יצירת מודלים תאיים ראשוניים או מבנים דמויי אורגנואידים היא המפתח למענה על שאלות עכשוויות רבות בביולוגיה. לדוגמה, אנחנו כבר מעוניינים די הרבה זמן במנגנונים המשמשים וירוסים אנושיים כדי להקל על שכפול בלוטת הרוק כפי שהוא אתר חשוב עבור שידור אופקי. התפתחות המערכת המבוססת על סאליספרה המתוארת בפרוטוקול זה היא התקדמות מכרעת במסענו לענות על שאלות מסוג זה.
טכניקה זו מאפשרת לנו ליצור תאים ראשוניים ממגוון דגימות מטופלים שונות. המודלים התאיים מזכירים יותר את מצב סוג in vivo מכיוון שהתאים אינם מודלים או משתנים כמו סוגי תאים רבים הנפוצים לניסויים במבחנה. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי ליצור תאים דומים מהבלוטות התת-ראשיות של העכבר והפרוטוקול עשוי להיות שימושי עבור איברים אחרים עם מבנים תאיים דומים.
בתוך שעתיים עד ארבע שעות לאחר הסרת המטופל, על צלחת תרבות, להשתמש autoclaved מעוקרים ניתוח מספריים מלקחיים כירורגיים כדי לטחון את רקמת בלוטת הרוק לחתיכות בסדר בגודל של אחד עד שני מילימטרים. הוסף שישה מיליליטר של פתרון Dispase / קולגן לרקמה טחונה. ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ 30 דקות עד שעה אחת.
לשבש את הרקמה על ידי צינורות עם פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר 15 עד 20 פעמים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לעוד 30 דקות עד שעה. חזור על שלב הצינור וההדרה פעמיים עד שלוש פעמים נוספות או עד שהרקמות דומות לתסרקה והוא יכול לעבור בקלות דרך פתח הפיפסה.
כדי לצפות בארות עם BMM, לאט פיפטה 500 microliters של BMM מופשר לילה לתוך כל באר של צלחת שש באר. לאט מערבלים את הצלחת כדי להפיץ באופן שווה את ה- BMM מעל הבארות. לאחר מכן הדגירה את הצלחות מצופה ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות לפני השימוש כדי לאפשר BMM להתגבש.
ראשית, להעביר את הפתרון Dispase / קולגנס המכיל רקמה הומוגנית לצינור חרוט 15 מיליליטר. לשטוף את הקיר של הצלחת פעם אחת עם שישה מיליליטר של DPBS להעביר את התאים הנותרים לתוך הצינור חרוט. לאחר מכן, באמצעות מסננת תאי רשת ניילון 70 מיקרומטר, לסנן את homogenate לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר כדי להסיר רקמה מעוכל.
תאים מתוחים צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי. לאחר מכן בצע שימוש חוזר את גלולת התא ב- 10 מיליליטר של מאגר תות 1X RBC.
דגירה במשך חמש דקות ב37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו 20 עד 25 מיליליטר של DPBS כדי לנטרל את מאגר התסיסה RBC ולמזער תזה של תאי רוק. צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g.
גלולת תא לבן מצביעה על תזה מלאה של כל RBC. אם גלולה יש צבע אדום, טיפול חוזר עם חיץ תזה RBC. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור באחד עד שני מיליליטר של BEGM ולאחר מכן העברו את התאים המתווסכים לעל בארות מצופות BMM.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר צפוי על BMM, תאים ייווצרים לתוך מבנים כדוריים או salispheres על פני תקופה של יומיים עד שלושה ימים. תאים יכולים להישמר כמו salispheres במשך כחמישה עד שבעה ימים לפני BMM מתחיל להשפיל המאפשר לתאים לגשת לדבוק פלסטיק לגדול כמו monolayer.
ראשית, שאפו את המדיה מה בארות והוסיפו מיליליטר אחד של פתרון Dispase/Collagenase לכל באר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ 15 דקות או עד BMM יש בעיקר נמס. ואז להעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר ולשטוף בארות פעם אחת עם אחד עד שלושה מיליליטר של DPBS כדי להשיג את התאים הנותרים.
צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את גלולת הכדור בשני מיליליטר של טריפסין. דגירה שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
לאחר מכן, הוסף לצינור כל מדיה מלאה המכילה 10%serum כדי לנטרל את טריפסין. צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאפו את העל-טבעי כדי להסיר שאריות מדיה, טריפסין וסרום ולאחר מכן בצעו שימוש חוזר בתאים ב- DPBS.
צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את גלולת הכדור ב- BEGM. כדי לשמור על גלולה כמו כדורים, צלחת התאים המתוחזקים על מנות תרבות מצופה BMM מוצק.
תרבות כל התאים באינקובטור לח מתוחזק ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך חמישה עד שבעה ימים לפני תת תרבות. להאכיל עם BEGM טרי כל יומיים עד שלושה ימים. כדי להתרבות התאים כמו monolayer על כלי תרבות פלסטיק, שאפו את התקשורת BEGM מן המנה לשטוף פעם אחת עם DBPS כדי להסיר מדיה שיורית.
מוסיפים שני מיליליטר של טריפסין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או עד התאים מנותקים לחלוטין. לנטרל טריפסין באמצעות ארבעה מיליליטר של כל מדיה מלאה המכילה 10%serum. לאחר מכן להטות בעדינות את המנה ולהעביר תאים לצינור חרוט 15 מיליליטר.
לשטוף את הצלחת פעם אחת עם כחמישה מיליליטר של DPBS כדי לאסוף את התאים הנותרים. צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי.
כדי להסיר מדיה שיורית, המתן מחדש תאים בשישה עד עשרה מיליליטר של DPBS. צנטריפוגה לחמש דקות ב 500 פעמים g. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש ב-BEGM.
ואז צלחת התאים על מנות תרבות רקמת פלסטיק מטופלים. תרבות התאים באינקובטור לח מתוחזק ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך חמישה עד שבעה ימים לפני תת תרבות. להאכיל עם BEGM טרי כל יומיים עד שלושה ימים.
בפרוטוקול זה, לאחר ציפוי תאים מן הרקמה מתעכל על BMM במשך יומיים עד שלושה ימים, תאים בקלות יצרו אשכולות קטנים שהמשיכו להתרחב בגודל של עד 15 עד 20 תאים לכל אשכול. תאים Salisphere היו מצופים על תאים מתורבתים שטופלו פלסטיק וגדל כמו monolayer שבו הם מפגינים מורפולוגיה עולה בקנה אחד עם תאים ממוצא אפיתל. יש צורך בטכניקה וטיפול אספטיים נאותים כדי למנוע זיהום חיידקי או פטרייתי.
שום כמות של אנטיביוטיקה או תרופות אנטי-מיקוטיות לא תציל תרבות שורצת חיידקים. אנחנו עונים על שאלות על פתוגנזה ויראלית והעברת. אבל עבור אחרים, זה מספק דרך ללמוד תאים הרוק האנושי עבור כל מספר של יישומים כגון טיפולים התחדשות רקמות.
עבורנו שחוקרים ציטוםגלווירוס אנושי, טכניקה זו אפשרה לנו להתחיל לחקור את המנגנונים המולקולריים שהנגיף משתמש בהם כדי להדביק ובסופו של דבר להעביר למארחים חדשים. שום דבר המשמש בפרוטוקול זה הוא מסוכן מטבעו, אבל זהירות תמיד צריך להילקח בעת טיפול ברקמה אנושית וכל סוג של רייגנטים כימיים.
