פרוטוקול זה מאפשר הערכה של אינטראקציות בין תאים לתאים בין סוגי תאים מגוונים בתוך רקמה, ומניפולציות מולקולריות ופרמקולוגיות אקס ויוו שיהיו פחות ריאליות ב- vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא פרק הזמן הממושך קטעי רקמות אלה יכולים להישמר בתרבות המאפשרת את הערכתם בנקודות זמן מאוחרות יותר. טכניקה זו תאפשר סינון מהיר יותר של תרכובות טיפוליות כדי לתקן נזק בלוטת הרוק צפוי להפחית את מספר העכברים המשמשים למחקרים אלה.
אנו מתכננים להשתמש בטכניקה זו כדי להבין את תגובת בלוטת הרוק להקרנות בנקודות זמן ביניים ולהדליק ולכבות גנים במרווחים ספציפיים. ההיבט הקשה ביותר של הליך זה הוא חתך הרקמה ומניעת אובדן מקטעי רקמות במהלך צעדי התרבות והכתמת. לפני תחילת ההליך לחטא את רכיבי רטט להסרה עם 70%אתנול, ואחריו עיקור UV לפחות 30 דקות.
אבטחו יריעה נוספת של סרט מעבדה מעל מגש החיץ כדי למנוע מקרח ליפול פנימה, ומלאו את תא הקרח בקרח כתוש. הסירו את סרט המעבדה ממגש החיץ ומלאו את מגש החיץ ב-100 מיליליטר של PBS קר כקרח בתוספת 1%פניצילין סטרפטומיצין אמפיצילין, או PSA. לאחר מכן הנח סכין גילוח מפלדת אל-חלד לתוך מחזיק הלהב ולהשתמש במברג כדי להקל על התאמת זווית הלהב.
לאחר בידוד בלוטות הרוק, מניחים את הרקמה שנקטפו לתוך צלחת תרבות סטרילית 30 מילימטר המכיל שני מיליליטר של PBS קר כקרח בתוספת 1%PSA. באמצעות מלקחיים autoclaved, להעביר את הבלוטות לתחתית עובש הטבעה לכסות את הרקמה עם נוזלי 3% נקודת התכה נמוכה התעוררה. באמצעות מדפים, להתאים את הרקמה לאמצע הבלוק במישור המתאים, ול מניחים את גוש אגרוז על קרח במשך 10 דקות.
כאשר agarose התקשה, בזהירות להפעיל סכין גילוח סביב הקצה החיצוני של התבנית ולתת את הבלוק להחליק החוצה על סרט מעבדה מעוקר UV. השתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך תיבת אגרוז המכילה את בלוטת הרוק, דואג כי המישור של החלק הוא ישר ומקביל לצד הנגדי של הבלוק. השתמש בדבק-על כדי לחבר את הבלוק למשטח החיתוך ולקבל חלקים בעובי 50 או 90 מיקרומטר על הרטט במהירות של 0.075 מילימטר לשנייה בתדר של 100 הרץ.
לאחר מכן השתמשו במברשת שיער טבעית אוטוקלאבת כדי להעביר את החלקים לתוך בארות בודדות של 24 תבשיל תרבות רקמות היטב המכיל מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לכל כפי שהם מתקבלים. כאשר כל החלקים נרכשו, להשתמש ומרית מיקרו autoclaved להעביר את החלקים לתוך בודדים 0.4 מיקרומטר לשפוך ממברנה בגודל מוסיף בכל באר של צלחת תרבות רקמה 24 היטב המכיל 300 microliters של תרבות רטט בינוני לגם. לאחר מכן מניחים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס וחממת פחמן דו-חמצני עם לחות, מרעננים את המדיום בתחתית כל באר ומוסיפים 40 מיקרוליטרים של מדיום לממברנה מדי יומיים לפי הצורך עד 30 יום.
כדי להקרין את הרקמות, להעביר את החלקים למתקן הקרנה במיכל קלקר מכוסה, כדי למנוע תנודות בטמפרטורה ולטפל בסעיפים עם מנה אחת של חמש כיתה של קרינה. ואז להחזיר את התרבויות לאיבה תרבות רקמה בטוחה קרינה. עבור כתמי נוגדנים של חלקי הרקמה, לשטוף את הדגימות עם לפחות שתי חמש דקות שטיפות PBS סטרילי לתקן את החלקים ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס לילה.
למחרת בבוקר לשטוף את הקטעים שלוש פעמים עם PBS בתוספת אלבומין סרום 1%bovine ו 0.1% טריטון X-100, או PBT, לפני permeabilizing את הרקמות עם 0.3% טריטון X-100 ב PBS במשך 30 דקות. שטפו את החלקים שלוש פעמים ב- PBT כפי שהוכח לפני חסימת כל כריכה לא ספציפית עם סוכן חסימה בתוספת 1% סרום עזים רגיל במשך שעה אחת. ואז לה הדגירה את החלקים לילה בנוגדן העיקרי המתאים של עניין.
תמונות מיקרוסקופ שדה בהיר של תרבויות ראשיות של בלוטת הרוק 2D לחשוף את נוכחותם של רקמות קיימא עד 30 ימים של תרבות תחת כל הריכוזים של תוספת סרום נבדק. היכולת המשגשגת של פרוסות מתורבתות מייצגות אלה הוערכה על ידי Ki-67 immunostaining וסמן זה נצפה בכל נקודות הזמן שהוערכו. רמה נמוכה של תאים חיוביים Cleaved Caspase-3 נצפתה גם בכל נקודות הזמן עם עלייה קטנה זוהה ביום 30.
כתמי E-cadherin נצפו הן פרוסות בלוטת תת-מנדביאר ו parotid לאורך כל תקופת התרבות 30 יום. תאים חלקים וחיוביים לאקטין שרירים וארגון ציטוסקלטל זוהו ברמות דומות לאורך כל תקופת התרבות. באופן דומה, חלבונים פונקציונליים כגון עמילאז ואקוופורין-5 זוהו גם הם, אם כי ביום 14 הכתמים נראו גרגיריים יותר.
לעומת זאת, CD31 ו- TUBB3 לא באו לידי ביטוי באופן עקבי לאורך כל תקופת התרבות בשתי הבלוטות, דבר המצביע על כך שיש מגוון של מרכיבי רקמות המתוחזקים לפרקי זמן שונים לאורך כל תקופת התרבות של 30 יום. פרוסות מוקרנות בשתי הבלוטות חיקו שינויים אפופטיים וציטוסקלים דומים שנצפו ב-vivo. היזהר בעת הזזת החלקים מהאמבטיה PBS ברטט לצלחת התרבות ובמהלך הליכי הכתם כמו החלקים קטנים ועדינים.
תרבויות סעיף ניתן לטפל עם רוב שיטות תרבות קו התא עם היתרון הנוסף של להיות בתנאים הקשורים יותר in vivo. אנו צופים כי זו תהיה טכניקה רבת עוצמה עבור חוקרים אחרים לשלב בניסויים שלהם. הלהב על הרטט הוא חד והוא יכול להיות קשה להכניס כדי להיות קשה בעת הטיפול.
גם לצבוע כחול trypan הוא רעיל ומסרטן אז בצע את כל ההנחיות PP.
