עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהלאומיים למדע והנדסת מועצת המחקר של קנדה לXAC וAFP

1. הכנת חומרים להפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע רקמות תרבות על coverslips חומצה טופלה ללפחות יום אחד לפני הניסוי. אנו משתמשים COS-7 או U2OS, כשתי שורות תאים אלה מפגינים ייצור חזק של חלבון מופרש ויש ER מוגדר היטב. שים לב שעל מנת להשיג יעילות שאיבה גבוהה, תאים לא יעלו על 80% confluency על coverslip ביום של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם mRNA אקסוגני מסוים נחקר, תאים transfected יום אחד לאחר זריעה עם פלסמידים המכילים את הגן של עניין תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים transfection. התאים אז מותר להביע mRNA ללפחות 18 שעות לפני השאיבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאים עם מעכבי תרגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את ההשפעה של ריבוזומים שלמים על התחזוקה של mRNAs קשר עם חדר המיון, תאים יכולים להיות מטופלים עם מעכבי תרגום שמשבשים את הקשרשל הריבוזומים עם mRNA 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבים של ייזום תרגום, כגון homoharringtonin (HHT), pactamycin, או 2 - (4-methyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (mdmp), למנוע הריבוזומים חדשים מלהתרועע עם התמליל ובמקביל מאפשרים הריבוזומים מאורסת להשלים תרגום 12-14. הואיל ושיעור התרגום עבור רוב החלבונים בתאי יונקים הם 5 חומצות אמינו לשנייה, ללא קשר לשימוש או קודון אורך mRNA 15, טיפול של 30 דקות צריך לנקות את הריבוזומים של הודעות עם מסגרות קריאה פתוחות כל עוד 27,000 נוקלאוטידים (קידוד לחלבונים כל עוד 9000 חומצות אמינו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבים כגון puromycin לקדם את הפליטה המוקדמת של הרשת המתהווה וכך לשבש את 12 polysomes. עם זאת כדי לשבש את הקשר של הריבוזומים puromycin טופלו-עם mRNA לחלוטין, chelators מגנזיום כגון EDTA יש להוסיף למאגר חילוץ digitonin 11. </li> &lt;li&gt; בניסוי זה, תאים שטופלו בpuromycin 200 מיקרומטר, HHT 5 מיקרומטר, או בינוני שליטה למשך 30 דקות לפני החילוץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר החילוץ Digitonin. כדי להמחיש mRNAs ER-מקומי ללא ההתערבות של תמלילים חופשיים (כלומר, שאינם cytoplasmic ER-קשורים), אנו סלקטיבי permeabilize תא עם digitonin, glycoside סטרואידים כי אינטראקציה מועדפת עם 3β-hydroxysterols. בריכוזים נמוכים, digitonin סלקטיבי permeabilizes חלקים של קרום הפלזמה, גורם &quot;דליפות&quot; 16. לעומת זאת, קרום ER ומעטפת גרעין, שהם עניים בכולסטרול, נותרים ללא פגע 16,17. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבקת Digitonin (סיגמה אולדריץ) מומסת במים מזוקקים במשקל 5% / נפח ופתרון שהמנייה הזאת aliquoted לנפחים קטנים ומאוחסנת ב-20 ° C. מניסיוננו, מחזורים רבים בהקפאת הפשרה מקטינים את היעילות של digitonin המומס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון של מנייהחיץ CHO 10x (1x ריכוז עובד פתרון: 115 המ&quot;מ כץ, 25 מ&quot;מ HEPES pH 7.4, 2.5 המ&quot;מ MgCl 2, 2 המ&quot;מ EGTA וסוכרוז mM 150) מוכן עם חומרים כימיים RNase-חופשי ומאוחסן ב -20 ° C. פתרון עובד (1x CHO חיץ) הוא הוכן על ידי דילול פתרון המניות עם מי RNase חינם וניתן לאחסן ב 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. הפקת Digitonin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרוני חילוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק חימום עם משטח שטוח הוא שחומם מראש ל 40 מעלות צלזיוס, ונשמר בטמפרטורה זו במהלך לחילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור משטח עבודה שטוח שהוא RNase חופשי, בלוק החימום טבול במעט מים ומצופים בחתיכה טרייה של parafilm M (חברת Bemis, Inc). בועות אוויר בין גיליון parafilm ובלוק חימום הנן החליקה החוצה באמצעות כפפות RNase-חופשיות וkimwipes (VWR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x CHO החיץ מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ידי דוגר באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות 6-גם משמשות כדי לשטוףולתקן תאים. כל שורה של 3 בארות משמשת לכיסוי 1 להחליק. לשתי הבארות הראשונות בשורה, 2 מ&quot;ל של חיץ CHO התחמם הוא הוסיף. כדי גם האחרון, 2 מ&quot;ל של תמיסת הקיבוע (PBS paraformaldehyde + 4% (מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים)) הוא הוסיף. מגש זה יכול להיות מאוחסן ב37 המעלות צלזיוס החממה עד שהתאים מוכנים להפקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון החילוץ Digitonin הוא הוכן על ידי דילול פתרון digitonin המניות כדי 0.025% עם חיץ CHO חם רק לפני שימוש. שוב, שים לב שתאים לpuromycin טופל, חיץ החילוץ חייב בנוסף מכיל 20 המ&quot;מימ EDTA יעילות לשבש הריבוזומים 11. טיפין של 100 μl של פתרון החילוץ מונחות על בלוק החימום parafilm המכוסה מייד לפני החילוץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת Digitonin וקיבוע סלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסיר את התאים מ37 המעלות צלזיוס החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתהליך החילוץ, coverslips הוא מניפולציה בעזרת המלקחיים של jewler. עםהמלקחיים להרים את coverslip וטובלים אותו הראשון ולאחר מכן השני גם מכיל מאגר CHO לשטוף את מדיום הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר למחוק את החיץ עודף מהצד האחורי של coverslip עם kimwipe ולמקם את coverslip, צד התא פונה כלפי מטה, על פתרון החילוץ באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 שניות, להרים את coverslip עם המלקחיים ולהעביר אותו באופן מיידי, בצד תא פונה כלפי מעלה, לרווחת המכיל 4% חיץ הקיבוע paraformaldehyde. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן לדגור במדגם מייצב ללפחות 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי בקרה Unextracted. כדי לקבוע את הסכום הכולל של ה-mRNA בציטופלסמה זה רעיון טוב כדי להכין את מדגם שליטת unextracted. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים שגודלו בcoverslips מוכנים כאמורים לעיל (ראה סעיף 2.2), אלא ששלב חילוץ digitonin (2.2.3) הוא דלג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, תאים בלתי חולצו צריכים להיות permeabilized ב PBS + טריטון 0.1%X-100 במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol></li></ol> 3. כתמי דגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב בדיקות עבור פלואורסצנטי כלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצף הראשוני של mRNA של עניין מקופל באמצעות תוכנת רנ&quot;א משנית מבנה חיזוי, כגון RNAstructure 5.0 18. קפלי mRNA מוערכים חזותי לזיהוי אזור של כ 50 נוקלאוטידים שהוא ללא מבנים משניים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשלמה ההפוכה של אזור זה היא מסונתז עם Alexa546 fluorophore המחובר בקצה 5 &#39;של החללית (שנרכש מטכנולוגיות DNA משולבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החללית מדוללת במי RNase חינם לריכוז מניות של 100 מיקרומטר שניתן לאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתמה עם בדיקות FISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב שלמרות שהתאים digitonin-חולצו אינם דורשים permeabilization נוסף, טיפול בדגימות אלה קבועים עם 2 מ&quot;ל של 0.1% טריטון X-100 בדילולPBS במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר לפני צביעת דגים, עוזר להפחית את אות הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את השקופיות אז נשטפות פעמים עם PBS להסיר כל paraformaldehyde שייר או טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים אז נשטפים פעמים עם פוראמיד 25% עד 60% במאגר ציטראט נתרן 1X (150 mM NaCl וציטרט הנתרן mM 15). באופן כללי, לבדיקות דגים ספציפיות שהם 50-60 נוקלאוטידים אורך, פוראמיד 60% בלבד, אך ל() הכתמת mRNA פולי עם חללית Oligo (dT) דגים, ברמה של פוראמיד מופחת עד 25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את החדר המכתים, תחתית צלחת פטרי 150 מ&quot;מ מכוסית במים ופיסת parafilm הוא צפה על פני המים. המים מוסרים על ידי הסיבוב מעל הצלחת, ובכך מאפשרים parafilm לדבוק בתחתית הצלחת. בועות אוויר יוסרו באופן ידני עם kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל coverslip להיות מוכתם, פיפטה μl 100 ירידה של פתרון ההכלאה המכיל דגי חללית של ריבית על השוויafilm בתא המכתים. בדיקת FISH המנייה מדוללת עם פוראמיד 25% עד 60% במאגר ההכלאה (1x SSC, 100 מ&quot;ג / המ&quot;ל dextran סולפט, 1 מ&quot;ג / מיליליטר השמרים tRNA, מורכב riboside vanadyl 5mm, פוראמיד 25-60%) לריכוז עבודה של 0.2 מיקרומטר. שים לב שכמות פוראמיד צריכה להיות מותאמת לבדיקה מסוימת בשימוש, והוא נוכח באותו הריכוז כמו בחיץ לשטוף SSC (ראה שלב 3.3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip מונח בפני צד תא למטה, אל פתרון הדגים בתא המכתים וטופח ל5-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified כגון רקמת תרבות חממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה והרכבת הדגימות המוכתמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את אזור רחצה חופשיה RNase, נשכבה רצועת parafilm על משטח שטוח ברמה, כגון שולחן מעבדה. כדי להבטיח שparafilm הוא שטוח ורטוב המשטח ישר, הנח parafilm על גבי ולהסיר באופן ידני את כל בועות אוויר עם kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקאמרי הוא המכתיםהוסר מהחממה ומונח על משטח שטוח ברמה. את coverslips מכן רחף על ידי pipetting כ 500 μl של חיץ לשטוף דגים ליד הקצה של כל coverslip. הפתרון יוצג ב- בין coverslip וparafilm באמצעות פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל coverslip, 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף (1x SCC עם פוראמיד 25-60%, ראה שלב 3.3.3) הוא pipetted על parafilm אזור הכביסה (ראה שלב 3.4.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, את coverslips יוסרו מהתא המכתים וכל אחד ממוקם על הירידה של חיץ לשטוף והדגרה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. תהליך הכביסה חוזר 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות זכוכית נשטפות עם אתנול 70%, ומיובשים בkimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל coverslip, 25 μl של פתרון תלייה (DAPI Fluoromount G, הדרום יוטק) היא pipetted לשקופית. שים לב שפתרון זה מכיל 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ה-DNA שכתמים ומאפשר הדמיה של גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> USIמלקחיים וkimwipes ng, החלק האחוריים של coverslip הם מיובשים וחיץ לשטוף דגים עודף נמחק בלי ייבוש המדגם. אז כל coverslip ממוקם צד תא פונה כלפי מטה, על הירידה של פתרון גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות רכובות מסומנות ויכולות להיות חנות ב 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. הדמיה וכימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ epifluorescence משמש לתמונת התאים הבאים מכתים דגים. תא transfected יכול להיות מובחן מתאי untransfected ידי אות פלואורסצנציה בהירה בערוץ המתאים. באופן אידיאלי, כל שדה שנרכש, מכיל גם תא untransfected לשמש כדי לקבוע את קרינת הרקע לכימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תמונות שדה של הדג וערוץ DAPI הם נרכשים. בנוסף, אם התאים הם שיתוף צבעוניים עם סמנים חלבוניים, תמונה של ערוץ immunofluorescence גם רכשה. שימו לב שחילוץ digitonin יכול לשמש גםכדי להמחיש הריבוזומים ER-כפותים וחלבונים 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שאת עוצמות הקרינה בין השדות ניתן להשוות, את זמן החשיפה לכל ערוץ צריך להישאר קבוע עבור כל קבוצה של ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב כדי לוודא שאת עוצמות הניאון בין התאים בcoverslips השונה ניתן להשוות, השינויים מהיום ליום בעוצמת epiluminescence או ריקבון באות הדג צריכים להיות ממוזערים על ידי הדמיה את כל coverslips בפגישה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות. כדי לכמת את הכמות של mRNA שהוא מקומית בחדר המיון, אנחנו משתמשים בתוכנת אלמנט ש&quot;ח ניקון. עם זאת תוכנת ניתוח תמונה אחרת כגון ImageJ ניתן להשתמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי ניקון ש&quot;ח אלמנט תמונת הניתוח, פריפרית התא ואת הגרעין מתואר כאזור נפרד של תחומי עניין (Rois). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל החזר על השקעה, עוצמת הניאון (אני T לעצמת התא המוחלטת, ואני N כדיעצמה גרעינית) והאזור (T ו N) נרשמות ומיוצאות לגיליון Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תמונה, עוצמת ניאון הרקע (אני B) נקבעה על ידי הקלטת האינטנסיביות של תאים לא transfected. אם (A) רמות ה-mRNA פולי הם נתחו, אזור תא חינם נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסכום הכולל של חדר מיון (בתאים שחולצו) או cytoplasmic (בתאי unextracted) פלואורסצנטי מחושב על ידי הנוסחא: [ט] [אני לא - אני B] - [N] [N - אני B] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העוצמת המכתימה הגרעינית גם ניתן לחשב ומשמשת כבקרה פנימית בין טיפולים שונים. מאז גרעינים אינם מושפעים מטיפול digitonin 17 או שיבוש הריבוזום 11, הסכום של mRNA הגרעיני צריך להישאר קבוע בין כל אחד מטיפולים אלה. כדי לחשב פלואורסצנטי הגרעיני הנוסחא הבאה משמשת: [N] [N - אניB] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האחוזים של mRNA cytoplasmic שהוא ER-ממוקד יכולים להיות מחושבים על ידי לקיחה את הקרינה הממוצעת ER של תאים חולצו 30-40 (ראה 4.2.4) מחולקת בפלואורסצנטי cytoplasmic הממוצע מתאי unextracted 30-40 (שוב ראה 4.2.4) . זה קריטי, כי התאים שחולצו וunextracted מוכנים, מוכתמים וצלמו במקביל. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+(SRP)+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li><li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+(SRP)+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li><li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation.">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li><li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane.">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li><li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells:+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes.">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li><li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts.">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li><li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver.">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li><li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation.">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li><li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+poly+A(+)+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes.">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li><li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes.">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li><li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum.">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).</li><li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+ribosome+functions.">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li><li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine.">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li><li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li><li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes.">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li><li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors.">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization.">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li><li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection.">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387 (2010).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הלוקליזציה של mRNAs לאתרי subcellular שונים, באמצעות האינטראקציה של תמלילים עם חלבוני לוקליזציה mRNA, היא תופעה נפוצה חשובה למיון הנכון של חלבונים ליעד הסופי שלהם, ולכוונון העדין של ביטוי גנים לדרישות המקומיות של subcellular אזור 19,20. באמ?...

באאוקריוטים, קידוד ה-mRNA מופרש וחלבוני קרום יכולים להיות ממוקדים לחדר מיון השיתוף translationally ידי 1,2 חלקיק הכרת האות ואפשר לקיים ER דרך האינטראקציות הישירות בין הריבוזומים וtranslocons במהלך תרגום 3,4. עם זאת, האם יכול להיות ממוקד mRNAs ומתוחזק על ER העצמאי או הריבוזומים או תרגום לא היה ברור עד לאחרונה. מחקרים קודמים ניסו לענות האם יש קשר תרגום עצמאי mRNA עם ER באמצעות טכניקות חלוקה תאיות. בגלל תנאים כימיים קשים נדרשו לנתק את הריבוזומים משלפוחית ​​ER נגזר, שעשוי לשבש את ה-mRNA-ER העדינה פוטנציאלי העמותה, מחקרים אלה לא היו חד משמעיים, הוכחה ל5-8 ונגד 9,10 עיגון ריבוזומלי עצמאי של mRNA לחדר המיון . כדי להתגבר על בעיות אלו פתחנו פרוטוcol לבודד ותמונה mRNAs ER-כפות. הליך זה כרוך טיפול חילוץ קל, שמסיר ביעילות את כל תוכן cytoplasmic של התא (כולל mRNAs אינו ER-כפות) תוך שמירה על מורפולוגיה ER וכל המולקולות הקשורים אליו. באמצעות פרוטוקול זה אנו מראים כי קבוצת משנה של mRNAs ממוקדות ולאחר מכן שמרה על חדר המיון באופן עצמאי או תרגום של הריבוזומים 11.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

באאוקריוטים, רוב RNAs השליח (mRNAs) המקודדים מופרשת והחלבונים בממברנה מותאמת לשפה מקומיים על פני השטח של reticulum endoplasmic (ER). עם זאת, להדמיה של mRNAs אלה יכול להיות מאתגרות. זה נכון במיוחד כאשר רק חלק קטן מן mRNA הוא ER-משויך והפצתם לאברון זה הנה חסום על ידי תמלילים שאינם ממוקדים (כלומר &quot;חופשי&quot;). על מנת לפקח mRNAs ER-נלווה, פתח שיטה שבה תאי מטופלים עם חשיפה קצרה לפתרון חילוץ digitonin כי סלקטיבי permeabilizes קרום הפלזמה, ובכך מסיר את תוכן cytoplasmic, תוך שמירה על שלמות ER . כאשר שיטה זו היא בשילוב עם ניאון כלאה באתר (FISH), אפשר לחזות באופן ברור mRNAs ER-כפות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באמצעות פרוטוקול זה המידה של ER-עמותה לאו תעתיקי תפזורת פולי () או mRNAs הספציפי ניתן להעריךואפילו לכימות. בתהליך, אפשר להשתמש בבדיקה זו כדי לחקור את טבעו של אינטראקציות mRNA-ER.

כדי לקבוע את האחוז של mRNA שהוא ER-משויך, COS-7 תאים שtransfected עם פלסמידים שהכילו phosphatase אלקליין השליה (ALPP) או ציטוכרום P450-8B1 (CYP8B1) היה או חילוץ עם digitonin ולאחר מכן קבוע, או ישירות קבוע (ראה תרשים 1, להשוות &quot;Unextracted Ctrl&quot; כדי &quot;לשלוף Ctrl&quot;). פלואורסצנטי לא גרעינ?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells at JoVE.com

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי הניאון<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לזהות או פולי תפזורת () mRNA או תעתיקים ספציפיים.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

visualization-endoplasmic-reticulum-localized-mrnas-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  University of Toronto. כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי הניאון באתר הכלאה לזהות או פולי תפזורת () mRNA או תעתיקים ספציפיים.

Video: Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Speed

Subtitles

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים