Este trabajo fue apoyado por becas de la National Science and Engineering Research Council de Canadá a XAC y AFP

1. Preparación de los materiales para la extracción <ol><li> Preparación de las células <ol><li> Semillas células de cultivo de tejidos en cubreobjetos tratados con ácido para al menos un día antes del experimento. Usamos COS-7 o U2OS, como estas dos líneas celulares exhiben producción de proteína secretada robusto y tener una bien definida ER. Tenga en cuenta que para lograr una eficiencia de extracción de alta, las células no debe exceder de 80% de confluencia en el cubreobjetos en el día del experimento. </li><li> Si un ARNm exógeno particular, está siendo investigado, las células se transfectan un día después de la siembra con plásmidos que contienen el gen de interés utilizando protocolos estándar de transfección. Las células entonces se les permite expresar el mRNA durante al menos 18 horas antes de la extracción. </li></ol></li><li> El tratamiento de las células con inhibidores de la traducción <ol><li> Para probar el efecto de los ribosomas intactos en el mantenimiento de los ARNm de asociación con el ER, las células pueden ser tratadas con inhibidores de la traducción que alteran la asociaciónde los ribosomas con el ARNm de 11. </li><li> Los inhibidores de la iniciación de la traducción, tales como homoharringtonin (HHT), pactamycin, o 2 - (4-metil-2 ,6-dinitroanilino) - N-metil-(MDMP), prevenir nuevos ribosomas de asociarse con la transcripción mientras que simultáneamente permite dedicadas a ribosomas traducción completar 12-14. Puesto que la velocidad de traducción para la mayoría de las proteínas en células de mamíferos es 5 aminoácidos por segundo, independientemente del uso del codón de ARNm o longitud 15, un tratamiento de 30 min se debe borrar ribosomas off de mensajes con marcos de lectura abiertos mientras 27.000 nucleótidos (que codifica para proteínas siempre que 9.000 aminoácidos). </li><li> Inhibidores como puromicina promover la eyección prematura de la cadena naciente y así interrumpir polisomas 12. Sin embargo, para interrumpir completamente la asociación de los ribosomas a puromicina tratados con el ARNm, los quelantes tales como EDTA de magnesio se añaden al tampón de extracción digitonina 11. </li> &lt;li&gt; En este experimento, las células se tratan con puromicina 200 mM, 5 mM HHT, o medio de control durante 30 min antes de la extracción. </li></ol></li><li> Preparación de tampón de extracción digitonina. Para visualizar ER-localizada mRNAs sin la obstrucción de la libre (es decir, no citoplásmicos ER-asociados) transcripciones, que selectivamente permeabilizar las células con digitonina, un glucósido esteroide que interacciona preferentemente con 3β-hydroxysterols. A bajas concentraciones, digitonina permeabiliza selectivamente porciones de la membrana plasmática, causando &#39;permeabilidad&#39; 16. Por el contrario, la membrana del RE y envoltura nuclear, que son pobres en colesterol, se dejan intactos 16,17. <ol><li> Digitonina (Sigma Aldrich) en polvo se disuelve en agua destilada a 5% peso / volumen y esta solución madre se dividió en alícuotas en volúmenes pequeños y se almacena a -20 ° C. En nuestra experiencia, múltiples ciclos de congelación-descongelación disminuye la eficiencia de digitonina disuelve. </li><li> Una solución stock de10x tampón de CHO (1x concentración de la solución de trabajo: 115 mM KAc, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM de MgCl 2, 2 mM EGTA y 150 mM de sacarosa) se prepara con RNasa libre de reactivos y se almacenó a -20 ° C. Una solución de trabajo (1x tampón de CHO) se prepara diluyendo la solución madre con RNasa libre de agua y se puede almacenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Extracción digitonina <ol><li> Preparación de soluciones de aspirado <ol><li> Un bloque de calentamiento con una superficie plana es pre-calentado a 40 ° C y se mantuvo a esta temperatura durante la extracción. </li><li> Para formar una superficie de trabajo plana, que es libre de RNasa, el bloque de calentamiento se humedece con un poco de agua y se cubrió con un trozo nuevo de Parafilm M (Bemis Company, Inc). Las burbujas de aire entre la lámina y el bloque de parafina calefacción se suavizan con RNasa libre de guantes y Kimwipes (VWR). </li><li> 1x tampón de CHO se calienta a 37 ° C por incubación en un baño de agua. </li><li> 6-y las placas se utilizan para lavary fijar las células. Cada fila de 3 pozos se utiliza para un cubreobjetos. Para los dos primeros pocillos de la fila, 2 ml de tampón de CHO calentada se añade. Para el último pocillo, 2 ml de la solución de fijación (paraformaldehído PBS + 4% (Ciencias de microscopio electrónico)) se añade. Esta bandeja puede ser almacenado en la incubadora a 37 º C hasta que las células están listas para la extracción. </li><li> Solución de digitonina extracción se prepara por dilución de la solución stock de digitonina al 0,025% con tampón de CHO caliente justo antes de su uso. Una vez más en cuenta que para las células tratadas con puromicina, el tampón de extracción, además, debe contener 20 mM EDTA para interrumpir eficazmente ribosomas 11. Gotas de 100 l de la solución de extracción se colocan en el bloque de calentamiento Parafilm cubierta inmediatamente antes de la extracción. </li></ol></li><li> Digitonina Extracción y fijación de células <ol><li> Eliminar las células de la incubadora a 37 º C. </li><li> Durante el proceso de extracción, los cubreobjetos son manipulados con la ayuda de fórceps de jewler. Conlas pinzas recoger el cubreobjetos y sumergirla en el buffer de CHO primero y luego el segundo pozo que contiene para lavar el medio de cultivo. </li><li> Rápidamente Seque el exceso de tampón de la parte posterior del cubreobjetos con un Kimwipe e inmediatamente colocar el cubreobjetos, lado de la celda hacia abajo, en la solución de extracción. </li><li> Después de 10 segundos, levante el cubreobjetos con las pinzas e inmediatamente transferir, lado de la celda hacia arriba, hacia el pozo que contiene el tampón de fijación 4% paraformaldehído. </li><li> Deje incubar la muestra en fijador durante al menos 15 min a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparación de las células de control no extraído. Para determinar la cantidad total de ARNm en el citoplasma que es una buena idea para preparar una muestra de control no extraído. <ol><li> Las células cultivadas sobre cubreobjetos se preparan como anteriormente (véase la sección 2,2), excepto que la etapa de extracción de digitonina (2.2.3) se omite. </li><li> Después de la fijación, las células no-extraídos deben ser permeabilizaron en PBS + 0,1% de TritonX-100 durante 15 min a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 3. FISH tinción <ol><li> El diseño de sondas para la hibridación in situ fluorescente <ol><li> La secuencia primaria del mRNA de interés se pliega usando ARN software de predicción de estructura secundaria, tales como RNAstructure 5,0 18. Los pliegues de ARNm se evaluó visualmente para identificar una región de aproximadamente 50 nucleótidos que está libre de grandes estructuras secundarias. </li><li> El complemento inverso de esta región se sintetiza con un fluoróforo Alexa546 unido al extremo 5 &#39;de la sonda (adquirido de DNA Technologies Integrados). </li><li> La sonda se diluyó con agua libre de ARNasa a una concentración stock de 100 mM que se pueden almacenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> La tinción con sondas FISH <ol><li> Tenga en cuenta que aunque las células digitonina-extrajeron no requieren permeabilización adicional, el tratamiento de estas muestras fijadas con 2 ml de 0,1% de Triton X-100 diluido enPBS durante 15 min a temperatura ambiente antes de la tinción FISH, ayuda a reducir la señal de fondo. </li><li> Los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS para eliminar cualquier paraformaldehído residual o Triton X-100. </li><li> Las células se lavan dos veces con formamida 25% a 60% en 1X tampón de citrato sódico (150 mM NaCl y 15 mM citrato de sodio). En general, para las sondas específicas de peces que son 50-60 nucleótidos de longitud, 60% de formamida se utiliza, pero para la tinción de ARNm poli (A) con sonda de oligo FISH (dT), el nivel de formamida se reduce hasta 25%. </li><li> Para preparar la cámara de tinción, la parte inferior de una placa de Petri de 150 mm se cubre con agua y un trozo de Parafilm es flotó en el agua. El agua se elimina haciendo girar el plato sobre, permitiendo así que el parafilm para adherirse a la parte inferior del plato. Las burbujas de aire se retiran manualmente con Kimwipes. </li><li> Para cada cubreobjetos para ser teñidos, pipetee una gota 100 ml de la solución de hibridación que contenía la sonda FISH de interés sobre la parafilm en la cámara de tinción. La sonda FISH madre se diluye con formamida 25% a 60% en tampón de hibridación (SSC 1x, 100 mg / ml de sulfato de dextrano, 1 mg / ml de ARNt de levadura, complejo de vanadilo ribosida 5 mM, 25-60% de formamida) a una concentración de trabajo de 0,2 m. Tenga en cuenta que la cantidad de formamida debe ser optimizado para la sonda particular que se usa y está presente en la misma concentración como en el tampón de lavado de SSC (ver paso 3.3.3). </li><li> El cubreobjetos se coloca boca abajo sobre la celda lateral de la solución de FISH en la cámara de tinción y se incubaron durante 5-24 horas a 37 ° C en una cámara humidificada, tales como el cultivo de tejidos incubadora. </li></ol></li><li> El lavado y el montaje de las muestras teñidas <ol><li> Para preparar un área de lavado RNasa libre, establecer una franja de parafina sobre una superficie plana y nivelada, como una mesa de laboratorio. Para asegurarse de que la parafina es plana, húmeda la superficie nivelada, coloque la parafina en la parte superior y quitar manualmente las burbujas de aire con Kimwipes. </li><li> La cámara de tinción essacaron de la incubadora y se colocan en una superficie plana. Los cubreobjetos se luego flotó pipeteando aproximadamente 500 l de tampón de lavado FISH cerca del borde de cada cubreobjetos. La solución se elaborará en el medio del cubreobjetos y la parafina a través de la acción capilar. </li><li> Para cada cubreobjetos, 1 ml de tampón de lavado (1x SCC con 25-60% de formamida, consulte el paso 3.3.3) se pipetearon sobre el parafilm zona de lavado (véase la etapa 3.4.1). </li><li> Utilizando pinzas, los cubreobjetos se retiraron de la cámara y cada tinción se coloca sobre la gota de tampón de lavado y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. El proceso de lavado se repite 3 veces. </li><li> Portaobjetos de vidrio se lavan con 70% de etanol, y se secó con Kimwipes. </li><li> Para cada cubreobjetos, 25 l de solución de montaje (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) se pipetea sobre el portaobjetos. Tenga en cuenta que esta solución contiene 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que las manchas de ADN y permite la visualización de los núcleos. </li><li> Usifórceps ng y Kimwipes, la parte posterior del cubreobjetos y se seca el exceso de tampón de lavado FISH es borrado apagado sin secar la muestra. Cada cubreobjetos se coloca lado de la célula hacia abajo, sobre la gota de solución de montaje. </li><li> Muestras montadas se etiquetan y se puede almacenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Imagen y Cuantificación <ol><li> Proyección de imagen <ol><li> Un microscopio de epifluorescencia se utiliza para la imagen de las células después de la tinción con FISH. La célula transfectada se puede diferenciar de las células no transfectadas por señal brillante de fluorescencia en el canal apropiado. Idealmente, cada campo adquirido también contendrá un celular sin transfectar a ser utilizado para determinar la fluorescencia de fondo para la cuantificación. </li><li> Para cada imagen de campo de los peces y el canal de DAPI se adquieren. Además, si las células se co-teñidas con los marcadores de proteínas, una imagen del canal de inmunofluorescencia también se adquiere. Tenga en cuenta que la extracción de digitonina también se puede utilizarpara visualizar ER enlazados a ribosomas y proteínas 11. </li><li> Para asegurarse de que las intensidades de fluorescencia entre los campos se puede comparar, el tiempo de exposición para cada canal debe permanecer constante para cada conjunto de experimento. </li><li> Una vez más para asegurarse de que la intensidad de fluorescencia entre las células en cubreobjetos diferentes pueden ser comparados, los cambios del día a día en la intensidad epiluminiscencia o deterioro en la señal de FISH debe reducirse al mínimo mediante imágenes de todos los cubreobjetos en una sola sesión. </li></ol></li><li> Cuantificación. Para cuantificar la cantidad de ARNm que se localiza en el ER, se utiliza el software Nikon Elemento NIS. Sin embargo otro software de análisis de imagen tal como ImageJ se puede utilizar. <ol><li> Con la herramienta Nikon NIS elemento de análisis de imagen, la periferia de la célula y el núcleo se describen como región separada de Interés (ROI). </li><li> Para cada retorno de la inversión, la intensidad de fluorescencia (I T para la intensidad total de células y N para elintensidad nuclear) y el área (A y T N A) se registran y se exporta a una hoja de cálculo de Excel. </li><li> Para cada imagen, la intensidad de fondo fluorescente (I B) se determina mediante el registro de la intensidad de una célula no transfectadas. Si poli (A) los niveles de ARNm están siendo analizados, una zona libre de células se selecciona. </li><li> La cantidad total de ER (en células extraídas) o citoplásmica (en células no extraídos) de fluorescencia se calcula por la fórmula: [A T] [I T - I B] - [A N] [N I - I B] </li><li> La intensidad de la tinción nuclear también puede ser calculado y utilizado como control interno entre los diversos tratamientos. Puesto que los núcleos no se ven afectados por el tratamiento de digitonina 17 o interrupción ribosoma 11, la cantidad de mRNA nuclear debe permanecer constante entre cada uno de estos tratamientos. Para calcular la fluorescencia nuclear se utiliza la siguiente fórmula: [A N] [I N - IB] </li><li> El porcentaje de ARNm citoplásmico que es ER-establecida se calcula tomando la media de fluorescencia ER de 30-40 células extraídas (véase 4.2.4) dividido por la media de fluorescencia citoplásmica 30 a 40 células no extraídos de nuevo (véase 4.2.4) . Es crítico que las células extraídas y sin extraer se preparan, se tiñeron y fotografiado en paralelo. </li></ol></li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

La localización de los ARNm a varios sitios subcelulares, a través de la interacción con las proteínas de las transcripciones de ARNm de localización, es un fenómeno generalizado importante para la selección adecuada de las proteínas a su destino final, y para el ajuste fino de la expresión de genes a los requisitos locales de una subcelular 19,20 región. Usando el ensayo descrito aquí, se volvió a examinar la cuestión de si los ARNm que codifican proteínas de secrec...

En eucariotas, el ARNm que codifica secretadas y proteínas de membrana pueden ser dirigidos a la ER co-traduccional por la partícula de reconocimiento de señal de 1,2 y se puede mantener en el ER a través de las interacciones directas entre los ribosomas y translocons durante la traducción 3,4. Sin embargo, si mRNAs pueden ser dirigidos y mantenidos en la sala de emergencia independiente de cualquiera de los ribosomas o la traducción no está claro hasta muy recientemente. Estudios previos tratado de abordar la existencia de traducción independiente de la asociación con el mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamiento celular. Debido a las duras condiciones químicas se requiere para disociar los ribosomas de ER vesículas derivadas, que pueden bloquear la potencialmente delicada ARNm-ER asociación, estos estudios no fueron concluyentes, proporcionando evidencia de 5-8 y 9,10 contra ribosomal independiente de anclaje de ARNm al ER . Para superar estos problemas, se ha desarrollado un protopara aislar y col imagen ER-enlazados mRNAs. Este procedimiento consiste en un tratamiento de extracción suave, que elimina eficazmente todo el contenido citoplasmático de la célula (incluyendo los no consolidados ER-mRNAs) y al mismo tiempo preservar la morfología de ER y de todas sus moléculas asociadas. Usando este protocolo, hemos demostrado que un subconjunto de mRNAs están dirigidos y después se mantuvo en el ER independientemente de los ribosomas o la traducción 11.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

En eucariotas, la mayoría de los ARN mensajeros (ARNm) que codifican proteínas de membrana y secretada están localizados en la superficie del retículo endoplásmico (ER). Sin embargo, la visualización de estos mRNAs puede ser un reto. Esto es especialmente cierto cuando sólo una fracción del ARNm es ER-asociado y su distribución a este orgánulo es obstruida por no objetivo (es decir, &quot;libre&quot;) transcripciones. A fin de supervisar ER-asociados mRNAs, hemos desarrollado un método en el que las células se tratan con una corta exposición a una solución de extracción que digitonina selectivamente permeabiliza la membrana plasmática, y por lo tanto elimina los contenidos citoplásmicos, manteniendo al mismo tiempo la integridad de la ER . Cuando este método se acopla con hibridación in situ fluorescente (FISH), uno puede visualizar claramente ER-mRNAs unidos por microscopía fluorescente. Usando este protocolo el grado de ER-asociación, ya sea para granel de poli (A) o transcripciones de ARNm específicos puede evaluarsee incluso cuantificados. En el proceso, se puede utilizar este ensayo para investigar la naturaleza de las interacciones ER-mRNA.

Para determinar el porcentaje de ARNm que es ER-asociado, células COS-7 que se transfectaron con plásmidos que contenían la fosfatasa alcalina placentaria (MF) o el citocromo P450 8B1 (CYP8B1) se extrajeron bien con digitonina y luego se fija, o fijada directamente (véase la Figura 1, comparar &quot;no extraído Ctrl&quot; a &quot;Extraídas Ctrl&quot;). La fluorescencia no nuclear se cuantificó en ambas muestras y la fracción de ER asociada a ARNm se calculó (Figura 2)....

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Aquí se describe un método para visualizar retículo endoplasmático asociados mRNAs en células de cultivo de tejidos de mamíferos. Esta técnica implica la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina para eliminar el contenido citoplásmico seguido por fluorescente<em&gt; In situ</emHibridación&gt; a detectar sea a granel poli (A) mRNA o transcripciones específicas.

La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

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Research

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Biology

14.2K vistas.  University of Toronto. Aquí se describe un método para visualizar retículo endoplasmático asociados mRNAs en células de cultivo de tejidos de mamíferos. Esta técnica implica la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina para eliminar el contenido citoplásmico seguido por fluorescente In situ a detectar sea a granel poli (A) mRNA o transcripciones específicas.

Video: Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Siembra y células de mamífero

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Investigación

Biología

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...