate+Retina.">Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).</li><li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies.">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li><li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis.">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).</li><li>Todorova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Layer+Separation+(ReLayS)+method+enables+the+molecular+analysis+of+photoreceptor+segments+and+cell+bodies,+as+well+as+the+inner+retina.">Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina.</a> Scientific Reports. 12 (1), 20195 (2022).</li><li>Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+of+retinal+sublayers+from+the+entire+retina+with+special+reference+to+application+for+cell+culture.">A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).</li><li>Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+transgenic+mouse+lines+expressing+Cre-recombinase+in+the+retina.">Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina.</a> Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).</li><li>Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermolecular+Interaction+between+Anchoring+Subunits+Specify+Subcellular+Targeting+and+Function+of+RGS+Proteins+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons.">Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).</li><li>Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+Receptor+GPR179+Forms+Macromolecular+Complexes+With+Components+of+Metabotropic+Signaling+Cascade+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons.">Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).</li><li>Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+RNA+and+Protein+Expression+in+Tissue+Using+a+Combined+RNAscopeTM+In+Situ+Hybridization+and+Immunofluorescence+Protocol.">Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 2148, 301-312 (2020).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope.">RNAscope.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Morgans, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM1+is+required+for+the+depolarizing+light+response+in+retinal+ON-bipolar+cells.">TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).</li><li>Alessio, E., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+whole-mount+retinas+with+the+CLARITY+tissue+clearing+method.">Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 61 (7), 5054 (2020).</li><li>Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Thickness+Normative+Data+in+Wild-Type+Mice+Using+Customized+Miniature+SD-OCT.">Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67265 (2013).</li><li>Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Protocol+for+Retinal+Wholemount+Preparation+for+Imaging+and+Immunohistochemistry.">Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018 (2013).</li><li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+in+the+Retina.">Neurotransmitters in the Retina.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).</li><li>Chaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+functional+roles+of+horizontal+cells+in+the+retinal+circuit.">Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5540 (2017).</li><li>Egger, V., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A17+Amacrine+Cells+and+Olfactory+Granule+Cells:+Parallel+Processors+of+Early+Sensory+Information.">A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537 (2020).</li><li>Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+amacrine+cell.">The dopaminergic amacrine cell.</a> The Journal of Comparative Neurology. 301 (3), 461-489 (1990).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connectomic+analysis+reveals+an+interneuron+with+an+integral+role+in+the+retinal+circuit+for+night+vision.">Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision.</a> eLife. 9, 56077 (2020).</li><li>Janssen-Bienhold, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin57+is+expressed+in+dendro-dendritic+and+axo-axonal+gap+junctions+of+mouse+horizontal+cells+and+its+distribution+is+modulated+by+light.">Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).</li><li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+excitation+and+inhibition+in+the+dendrites+of+mouse+direction-selective+ganglion+cells.">The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells.</a> eLife. 9, 52949 (2020).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability,+affinity,+and+chromatic+variants+of+the+glutamate+sensor+iGluSnFR.">Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR.</a> Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).</li><li>Strauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Center-surround+interactions+underlie+bipolar+cell+motion+sensitivity+in+the+mouse+retina.">Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina.</a> Nature Communications. 13 (1), 5574 (2022).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+for+in+vivo+imaging+of+GABA.">A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA.</a> Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).</li><li>Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+Proton-Mediated+Inhibitory+Feedback+at+the+Retinal+Horizontal+Cell-Cone+Synapse+with+Genetically-Encoded+pH+Probes.">Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

לאחר שקולטני אור ממירים את בליעת הפוטון לשחרור מוליכים עצביים, BCs ו-HCs הם תאי העצב הראשונים ברשתית שמעבדים את האות החזותי23. בעוד חשיבותם של תאי עצב אלה מוערכת היטב, רבים מהתפקודים שלהם אינם מובנים לחלוטין או לא נחקרים לחלוטין. מחקרים רבים בפיזיולוגיה של BC ו-HC עשויים להפיק תועלת מהכנת רשתית שטוחה המשפרת את הגישה לנוירוני INL תוך שמירה על קישוריות רוחבית. פיתוח שיטת הרשתית המפוצלת מייצג מאמץ לספק פרוטוקול קל לרכישת רישומים אלקטרופיזיולוגיים באיכות גבוהה ונתוני מיקרוסקופיה מBCs ו- HCs בכיוון שטוח. הכנת הרשתית המפוצלת המתוארת כאן יכולה להתבצע בכ-20 דקות לעכבר (10 דקות לכל רשתית) לאחר בידוד הרשתית, ללא שימוש בציוד ייעודי. השיטה שואבת השראה מהליכים קיימים להסרת קולטני אור אך מציעה שיפורים משמעותיים בפשטות, במהירות וברבגוניות 4,10,11,12,13. בניגוד לשיטות קודמות להפרדת שכבות רשתית, פיצול הרשתית אינו דורש הקפאה, ליופיליזציה או מריחה חוזרת של דבקים על הרשתית. עם תרגול, כמעט כל photoreceptors ניתן להסיר בקרע אחד עם קרום nitrocellulose. המהירות והקלות של גישה זו מאפשרות למזער את הזמן שהרשתית מבלה מחוץ לאיימס קרבוגני, מה שמאפשר קיום תאים גבוה לפרקי זמן ארוכים; רשתית מפוצלת יכולה להישמר במדיה איימס קרבוגנית במשך מספר שעות לאחר הפיצול. כעדות לבריאות תאי עצב מסוג INL בהכנה זו, כתם של תאים חיים/מתים (איור 4) ואלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי (איור 6) מאשרים את הכדאיות של RBCs ו-HCs לאחר פיצול.
הסרת שכבת הפוטורצפטור ברשתית מפוצלת מעבירה יתרון משמעותי במהלך התיוג החיסוני על ידי קיצור דרמטי של זמן הדיפוזיה של נוגדנים לתוך INL. ניתן להשלים תיוג נוגדנים ראשוני ומשני תוך שעתיים, שיפור משמעותי לצביעה שטוחה קונבנציונלית שיכולה להימשך 72 שעות או יותר בהתאם ליעד 5,6,7,8,20,22. כתוצאה מכך, ניתן להשיג נתוני מיקרוסקופיה באותו יום של הכנת רקמות, מה שמאיץ באופן דרסטי את קצב הניסויים האימונופלואורסצנטיים. כדי להקל על חישול בדיקות mRNA, ניסויי FISH ממליצים בדרך כלל על זמני קיבוע ארוכים בהרבה (~ 24 שעות) מאשר תיוג חיסוני18. אולם הניסויים שהוצגו כאן מראים שקיבוע של שעתיים עדיין מייצר תיוג FISH יוצא דופן (איור 5). למרות הארכת זמן הקיבוע מ -30 דקות ל -2 שעות, לא היה צורך לבצע שלבי אחזור אנטיגן כדי להשיג תיוג חיסוני מעולה, אך זה עשוי להשתנות עם הנוגדן או האנטיגן. הטיפול בפרוטאז בפרוטוקול FISH עלול להפריע לסימון נוגדנים, ככל הנראה עקב הרס אפיטופים של מטרה. בעיה זו נעקפה על ידי שימוש בנוגדנים רב-שבטיים המכוונים לאפיטופים מרובים, מה שמקטין את הסבירות שהרס אפיטופים יעכב תיוג חיסוני. בנוסף, נעשה שימוש בטיפול מתון בפרוטאז (ACD protease III) כדי למנוע שינוי אפיטופ מוגזם תוך מתן חדירה מספקת לרקמות.
לעיתים, הרשתית תתפצל במקום זאת דרך השכבה הגרעינית החיצונית (ONL), ותשאיר מאחוריה שכבות של סומות קולטניות אור ללא תאי INL גלויים. כדי למנוע זאת, יש לוודא כי הרשתית מונחת שטוחה לחלוטין על הזכוכית, וכי כל שאריות נוזל סביב הרשתית הוסרו. לחיצה חזקה יותר על הניטרוצלולוז עם המברשת עשויה גם לסייע במניעת פיצול דרך ה- ONL. אם הממברנה נעשית רטובה מדי או שהרשתית מקופלת על עצמה, הסיכויים לפיצול מוצלח יפחתו מאוד. שימוש ב- DAPI להכתמת גרעיני תאים שימושי להערכת איכות הפיצול ולקביעת הכיסוי של קולטני האור הנותרים. גרעיני קולטני אור הם קטנים יותר, בהירים יותר ושטחיים יותר (איור משלים 3A), בעוד שגרעיני BC הם גדולים יותר, עמומים יותר ועמוקים יותר (איור משלים 3B). במקרים מסוימים, מישור הקרע ישתנה מעט על פני פיסת הרשתית, וכתוצאה מכך ייווצרו טלאים שבהם גופי התאים של קולטני האור לא הוסרו לחלוטין (איור משלים 3C). עבור יישומים במיקרוסקופ ואלקטרופיזיולוגיה, זה לא מפריע ליכולת לאסוף נתונים איכותיים מאזורים שבהם פוטורצפטורים הוסרו כראוי; שדות גדולים של רשתית פנימית חשופה ניתן למצוא בקלות בעת הדמיה או הקלטה עם פיפטה טלאי. אם רוצים הסרת פוטורצפטור מלאה יותר, ניתן לבצע קרע שני עם חתיכה נוספת של קרום ניטרוצלולוז, אם כי הסרת 100% פוטורצפטור אינה מובטחת. לכן מומלץ להיזהר בעת שימוש ברשתית מפוצלת במחקרי ביטוי גנים או פרוטאומיקה שבהם חומר פוטורצפטור שיורי עשוי להשפיע על התוצאות. עבור יישומים של תא בודד, חשש זה אינו מוצדק, מכיוון שניתן להוציא נתונים מפוטורצפטורים מהניתוח.
היתרונות של הכנת הרשתית המפוצלת הם אולי הבולטים ביותר בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות של נוירונים בין-עצביים רחבי שדה. בעוד פרוסות אנכיות מסורתיות קוטעות את התהליכים הנרחבים של תאים רחבי שדה, הכנת הרשתית המפוצלת משאירה את OPL ו- IPL ללא פגע, ומאפשרת ללכוד קלט מתאים רחבי שדה כגון HCs24, A17s 25, TH ACs 26 ו- NOS-1 ACs27 שאחרת היו מתעלמים מהם בפרוסות אנכיות. לכן, פענוח התוצאות והשוואה לנתונים קודמים שנאספו מפרוסות רשתית דורשים מחשבה מעמיקה. עם זאת, בניסויים שהשתמשו בחיקויים פרמקולוגיים של גירוי אור, תוצאות אלה דומות לנתונים שנרשמו מפרוסות רשתית19. על ידי ביטוי ChR2 תחת מקדמים ספציפיים לתא, ניתן לעורר אוכלוסיית תאים רצויה תוך כדי הקלטה מ- BCs ב- INL כדי לחקור את השפעת התא הרצוי על מסלול המידע האנכי. הקלטה ישירה מנוירוני INL עמוקים יותר, כגון תאים אמקריניים, אפשרית גם ברשתית המפוצלת. בעוד שבמקרה זה אלקטרודת המדבקה חייבת לנוע תחילה דרך נוירוני INL שטחיים יותר, יש הרבה פחות רקמה שחוסמת את דרכה בהשוואה להכנה מסורתית של הר שלם.
בנוסף למדידת ההשפעה של תאי שדה רחב על תאי עצב אחרים, שיטה זו מאפשרת הידוק טלאי ישיר של תא בודד מתאי HC, שהדנדריטים שלהם יוצרים רשת מצומדת נרחבת של צומת מרווחים ב-OPL28. תאים אופקיים שולחים משוב קריטי לפוטורצפטורים אשר מעצב את העברת המידע האנכי דרך הרשתית. עם זאת, מאחר שהשדות הדנדריטיים של HCs נחתכים בפרוסות אנכיות, חסרים נתוני רישום של תא בודד. עבודה זו מציגה HCs שלמים מבחינה אנטומית ופיזיולוגית שמהם נרשמים זרמים מעוררי ChR2 בקו עכבר מהונדס משולש (איור 6 C-E). מחוץ לגירוי ChR2, הרשתית המפוצלת יכולה לשמש לחקר זרמי HC אנדוגניים וצימוד צומת פער28. בעוד הרשתית המפוצלת מספקת מודל נוח לחקר קישוריות סינפטית ופעילות עצבית הנגרמת על ידי יישום כימי או גירוי ChR2, היעדר פוטורצפטורים מונע כל חקירה ישירה של תגובות אור טבעיות או מנגנוני הסתגלות לאור.
הדמיה באתרו ברשתית התקדמה באופן ראוי להערכה בשנים האחרונות. עם זאת, רוב מחקרי ההדמיה מוגבלים לשכבת תאי הגנגליון בתכשירי רשתית הר שלמים29. המחברים צופים כי היעדר פוטורצפטורים ברשתית המפוצלת יהפוך אותה למודל אידיאלי להדמיית סידן חיה ב-OPL וב-INL. מעבר להדמיית סידן, למודל זה יש פוטנציאל גדול לשימוש עם ביו-חיישנים מקודדים גנטית כגון iGluSnFR30,31, iGABASnFR 32 ו-pHluorin 33. בשילוב עם הכנת הרשתית המפוצלת, כלים רבי עוצמה אלה עשויים להציע גישה יעילה לחקר האינטראקציות הסינפטיות והתכונות הביופיזיקליות של BCs ו- HCs התורמים לעיבוד האור ברשתית.

הרשתית היא רקמה עצבית דקה הממוקמת בעין האחורית שבה האור מיורט ומעובד לאות אלקטרוכימי שיכול להתפרש על ידי המוח. בחלק האחורי של הרשתית, photoreceptors מוט חרוט מגורה על ידי אור, אשר מפחית את קצב שחרור טוניק של נוירוטרנסמיטר, גלוטמט1. תאי העצב הראשונים שחווים ומגיבים לשינוי זה בריכוז הגלוטמט הנגרם על ידי האור הם התאים הדו-קוטביים (BCs) והתאים האופקיים (HCs), שהסומות שלהם שוכנות באזור החיצוני ביותר של השכבה הגרעינית הפנימית (INL). תאי עצב אלה מסדר שני מבצעים את השלב הראשון של עיבוד אותות ברשתית ומעצבים תכונות קריטיות של ראייה כגון הסתגלות לאור, רגישות לניגודיות והתנגדות מרחבית/צבע2. בעוד שפונקציות אלה יוחסו ל-BCs ול-HCs, המעגלים החשמליים והמנגנונים הביוכימיים שבבסיס תהליכים אלה אינם מובנים במלואם3. לכן, קידום כלים ושיטות לחקר הפיזיולוגיה של BC ו- HC הוא בעל חשיבות עליונה.
קטעי רשתית אנכיים (רוחביים) הוכיחו זה מכבר את המודל המעשי ביותר לחקר BCs ו- HCs; עם זאת, היבטים מסוימים של הפיזיולוגיה BC ו- HC אינם נגישים לנסיין תחת מודל זה. רישומים ישירים מHCs או מדידות עקיפות של השפעתם על BCs אינם משקפים את הקישוריות האנדוגנית של הרשתית מכיוון שהתהליכים הרוחביים של תאים אלה נקטעים במהלך החיתוך. תכשירי רשתית שלמים עוקפים בעיה זו על ידי שימור תהליכים רוחביים אלה, אך שכבות הרשתית שמסביב מציבות אתגר לגישה לתאים אלה4. אמנם יש דוגמאות רבות של immunostaining 5,6,7,8 והקלטות מהדק תיקון9 מנוירונים INL ברשתית הר שלם, יש הזדמנות לזרז ולפשט את איסוף הנתונים האלה. המגבלות המובנות של חתכים רוחביים והאתגרים של דגם ההר כולו היוו אפוא השראה לפיתוח תכשיר רשתית שטוח חלופי זה.
העבודה הבאה מתארת פרוטוקול להסרה קלה של שכבת קולטני האור מרשתיות חיות ושטוחות כדי לשפר את הגישה ל-BCs ול-HCs לקבלת הידוק טלאים פשוט יותר ותיוג חיסוני מהיר ויעיל יותר. קילוף שתי חתיכות של קרום ניטרוצלולוז המחוברות משני צדי הרשתית המבודדת קורע את הרקמה דרך אקסוני קולטני האור, ומותיר רשתית מפוצלת השומרת על שכבת הפרספקס החיצונית (OPL) ועל כל שכבות הרשתית הפנימיות. בעוד שאחרים תיארו פרוטוקולים להפרדה מכנית של שכבות הרשתית, שיטות אלה אינן מתאימות ליישומי הידוק טלאים ומיקרוסקופ או דורשות מניפולציה מייגעת של הרקמה. כמה משיטות אלה דורשות רקמות קפואות או ליופיליות להפרדת שכבות, מה שהופך אותן ללא תואמות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים10,11,12. אחרים מיועדים לרקמה חיה, אך דורשים 5-15 קילופים עוקבים עם נייר סינון 4,11 או טיפול בטריפסין 13 כדי להסיר את הפוטורצפטורים. הטכניקה המתוארת כאן משפרת את קודמותיה על ידי פישוט הליך הסרת קולטני האור והרחבת הרפרטואר של יישומים במורד הזרם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 pairs of Dumont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470 nm LED</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>M470L2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-306 curved scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; disposable pasteur pipetes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>for constructing custom transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai80d mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>25109</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:025109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium w/L-Glutamate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A1372-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amplifier control software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10.3 software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calbindin D28K antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA-5 85669</td>
			<td>RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612044</td>
			<td>RRID:&#160; AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GPR179 antibody</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PKC alpha antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4334</td>
			<td>RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PKC alpha antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc8393 AF594</td>
			<td>RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610495</td>
			<td>RRID:&#160; AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RGS11 antibody</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX;&#160; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin P38 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-S5768</td>
			<td>RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquamount mounting media</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>13800</td>
			<td>slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>000664</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:000664</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbogen tank</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>NA</td>
			<td>95% O2 and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom transfer pipette</td>
			<td>custom build</td>
			<td>NA</td>
			<td>Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitical optical power meter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>&#160;PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS, BX50WI</td>
			<td>Dodt gradient contrast microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO CS2 40x/1.3&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO CS2 63x/1.40&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Robbins Scientific</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>for RNAscope protocol only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immedge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe (delicate task wipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 X confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium 15 mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060-60</td>
			<td>eyes are kept here during retina dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merit 97-275 steel scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm-Gabrd-C2 mRNA probe</td>
			<td>ACD</td>
			<td>459481-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse euthanasia chamber</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>custom build; glass petri dish covering a small glass jar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences; Whatman</td>
			<td>7184-005</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>General Valve Corporation</td>
			<td>Picospritzer II&#160;</td>
			<td>referred to in the text as microcellular injection unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>for constructing custom transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-603</td>
			<td>for connection to carbogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum harp</td>
			<td>custom build</td>
			<td>NA</td>
			<td>for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>size 0 paint brush</td>
			<td>generic</td>
			<td>NA</td>
			<td>for flattening retina during splitting.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36937&#160;</td>
			<td>referred to in the text as anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small 10 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>eyes are placed here following enucleation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small glass pane (7.5 cm x 5 cm)</td>
			<td>generic</td>
			<td>NA</td>
			<td>isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>electrostatically-charged glass microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors; straight</td>
			<td>Titan Medical</td>
			<td>TMS121</td>
			<td>not brand specific; any comparable scissors will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGATFLPo mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>29591</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:029591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGlut2Cre mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>28863, 016963</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423105</td>
			<td>referred to in the text as MI-NIR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina

תאים דו-קוטביים ותאים אופקיים ברשתית בעלי החוליות הם תאי העצב הראשונים שמעבדים מידע חזותי לאחר זיהוי פוטונים על-ידי פוטורצפטורים. הם מבצעים פעולות בסיסיות כגון התאמת אור, רגישות לניגודיות והתנגדות מרחבית וצבע. הבנה מלאה של המעגלים המדויקים והמנגנונים הביוכימיים השולטים בהתנהגותם תקדם את המחקר במדעי המוח החזותיים ואת רפואת העיניים. עם זאת, ההכנות הנוכחיות לבדיקת תאים דו-קוטביים ואופקיים (תושבות שלמות רשתית ופרוסות אנכיות) מוגבלות ביכולתן ללכוד את האנטומיה והפיזיולוגיה של תאים אלה. בעבודה זו, אנו מציגים שיטה להסרת גופי תאים קולטי אור מרשתיות עכבר חיות ושטוחות, המספקות גישה משופרת לתאים דו-קוטביים ואופקיים להידוק טלאים יעיל ותיוג חיסוני מהיר. רשתיות מפוצלות מוכנות על ידי כריכת רשתית עכבר מבודדת בין שתי חתיכות של ניטרוצלולוז, ואז מקלפים אותן בעדינות זו מזו. ההפרדה מפצלת את הרשתית ממש מעל שכבת הפרספקס החיצונית ומניבה שתי חתיכות של ניטרוצלולוז, אחת מכילה את גופי התא קולטני האור והשנייה מכילה את הרשתית הפנימית שנותרה. בניגוד לפרוסות רשתית אנכיות, הכנת הרשתית המפוצלת אינה קוטעת את התהליכים הדנדריטיים של נוירוני הרשתית הפנימיים, ומאפשרת הקלטות מתאים דו-קוטביים ואופקיים המשלבים את התרומות של רשתות מצומדות למרווחים ותאים אמקריניים רחבי שדה. עבודה זו מדגימה את הרבגוניות של הכנה זו לחקר תאים אופקיים ודו קוטביים באלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה וניסויי הכלאה באתרם .

The retina is a thin neural tissue located in the posterior eye where light is intercepted and processed into an electrochemical signal that can be interpreted by the brain. At the back of the retina, rod and cone photoreceptors are stimulated by light, which reduces the tonic release rate of the neurotransmitter, glutamate1. The first neurons to experience and respond to this light-induced change in glutamate concentration are the bipolar cells (BCs) and horizontal cells (HCs), whose somas reside in the outermost region of the inner nuclear layer (INL). These second-order neurons perform the first stage of signal processing in the retina and shape critical features of vision such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial/color opponency2. While these functions have been ascribed to BCs and HCs, the circuitry and biochemical mechanisms underlying these processes are not fully understood3. Therefore, the advancement of tools and methods for exploring BC and HC physiology is of paramount importance.
Vertical (transverse) retina sections have long&#160;proven the most practical model for studying BCs and HCs; however, certain aspects of BC and HC physiology are inaccessible to the experimenter under this model. Direct recordings from HCs or indirect measurements of their effects on BCs do not reflect the retina&#39;s endogenous connectivity since the lateral processes of these cells are severed during slicing. Whole mount retina preparations circumvent this issue by preserving these lateral processes, but the surrounding retinal layers pose a challenge for accessing these cells4. While there are abundant examples of immunostaining5,6,7,8 and patch clamp recordings9 from INL neurons in whole mount retinas, there is an opportunity to expedite and simplify the collection of these data. The inherent limitations of transverse sections and the challenges of the whole mount model thus inspired the development of this alternative flatmount retina preparation.
The following work describes a protocol for easily removing the photoreceptor layer from live, flatmount retinas to enhance access to BCs and HCs for simplified patch clamping and faster, more efficient immunolabeling. Peeling apart two pieces of nitrocellulose membrane attached to either side of an isolated retina tears the tissue through the photoreceptor axons, leaving a split retina that retains the outer plexiform layer (OPL) and all inner retinal layers. While others have described protocols for mechanically separating layers of the retina, these methods are either poorly suited to patch clamping and microscopy applications or require tedious manipulation of the tissue. Several of these methods require frozen or lyophilized tissue for layer separation, making them incompatible with electrophysiology experiments10,11,12. Others are designed for live tissue, but necessitate 5-15 sequential peels with filter paper4,11 or treatment with trypsin13 to remove the photoreceptors. The technique described here improves upon its predecessors by simplifying the photoreceptor removal procedure and expanding the repertoire of downstream applications.

מחבר זרקור: שימוש בטכניקת הרשתית המפוצלת לגישה משופרת וניסויים מואצים 

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

Our group is interested in the neuronal circuitry and synaptic mechanisms underlying visual processing in the retina. The Morgans Lab is investigating molecular mechanisms of light adaptation in bipolar cells, and the Sivyer Lab is interested in how inner retinal neurons contribute to ganglion cell function. Accessing internuclear layer neurons in whole mount retina is a challenge for both anatomical and physiological studies.Internuclear layer neurons are accessible in vertical sections, but they're very few neurons in the field of view. Furthermore, slicing severs lateral processes and connections which can impact physiological studies. The removal of the photoreceptors in the split retina technique dramatically improves antibody diffusion into the inner retina, which makes immunolabeling of inner retinal targets over 20 times faster when compared to traditional whole mount retina.The split retina also greatly improves access to internuclear layer neurons during patch clamp electrophysiology. The split retina technique will open doors to new approaches and accelerate the pace of our experiments. For example, we plan to use this technique to study bipolar cell inputs to melanopsin ganglion cells by expressing channelrhodopsin in the bipolar cells.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Split Retina Technique for Enhanced Access and Accelerated Experiments at JoVE.com

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by ...

הקבוצה שלנו מתעניינת במעגלים העצביים ובמנגנונים הסינפטיים שבבסיס עיבוד הראייה ברשתית. מעבדת מורגן חוקרת מנגנונים מולקולריים של הסתגלות לאור בתאים דו-קוטביים, ומעבדת סיוויר מתעניינת באופן שבו נוירונים ברשתית הפנימית תורמים לתפקוד תאי הגנגליון. גישה לנוירונים בשכבה הבין-גרעינית ברשתית הר שלמה היא אתגר למחקרים אנטומיים ופיזיולוגיים כאחד.נוירונים בשכבה הבין-גרעינית נגישים במקטעים אנכיים, אבל הם מעט מאוד נוירונים בשדה הראייה. יתר על כן, חיתוך מנתק תהליכים וקשרים רוחביים שיכולים להשפיע על מחקרים פיזיולוגיים. הסרת הפוטורצפטורים בטכניקת הרשתית המפוצלת משפרת באופן דרמטי את דיפוזיית הנוגדנים לתוך הרשתית הפנימית, מה שהופך את התיוג החיסוני של מטרות הרשתית הפנימית למהיר פי 20 בהשוואה לרשתית שלמה מסורתית.הרשתית המפוצלת גם משפרת מאוד את הגישה לנוירונים בשכבה הבין-גרעינית במהלך אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי. טכניקת הרשתית המפוצלת תפתח דלתות לגישות חדשות ותאיץ את קצב הניסויים שלנו. לדוגמה, אנו מתכננים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור קלט תאים דו-קוטביים לתאי גנגליון מלנופסין על ידי ביטוי צ'אנלרודופסין בתאים הדו-קוטביים.

split-retina-as-an-improved-flatmount-preparation-for-studying-inner

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

1.9K Views.  Oregon Health and Science University. הקבוצה שלנו מתעניינת במעגלים העצביים ובמנגנונים הסינפטיים שבבסיס עיבוד הראייה ברשתית. מעבדת מורגן חוקרת מנגנונים מולקולריים של הסתגלות לאור בתאים דו-קוטביים, ומעבדת סיוויר מתעניינת באופן שבו נוירונים ברשתית הפנימית תורמים לתפקוד תאי הגנגליון. גישה לנוירונים בשכבה הבין-...

Video: מחבר זרקור: שימוש בטכניקת הרשתית המפוצלת לגישה משופרת וניסויים מואצים 

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.