המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר דידרה נלסון על הערות מועילות ולקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH DE019244, DE019197, וDE021841 למ&quot;ל, F32DE02098001 לי&quot;ש, וC06 RR015464 לאוניברסיטת אולבני, SUNY.

הפרוטוקול מכיל ארבעה שלבים עיקריים, כמתואר באיור 1. כל הצעדים מתוארים בפירוט מלא. בניית adenovirus וטיהור נגיפית צריכות להיות מופעלים מראש של קצירת האיברים לשימוש בהתמרה הגנטית של יסודות אפיתל גזור. כל אמצעי בטיחות BSL-2 הסטנדרטי צריך להיות אחרי כשעובד עם adenoviruses. 1. בלוטת קצירת עכבר עוברי לסת תחתונה (SMG) וmicrodissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברי מתוזמן בהריון נשי (מתח outbred CD-1 או ICR) באמצעות 2 CO הרדמה, ואחרי עקירת צוואר רחם ומחרוזות קציר של עוברי עכברים ביום עוברי 13 (E13, 3-5 ניצני אפיתל) הליכים שאשרו IACUC המוסדי ועדה. היום של גילוי תקע נרתיק מיועד כE0. בלוטות רוק יכולות גם להיות שנקטפו ותרבית בE12 השלב שבו יש ניצן אחד עיקרי וגבעול עם בתרי רק מתחילליזום. SMGs לפני שלב זה דורש תנאי תרבות שונים מאלה שצוינו כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חוטי עובר ל 10 מנות סטריליים סנטימטר רקמות תרבות מלאה עם 25 מ&quot;ל של מדיום DMEM / החם של F12 (F12) החסרים אדום פנול (חיים טכנולוגיים) והשלים עם 100 U / המ&quot;ל פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (עט סטרפטוקוקוס, חי טכנולוגיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל סטרילי (# 11 להבים) ומלקחיים (# 5, כלי מדע פיין, 11252-20), להסיר את העוברים מהצ&#39;קים לתוך צלחת נפרדת סנטימטר המכיל 10 מ&quot;ל של 25 DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את ראש העובר עם חתך אלכסוני ממש מתחת ללסת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הצבתות הנמוכות מהראשים תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו עם אור בסיס משודר (ניקון SMZ645 או שווה ערך) באמצעות חתך מתחת ללסת העליונה. הנח את הרקמות על גבי חתיכה נוספת של זכוכית ולא ישירות על מרכיב כוס בסיס מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הצבתות הנמוכות ל3 מ&quot;ל של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס בצלחת סטרילית 35 מ&quot;מ רקמת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח פרוס לסת תחתונה על במת מיקרוסקופ לנתח כך שהלשון היא בתחתית של הפרוסה אבל הוא מצביע לעבר כיוון השעה 12:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצד אחד של שני מלקחיים מוצלבים בתנועת מספריים, להסיר ולסלק rd הנמוך 1/3 מפרוסת הלסת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ° 90 הפרוסה לימין (אם ימני), ובאמצעות קיצוץ מספריים עם המלקחיים, לחתוך את החלק העליון של פרוסת הלסת התחתונה (בלי לחתוך את הלשון) באמצע הדרך לפרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולף את הרקמה העודפת ולהסיר אותו משם, כדי לחשוף את SMGs מתחת. יהיה אחד בכל צד ליד בסיס הלשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזוג אחד של מלקחיים להחזיק את הרקמה על ידי הלשון, להשתמש במלקחיים האחרים להקניט את SMG מהלשון. חזור לבלוטה האחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את בלוטות רוק microdissected ל3 מ&quot;ל של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס לתוך רקמת מ&quot;מ חדשה סטרילית 35מנת התרבות. הערה: את בלוטות הלסת התחתונות הגדולות יותר (3-5 ניצני אפיתל) יחד עם בלוטת sublingual הקטנה המחוברת (ניצן 1) יכולות להיות מתורבתות בשלמות על ידי דילוג לשלב 4 וביצוע צעדים 4.1, 4.3, ו -4.4, כפי שתואר לעיל 2,8. </li></ol> 2. SMG הפרדת הגמד אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 5 (או יותר) בלוטות רוק לתוך קרקעית מזכוכית, 50 מ&quot;מ קוטר microwell מנה (מאטק תאגיד, P50G-1.5-14-F) ובו 200 μl של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS חסר Ca + + או Mg + +, חיים טכנולוגיים) המכיל 0.4% (v / v) dispase (חיים טכנולוגיים, חתול. לא. 17105-041) ודגירה במשך 15 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, באמצעות קצה פיפטה סטרילי 200 μl, לשאוב בזהירות את פתרון dispase מבלי להפריע לבלוטות. מייד להוסיף 200 μl של DMEM/F12 מדיה המכילה 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, לעקר מראש עם 0.22-מיקרומטר מסנן) כדי לנטרל את dispase. </li> &lt;li&gt; תחת מיקרוסקופ לנתח, בעזרת זוג מלקחיים עם טיפים יפים (# 5 Dumostar, כלי מדע פיין, 11295-20), בעדינות להפריד mesenchyme המשוחרר מכל את הבלוטות וצינוריות אפיתל SMG, דואג להשאיר את האפיתל שלם . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום רטוב טיפ סטרילי 200 μl פיפטה עם DMEM/F12-BSA תקשורת ועדינות פיפטה את יסודות אפיתל לתוך צלחת חדשה בקוטר 50 מ&quot;מימ המכילה 200 microwell μl של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס. השתמש בקצה איכות גבוהה 200 μl פיפטה עם קצה חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנה שמכילה את חלקי mesenchyme, להשליך כל רקמה שאינה mesenchymal כוללת את בלוטות sublingual וכל ניצני בלוטת לסת תחתונות מנותקים. </li></ol> 3. זיהום adenoviral של יסודות ראשונים אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 200 μl של תקשורת זיהום ויראלי על ידי דילול אדנווירוס עניין בDMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס בצינור microcentrifuge כך שכייל של הפתרון המתקבל הוא 1x10 8 9 PFUs -10.כייל אופטימלי הנדרש לאיתור וירוסים שונים עשוי להשתנות. חשוב להשתמש כלוריד צסיום (CsCl)-מטוהר הכנות יראליים לשימוש יעיל בספיגה אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהצלחת המכילה את החמישה יסודות אפיתל. להוסיף במהירות 200 μl של תקשורת הזיהום, שמירה על היסודות רטובים בכל העת. לנקוט באמצעי זהירות הנדרש בעת טיפול בנגיף והשלכה של טיפי pipet מזוהמים. לחטא את כל משטחים מזוהמים בוירוס, 10% בתמיסת כלור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את יסודות אפיתל רחוק אחד מהשני עם מלקחיים כדי למנוע מהם להידבק זה לזה ולאפשר להם להתיישב לתחתית הצלחת. דגירת יסודות בתקשורת הנגיפית לשעה 1 בטמפרטורת חדר. במהלך הדגירה, להפריד את היסודות, אם הם יעברו קרובים זה לזה. נדנדה או תנועה מוגזמת תאפשר את בלוטות גוש ביחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה, בעדינות להסיר את המדיה נגיפית המכיל ולהשליך כראוי, נזהר שלא לשבש את rudiments. הוסף 200 μl של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס. חזור על לשטוף את זה לפחות פעמים נוספות ולהחליף עם 200 μl של DMEM/F12 + תקשורת העט סטרפטוקוקוס. השטיפות האלה הן קריטיות כדי להסיר כל וירוס שאינו קשור מאוד לאפיתל ולמנוע הדבקה של mesenchyme. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת יסודות אפיתל עם 200 מ&quot;ל של DMEM/F12 מכיל 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) למשך 20 דקות. אנו מוצאים כי דגירה קצרה זה בMatrigel ממזערת את הרגרסיה של בתרי קיים בתקופת התרבות הראשונית, אבל צעד זה ניתן לוותר אם החשיפה לMatrigel אינה רצויה. </li></ol> 4. תרבות vivo לשעבר של SMGs recombined <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כל גמד, אחד בכל פעם, באמצעות קצה פיפטה מראש רטוב 200 μl, על גבי (חתך קטן) מחורצים 13 מ&quot;מ, 0.1 מיקרומטר Nuclepore קרום מסנן מסלול-Etch (Whatman) מרחף מעל 200 μl של מדיה התרבות ( 5 יסודות / סינון) בצלחת microwell בעלת קרקעית זכוכית. תקשורת התרבותהוא: DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס המכיל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל וחומצה transferrin 150 מיקרוגרם / מ&quot;ל אסקורבית, כפי שתואר קודם לכן 2,8. Transferrin ידוע כדי לעורר הישרדות והסתעפות המורפוגנזה של בלוטות רוק וexplants איברים האחרים 9. תוספת של חומצה אסקורבית הוכחה לעורר SMG הסתעפות 10. זה ידוע לפעול כcofactor בתגובות hydroxylation רבות של מסלולים מטבוליים (כגון hydroxylation פרולין במהלך היווצרות סיבי קולגן 11) וגם ממריץ ייצור פיברונקטין וlaminin בexplants איברים האחרים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כתקשורתיים רבה על גבי המסנן ככל האפשר לאחר ההוספה כל גמד אפיתל. יותר מדי תקשורת על גבי המסנן עלולה לגרום למסנן לשקוע, בעוד פחות המדיה הופכת מיקום של היסודות וmesenchyme הרבה יותר קל. תקשורת העודפת ניתן להסיר גם עם קצה פיפטה או באמצעות מלקחיים לאחיזה בתקשורת בין הקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתיכות mesenchyme מקום נגזרו הלוך ושובמ 3-4 בלוטות על גבי ו / או סביב כל גמד אפיתל. הוצא את כל אמצעי נוסף המקיף את הבלוטות כדי למנוע תנועה של mesenchyme הרחק מהיסודות. Mesenchyme נגזר מבלוטות יותר אינו מועיל אך פחות יכול להיות מזיק לצמיחת הגמד אפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת SMGs מורכב בחממת humidified (אוויר / 5 CO 2% 95%) על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 -72 שעות, בהתאם לצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Brightfield לרכוש ו / או תמונות ניאון של בלוטות חיות ב0 שעות (אם רוצה), 2 שעות לאחר רקומבינציה וכל 24 שעות לאחר מכן במיקרוסקופ אור הפוכה, כלפי מעלה, או סטריאו מצויד במצלמה דיגיטלית באמצעות הגדלת מטרת 4X או 5X ל ללכוד את הבלוטה מורכב כולו במסגרת אחת מנוף. תמונות של בלוטות הרוק להראות את הניגוד הטוב ביותר תוך שימוש בהגדרת brightfield או טבעת השלב המתאימה להציב דרך חלק לתוך נתיב האור (דבר שאינו אפשרי במיקרוסקופים מלאים אוטומטיים). לעומת שלב סטנדרטי היא לאלא הכרחי מאז הבלוטה היא עבה ויוצר ניגוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודתי זמן וברצוי, SMGs מורכב יכולה להיות קבוע במשך 20 דקות עם פתרון מקבע עשויות paraformaldehyde 2% (PFA) ב1X PBS המכיל 5% (w / v) סוכרוז (טוב יותר לשמור על המבנה תאי הפנימי על ידי שמירה על התאים ב מדינת מליחות). שלא כמו 4% PFA, 2% PFA ישמור כמות משמעותית של אות ה-GFP אם מקבעים נמחק לחלוטין לאחר קיבוע. בלוטות ניתן לאחסן עד השבוע 1 ב 1X PBS בחושך ב 4 ° C עד immunocytochemistry הר השלם והדמית confocal מבוצע, כפי שדווח בעבר 3,6,13-15. באופן אידיאלי, יש לבצע הדמית immunocytochemistry וזמן קצר לאחר קיבוע לקבל את התמונות באיכות הטובה ביותר. בלוטות יכולות להיות גם lysed במאגר Ripa ל- PAGE SDS אחרי ניתוח סופג מערבי. </li></ol>

<ol>
	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+collagen.">The chemistry and biology of collagen.</a> The Proteins. 4, 412-632 (1979).</li><li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin,+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture.">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טכניקת רקומבינציה אפיתל-mesenchymal vivo לשעבר פורסמה לראשונה לבלוטות רוק לסת תחתונות בשנת 1981 16. בפרוטוקול זה, אנו עומדים בהרחבה על השיטה המקורית, באמצעות זיהום adenoviral כדי לתפעל ביטוי גני התא אפיתל בהקשר של בלוטה התחברה מחדש. אנו מראים כי אחוז של תאי האפיתל נגוע בא?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM / החם של F12 בינוני ללא פנול אדום </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין וסטרפטומיצין </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 15070-163 </td><td> מניית 10X </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 17105-041 </td><td> הקפא aliquots שימוש היחיד ב- 20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A2934-100G </td><td> V שבריר, אנדוטוקסין הנמוך </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> צריך להיות כייל נוגדנים גבוה (1x10 10 pfu / מ&quot;ל). וירוסים מטוהרים CsCl יעילים יותר ממטוהר טור וירוסים בבדיקה זו. </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td&gt; מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15710 </td><td> דילול של 2% בPBS עם סוכרוז 5% (w / v) </td></tr><tr><td> 1X פוספט-נאגר מלוח (PBS) </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 70011-044 </td><td> הכין ממניות 10X </td></tr><tr><td> תמיסת המלח המאוזן של האנק </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 14175095 </td><td> לא סידן, לא מגנזיום, לא אדום פנול </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> סיגמא </td><td> T8158 </td><td> 25 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון המניות בDMEM/F12 תקשורת. הקפא aliquots שימוש יחיד ב- 20C </td></tr><tr><td> חומצת L-אסקורבית (הוויטמין C) </td><td> סיגמא </td><td> A4403 </td><td> 75 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון המניות בDMEM/F12 aliquots media.Freeze שימוש יחיד ב- 20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. רשימה של חומרים כימיים הנדרש לSMG פרוטוקול רקומבינציה. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 מנות פלסטיק סטריליים סנטימטר </td><td> קורנינג </td><td> 430167 </td><td> צלחות ללא רקמת התרבות שטופלה יכולות לשמש גם. </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ לנתח סטריאו עם אור בסיס מועבר </td><td> ניקון </td><td> SMZ645 </td><td> כל סטריאו ביתור מיקרוסקופ ניתן להשתמש כי יש בסיס אור מועבר. </td></tr><tr><td> 35 מנות תרבות רקמות מ&quot;מ </td><td> בז </td><td> 353001 </td><td> צלחות ללא רקמת התרבות שטופלה יכולות לשמש גם. </td></tr><tr><td> 50 מנות microwell קוטר המ&quot;מ </td><td> מאטק תאגיד </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> מסננים הממברנה מסלול-Etch Nuclepore </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> קוטר מ&quot;מ 13, גודל נקבובי 0.1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield </td><td> Carl Zeiss, ארה&quot;ב </td><td> Axio אובזרוור Z1 </td><td> כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי (זקוף, אניnverted או ביתור מיקרוסקופ סטריאו) ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ביטוי של GFP בהגדלה נמוכה עם מצלמה דיגיטלית מצורפת. </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ confocal </td><td> Microsystems היקה </td><td> TCS SP5 </td><td> מיקרוסקופיה confocal יש צורך לראות מבנים ניידים מפורטים. כל confocal מיקרוסקופ ניתן להשתמש. </td></tr><tr><td> עכברי מתוזמן בהריון נשים, מתח CD-1 או ICR </td><td> צ&#39;ארלס ריבר מעבדות </td><td></td><td> עוברים נקצרים ביום 13 (עם היום של גילוי תוסף המיועד כיום 0). </td></tr><tr><td> להב אזמל # 11 </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> ידית אזמל # 3 </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> דומון # 5 סגסוגת מלקחי inox, 0.05 X 0.02mm </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11252-20 </td><td> אידיאלי לקציר בלוטות מעוברים </td></tr><tr><td&gt; דומון # 5 סגסוגת מלקחי dumostar, 0.05 X 0.01mm </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11295-20 </td><td> טיפי גלם דרושים להסרת mesenchyme מהאפיתל. מחטי טונגסטן יכולים לשמש גם. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלה 2. ציוד המשמש בSMG פרוטוקול רקומבינציה. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

מסעף המורפוגנזה מתרחש במהלך ההתפתחות של איברים רבים, ובלוטת הלסת התחתונה העכבר העוברית (SMG) היא מודל קלסי ללימוד הסתעפות המורפוגנזה. בSMG פיתוח, תהליך זה כרוך איטרטיבי צעדים של ניצן אפיתל והיווצרות דביקה, סופו של דבר לתת לעלייה לרשת מסועפת של acini מורכבת וצינורות, המשמשת לייצור ולשנות / להעביר את הרוק, בהתאמה, לחלל הפה 1 - 3. קרום אפיתל הקשורים למרתף וההיבטים של תא mesenchymal, כוללים תאי mesenchyme, גורמי גדילה והתאי, המיוצרים על ידי תאים אלה, הם קריטיים למנגנון ההסתעפות, למרות כמה האירועים התאיים ומולקולריים מתואמים נשאר הבינו היטב 4 . המחקר של המנגנונים המולקולריים נהיגת התקדמות המורפוגנזה אפיתל הבנת מנגנוני התפתחות שלנו ומספק תובנה regener האפשריגישות רפואה ative. מחקרים כאלה כבר הקשו בשל העדר השיטות יעילות למניפולציה גנטית של האפיתל הרוק. נכון לעכשיו, תמרת adenoviral מייצגת את השיטה היעילה ביותר להכוונת תאי אפיתל בבלוטות למבוגרות in vivo 5. עם זאת, בexplants העוברי, mesenchyme צפוף וקרום המרתף המקיף את תאי האפיתל מונעים גישה נגיפית לתאי האפיתל. אם mesenchyme מוסר, האפיתל ניתן transfected באמצעות adenoviruses, ויסודות אפיתל יכולים לחדש את הסתעפות המורפוגנזה בנוכחות Matrigel או laminin-111 6,7. צמיחת הגמד אפיתל mesenchyme ללא דורשת גם תוספת נוספת עם גורמי גדילה מסיסים ולא לסכם המורפוגנזה הסתעפות באופן מלא כפי שהוא מתרחש בבלוטות שלמות 8. כאן אנו מתארים טכניקה המאפשרת תמרת adenoviral של תאי האפיתל והתרבות של דואר transfectedpithelium עם mesenchyme המשויך. בעקבות microdissection של SMGs העוברי, הסרת mesenchyme והזיהומים נגיפיים של האפיתל עם אדנווירוס GFP המכיל, אנו מראים כי האפיתל משלב מחדש באופן ספונטני עם mesenchyme הנגוע, משחזר מבנה בלוטות SMG שלם ומסועף המורפוגנזה. אוכלוסיית תאי אפיתל המהונדס גנטי ניתן לפקח בקלות באמצעות שיטות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגילות, אם תייג-fluorescently מבני adenoviral משמשים. שיטת רקומבינציה הרקמות המתוארות כאן היא כיום השיטה היעילה והנגישה ביותר לtransfection של תאי האפיתל עם וקטור פראי סוג או מוטציה בתוך מבנה רקמת 3D מורכב שאינו דורש דור של בעלי חיים מהונדסים.

הזרימה של צעדי הניסוי המרכזיים מתוארת באיור 1. דוגמה של SMG שלם, גמד אפיתל מבודד, וmesenchyme המקביל שלה מוצגת באיור 2. תמונות של brightfield SMGs מורכב, שממשיך לעבור הסתעפות המורפוגנזה כאשר vivo לשעבר תרבותי לזמנים שצוינו, המוצגים באיור 3. בלוטות recombined ...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures at JoVE.com

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

טכניקה גנטית כדי לתמרן בתוך כל תאי האפיתל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בלוטות תרבית עוברית של עכברי לסת תחתונה (SMGs) באמצעות העברת גנים נגיפית מתוארות. שיטה זו מנצלת את היכולת המולדת של SMG האפיתל וmesenchyme ספונטני לrecombine לאחר פרידה וזיהום של יסודות אפיתל עם וקטורי adenoviral.

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  University at Albany, SUNY. טכניקה גנטית כדי לתמרן בתוך כל תאי האפיתל Vivo לשעבר בלוטות תרבית עוברית של עכברי לסת תחתונה (SMGs) באמצעות העברת גנים נגיפית מתוארות. שיטה זו מנצלת את היכולת המולדת של SMG האפיתל וmesenchyme ספונטני לrecombine לאחר פרידה וזיהום של יסודות אפיתל עם וקטורי adenoviral.

Video: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissection של בלוטות הרוק midgut ו מ AE. aegypti יתושים

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...