Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Science and Engineering Research Council of Canada a XAC e AFP

1. Preparazione dei materiali per l&#39;estrazione <ol><li> Preparazione delle cellule <ol><li> Seed coltura cellule del tessuto su vetrini trattati con acido per almeno un giorno prima dell&#39;esperimento. Usiamo COS-7 o U2OS, come queste due linee cellulari esporre robusta produzione di proteina secreta e hanno un ben definito ER. Si noti che per ottenere elevata efficienza di estrazione, le cellule non deve superare il 80% di confluenza in coprioggetto il giorno dell&#39;esperimento. </li><li> Se un mRNA particolare esogeno è indagato, le cellule vengono trasfettate un giorno dopo la semina con plasmidi contenenti il ​​gene di interesse utilizzando i protocolli di trasfezione standard. Le cellule sono poi consentito di esprimere l&#39;mRNA per almeno 18 ore prima dell&#39;estrazione. </li></ol></li><li> Trattando le cellule con inibitori di traduzione <ol><li> Per verificare l&#39;effetto di ribosomi intatti sul mantenimento di mRNA associazione con l&#39;ER, le cellule possono essere trattati con gli inibitori di traduzione che inficiano l&#39;associazionedei ribosomi con l&#39;mRNA 11. </li><li> Inibitori di inizio della traduzione, come homoharringtonin (HHT), pactamycin, o 2 - (4-metil-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (mdmp), impediscono ribosomi nuovi di associarsi trascrizione consentendo allo stesso tempo ribosomi impegnati a completare traduzione 12-14. Poiché il tasso di traduzione per la maggior parte delle proteine ​​in cellule di mammifero è 5 aminoacidi al secondo, indipendentemente dalla lunghezza o codoni dell&#39;mRNA 15, un trattamento di 30 minuti dovrebbe cancellare ribosomi off di messaggi con cornici di lettura aperte fintanto 27.000 (nucleotidi che codifica per proteine purché 9000 amminoacidi). </li><li> Inibitori come la puromicina promuovere l&#39;espulsione prematura della catena nascente e quindi interrompere polisomi 12. Tuttavia per interrompere completamente l&#39;associazione dei ribosomi puromicina-trattati con l&#39;mRNA, magnesio chelanti come EDTA deve essere aggiunto al tampone di estrazione digitonina 11. </li> &lt;li&gt; In questo esperimento, le cellule vengono trattate con 200 pM puromicina, HHT 5 pM, o mezzo di controllo per 30 minuti prima dell&#39;estrazione. </li></ol></li><li> Preparazione del tampone di estrazione Digitonin. Per visualizzare ER-localizzate mRNA senza l&#39;ostruzione di liberi (citoplasmatici, non-ER-associate) trascritti, abbiamo selettivamente permeabilize la cella con digitonina, un glicoside steroide che interagisce preferenzialmente con 3β-hydroxysterols. A basse concentrazioni, digitonina permeabilizes selettivamente porzioni della membrana plasmatica, causando &#39;leakiness&#39; 16. In contrasto, la membrana ER e involucro nucleare, che sono poveri in colesterolo, vengono lasciati intatti 16,17. <ol><li> Digitonina (Sigma Aldrich) in polvere viene disciolto in acqua distillata a 5% peso / volume e questa soluzione viene frazionato in piccole quantità e conservati a -20 ° C. Nella nostra esperienza, di congelamento-scongelamento riduce l&#39;efficienza della digitonina disciolto. </li><li> Una soluzione stock di10x tampone CHO (1x concentrazione di soluzione di lavoro: 115 mm KAC, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM MgCl 2, 2 mM EGTA e saccarosio 150 mM) viene preparato con RNase-free reagenti e conservati a -20 ° C. Una soluzione di lavoro (1x tampone CHO) viene preparata diluendo la soluzione madre con acqua priva di RNasi e può essere conservato a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Digitonin Estrazione <ol><li> Preparazione di soluzioni d&#39;estrazione <ol><li> Un blocco di riscaldamento con una superficie piana è pre-riscaldata a 40 ° C e mantenuta a questa temperatura durante l&#39;estrazione. </li><li> Per formare una superficie piana di lavoro che è RNasi libero, il blocco riscaldante viene inumidita con acqua e ricoperto con un nuovo pezzo di parafilm M (Società Bemis, Inc). Le bolle d&#39;aria tra il foglio di parafilm e il blocco riscaldamento sono appianate con RNase-free guanti e Kimwipes (VWR). </li><li> CHO 1x tampone viene riscaldato a 37 ° C mediante incubazione in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Piastre da 6 pozzetti sono usati per lavaree fissare le cellule. Ciascuna fila di tre pozzetti viene utilizzato per una copertura antiscivolo. Per i primi due pozzi nella riga, 2 ml di tampone riscaldata CHO viene aggiunto. Per l&#39;ultimo pozzetto, 2 ml di soluzione di fissazione (paraformaldeide PBS + 4% (Sciences Electron Microscope)) è aggiunto. Questo vassoio può essere memorizzato nella incubatore 37 ° C finché le cellule sono pronte per l&#39;estrazione. </li><li> Soluzione di estrazione digitonina viene preparata diluendo la soluzione digitonina magazzino a 0,025% con tampone caldo CHO appena prima dell&#39;uso. Anche in questo caso notare che per puromicina cellule trattate, il tampone di estrazione deve inoltre contenere 20 mM EDTA per interrompere in modo efficiente ribosomi 11. Gocce di 100 ml di soluzione di estrazione sono immessi sul parafilm coperto di blocco di riscaldamento immediatamente prima dell&#39;estrazione. </li></ol></li><li> Digitonin estrazione e fissazione delle cellule <ol><li> Rimuovere le cellule dal 37 ° C incubatore. </li><li> Durante il processo di estrazione, coprioggetti sono manipolati con l&#39;aiuto di pinze di jewler. Conla pinza prendere il vetrino ed immergerlo nel buffer prima e poi il secondo pozzetto contenente CHO per lavare del mezzo di crescita. </li><li> Rapidamente asciugare il tampone in eccesso dal lato posteriore del vetrino con una Kimwipe e collocare immediatamente l&#39;, lato cella coprioggetto rivolto verso il basso, la soluzione di estrazione. </li><li> Dopo 10 secondi, sollevare il vetrino con la pinza e subito il trasferimento, lato cellulare rivolto verso l&#39;alto, al pozzo contenente il tampone paraformaldeide 4% di fissaggio. </li><li> Lasciate che il incubare campione in fissativo per almeno 15 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparazione delle cellule di controllo non estratto. Per determinare la quantità totale di mRNA nel citoplasma, è una buona idea per preparare un campione di controllo non estratto. <ol><li> Le cellule cresciute su vetrini vengono preparati come sopra (vedi sezione 2.2), salvo che la fase di estrazione digitonina (2.2.3) viene saltato. </li><li> Dopo la fissazione, i non-estratti celle devono essere permeabilizzate in PBS + 0,1% TritonX-100 per 15 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 3. FISH colorazione <ol><li> Progettazione di sonde per ibridazione in situ fluorescente <ol><li> La sequenza primaria del mRNA di interesse è piegato utilizzando RNA secondaria software previsione della struttura, come RNAstructure 5,0 18. Le pieghe mRNA sono valutati visivamente per identificare una regione di circa 50 nucleotidi che è libero di grandi strutture secondarie. </li><li> Il complemento inverso di questa regione viene sintetizzato con un fluoroforo Alexa546 attaccato alla estremità 5 &#39;della sonda (acquistato da Integrated DNA Technologies). </li><li> La sonda viene diluito con acqua priva di RNasi ad una concentrazione stock di 100 mM, che può essere conservato a -20 ° C. </li></ol></li><li> La colorazione con sonde FISH <ol><li> Si noti che sebbene i digitonina-estratto cellule non richiedono ulteriore permeabilizzazione, trattamento di questi campioni fissati con 2 ml di 0,1% Triton X-100 diluito inPBS per 15 minuti a temperatura ambiente prima della colorazione FISH, contribuisce a ridurre il segnale di fondo. </li><li> I vetrini vengono quindi lavati due volte con PBS per rimuovere qualsiasi residuo di paraformaldeide o Triton X-100. </li><li> Le cellule vengono lavate due volte con il 25% al ​​60% formammide in 1X tampone sodio citrato (150 mM NaCl e 15 mM di citrato di sodio). Generalmente, per sonde FISH specifici che sono 50-60 nucleotidi in lunghezza, 60% formammide viene utilizzato, ma per poly (A) dell&#39;mRNA colorazione con oligo (dT) sonda FISH, il livello di formammide viene ridotta fino al 25%. </li><li> Per preparare la camera di colorazione, il fondo di un piatto Petri mm 150 è coperta con acqua e un pezzo di parafilm è fatto galleggiare sull&#39;acqua. L&#39;acqua viene rimossa ruotando il piatto sopra, permettendo così l&#39;parafilm di aderire al fondo del piatto. Le bolle d&#39;aria vengono rimossi manualmente con Kimwipes. </li><li> Per ogni coprioggetto da colorare, pipettare una goccia 100 ml di soluzione di ibridazione contenente sonda FISH di interesse sulla parafilm nella camera di colorazione. La sonda FISH magazzino viene diluito con 25% al ​​60% formammide in tampone di ibridazione (1x SSC, 100 mg / ml di solfato di destrano, 1 mg / ml di lievito tRNA, 5mM complesso riboside vanadile, 25-60% formammide) ad una concentrazione operativa di 0,2 pM. Si noti che la quantità di formammide deve essere ottimizzato per la particolare sonda utilizzata ed è presente alla stessa concentrazione nel tampone SSC lavaggio (vedere fase 3.3.3). </li><li> Il vetrino viene posizionato faccia laterale cella giù sulla soluzione FISH nella camera di colorazione e incubate per 5-24 ore a 37 ° C in una camera umidificata come la coltura tissutale incubatore. </li></ol></li><li> Lavaggio e montaggio dei campioni colorati <ol><li> Per preparare una zona priva di RNasi di lavaggio, di prevedere una striscia di parafilm su una superficie piana, come un banco di laboratorio. Per garantire che il parafilm è piatto, bagnare la superficie piana, inserire il parafilm sulla parte superiore e rimuovere manualmente eventuali bolle d&#39;aria con Kimwipes. </li><li> La camera di colorazione èrimosso dal termostato e posto su una superficie piana. I vetrini vengono poi emessi da pipettando circa 500 ml di tampone di lavaggio FISH in prossimità del bordo di ogni coprioggetto. La soluzione sarà disegnato in-tra il vetrino e il parafilm tramite azione capillare. </li><li> Per ogni coprioggetto, 1 ml di tampone di lavaggio (1x SCC con il 25-60% formammide, vedere il punto 3.3.3) è pipettati sul parafilm zona lavaggio (vedi punto 3.4.1). </li><li> Utilizzando pinze, i coprioggetti sono rimossi dalla camera di colorazione e ciascuno è posto sulla goccia di tampone di lavaggio e incubate a temperatura ambiente per 5 min. Il processo di lavaggio viene ripetuta 3 volte. </li><li> Vetrini vengono lavati con 70% etanolo ed essiccato con Kimwipes. </li><li> Per ogni coprioggetto, 25 ml di soluzione di montaggio (DAPI Fluoromount G, Sud Biotech) viene pipettato nella diapositiva. Si noti che questa soluzione contiene 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI), che DNA macchie e permette la visualizzazione dei nuclei. </li><li> Usipinza ng e Kimwipes, la parte posteriore del vetrino viene asciugato e l&#39;eccesso di tampone di lavaggio FISH è cancellato senza di essiccazione del campione. Ciascun vetrino viene quindi posto lato cella rivolto verso il basso, sulla goccia di soluzione di montaggio. </li><li> I campioni vengono poi montati etichettati e possono essere conservare a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Imaging e quantificazione <ol><li> Imaging <ol><li> Un microscopio a epifluorescenza è utilizzato per l&#39;immagine delle cellule seguenti colorazione FISH. La cellula transfettata può essere differenziata da cellule non trasfettate dalla brillante segnale di fluorescenza nel canale appropriato. Idealmente, ogni campo acquisito conterrà anche una cella non trasfettate essere utilizzato per determinare la fluorescenza di base per la quantificazione. </li><li> Per ogni campo, le immagini della FISH e DAPI canale vengono acquisiti. Inoltre, se le cellule sono co-colorati con marcatori proteici, un&#39;immagine del canale immunofluorescenza è anche acquistato. Si noti che l&#39;estrazione digitonina può anche essere usatoper visualizzare ER-bound ribosomi e proteine ​​11. </li><li> Per garantire che le intensità di fluorescenza tra campi possono essere confrontati, il tempo di esposizione per ogni canale deve rimanere costante per ciascun set di esperimenti. </li><li> Anche in questo caso per garantire che le intensità di fluorescenza tra le cellule su vetrini diversi possono essere confrontati, il giorno per giorno i cambiamenti di intensità epiluminescenza o decadimento del segnale FISH devono essere minimizzate, immagini di tutti i vetrini in una sola seduta. </li></ol></li><li> Quantificazione. Per quantificare la quantità di mRNA che è localizzato sulla ER, usiamo Nikon software NIS Element. Tuttavia altri software di analisi di immagine come ImageJ può essere utilizzato. <ol><li> Utilizzando lo strumento di analisi ELEMENT Nikon NIS immagine, la periferia e il nucleo delle cellule sono descritte come Regione separato di interesse (ROI). </li><li> Per ogni ROI, l&#39;intensità fluorescente (I T per l&#39;intensità totale di cellule e N per laintensità nucleare) e l&#39;area (A T e A N) vengono registrati e esportati in un foglio elettronico di Excel. </li><li> Per ogni immagine, l&#39;intensità sfondo fluorescente (I B) viene determinato registrando l&#39;intensità di una cella non transfettate. Se poly (A) I livelli di mRNA sono stati analizzati, una cellula-libera è selezionato. </li><li> La quantità totale di ER (in cellule estratte) o citoplasmatica (in cellule decompressi) fluorescenza viene calcolata mediante la formula: [A T] [I T - I B] - [AN] [I N - I B] </li><li> L&#39;intensità della colorazione nucleare possono essere calcolate e utilizzate come controllo interno fra i vari trattamenti. Poiché nuclei non sono influenzati dal trattamento digitonina 17 o interruzione ribosoma 11, la quantità di mRNA nucleare deve rimanere costante tra ciascuno di questi trattamenti. Per calcolare fluorescenza nucleare viene utilizzata la seguente formula: [AN] [I N - IB] </li><li> La percentuale di mRNA citoplasmatico che è ER-mirata può essere calcolato prendendo la fluorescenza media ER di 30-40 cellule estratte (vedere 4.2.4) diviso per la fluorescenza media citoplasmatica 30-40 cellule decompressi (di nuovo vedere 4.2.4) . È fondamentale che le cellule estratte e non estratto sono preparati, colorati e ripreso in parallelo. </li></ol></li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La localizzazione di mRNA per vari siti subcellulari, attraverso l&#39;interazione con proteine ​​di trascritti di mRNA di localizzazione, è un fenomeno diffuso importante per il corretto smistamento delle proteine ​​alla loro destinazione finale, e per la messa a punto di espressione genica ai requisiti locali di un subcellulare regione 19,20. Utilizzando il test qui descritto, abbiamo rivisitato la questione se mRNA che codificano proteine ​​secretorie può essere m...

Negli eucarioti, la codifica mRNA secreta e proteine ​​di membrana possono essere mirati al pronto soccorso co-traduzionale dal 1,2 particella di riconoscimento del segnale e possono essere mantenuti al pronto soccorso tramite le interazioni dirette tra ribosomi e translocons durante la traduzione 3,4. Tuttavia, se mRNA può essere mirata e mantenuto sul indipendente di ER sia ribosomi o traduzioni non era chiaro fino a poco tempo fa. Studi precedenti ha tentato di affrontare l&#39;esistenza di traduzione-associazione indipendente mRNA con l&#39;ER con tecniche di frazionamento cellulare. Poiché le condizioni chimici aggressivi sono stati tenuti a dissociarsi da ribosomi ER vescicole derivate, che possono influenzare negativamente il delicato potenzialmente mRNA-ER associazione, questi studi sono stati inconcludenti, fornendo prove per 5-8 e contro 9,10 ribosomiale-fissaggio indipendente di mRNA al pronto soccorso . Per aggirare questi problemi, abbiamo sviluppato un prototipocol di isolare e di immagine ER-bound mRNA. Questa procedura comporta un blando trattamento di estrazione, che rimuove efficacemente tutto il contenuto citoplasmatico della cellula (anche non ER-bound mRNA) preservando al tempo stesso la morfologia ER e tutte le sue molecole associate. Usando questo protocollo abbiamo dimostrato che un sottoinsieme di mRNA sono mirati e poi mantenuto sul ER indipendentemente ribosomi o traduzione 11.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

Negli eucarioti, la maggior parte degli RNA messaggeri (mRNA) che codificano proteine ​​di membrana e secrete sono localizzati sulla superficie del reticolo endoplasmatico (ER). Tuttavia, la visualizzazione di questi mRNA può essere difficile. Ciò è particolarmente vero quando solo una frazione del mRNA è ER-associata e la loro distribuzione per questo organello è ostruita da non bersaglio (cioè &quot;libero&quot;) trascritti. Per monitorare ER-mRNA associati, abbiamo sviluppato un metodo in cui le cellule vengono trattate con una breve esposizione ad una soluzione di estrazione digitonina che permeabilizes selettivamente la membrana plasmatica, e quindi rimuove i contenuti citoplasmatici, mantenendo al tempo stesso l&#39;integrità del ER . Quando questo metodo viene accoppiato con ibridazione in situ fluorescente (FISH), si può chiaramente visualizzare ER-mRNA legati al microscopio a fluorescenza. Usando questo protocollo il grado di ER-associazione sia per sfusi poli (A) o trascritti specifici mRNA può essere valutatae anche quantificato. Nel processo, si può usare questo test per indagare la natura delle interazioni ER-mRNA.

Per determinare la percentuale di mRNA che è ER-associata, cellule COS-7 che sono state trasfettate con plasmidi che contenevano la fosfatasi alcalina placentare (ALPP) o citocromo P450-8b1 (CYP8B1) sono state estratte con digitonina e poi fissato, o direttamente fissato (vedi Figura 1, confrontare &quot;non estratto Ctrl&quot; a &quot;estratto Ctrl&quot;). Il non nucleare fluorescenza è stata quantificata in entrambi i campioni e la frazione di ER-associata mRNA è stato calcolato <...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Qui si descrive un metodo per visualizzare reticolo endoplasmatico associate mRNA in cellule di mammifero coltura tissutale. Questa tecnica comporta la permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica con digitonina di rimuovere contenuto citoplasmatico seguite da fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; per rilevare sia bulk poly (A) o mRNA trascritti specifici.

Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

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JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  University of Toronto. Qui si descrive un metodo per visualizzare reticolo endoplasmatico associate mRNA in cellule di mammifero coltura tissutale. Questa tecnica comporta la permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica con digitonina di rimuovere contenuto citoplasmatico seguite da fluorescente In situ per rilevare sia bulk poly (A) o mRNA trascritti specifici.

Video: Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Trapianto cellule di mammifero

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Ricerca

Biologia

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...