이 작품은 XAC와 AFP에 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다

1. 추출을위한 자료의 작성 <ol><li> 셀의 준비 <ol><li> 실험하기 전에 최소한 하나의 일에 대한 산 처리 coverslips에 씨 조직 문화 세포. 이 두 세포 라인이 분비 단백질의 강력한 생산을 전시하고 잘 정의 된 ER을 가지고 우리는 COS-7 또는 U2OS을 사용합니다. 높은 추출 효율을 달성하기 위해, 세포 실험 당일 coverslip에 confluency 80 %를 초과 할 수 없습니다합니다. </li><li> 특정 외인성 mRNA가 조사하는 경우, 전지가 표준 transfection 프로토콜을 사용하여 관심있는 유전자를 포함하는 plasmids과 퍼 뜨리고 마치면 하루 종일 transfected 수 있습니다. 세포 그런 다음 이전에 추출 최소 18 시간의 mRNA를 표현 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 번역 억제제로 세포 치료 <ol><li> ER과 mRNAs 협회의 유지 보수에 그대로 리보솜의 효과를 테스트하려면 전지 협회를 중단 번역 억제제로 치료 될 수있다mRNA 11 리보솜의. </li><li> (4 - 메틸-2, 6 dinitroanilino) - - 같은 homoharringtonin (HHT), pactamycin, 또는 2와 같은 번역 개시의 억제제를 동시에 약혼 리보솜을 허용하면서 N-methylpropionamide (MDMP)는 성적 증명서와 연결에서 새 리보솜을 방지 번역 12-14를 완료합니다. 포유류의 세포에서 대부분의 단백질에 대한 번역 속도에 관계없이 코돈 사용 또는 mRNA의 길이 15 초당 5 아미노산이기 때문에, 30 분의 치료 27000 세포핵 (단백질에 대한 코딩하는 한 열린 독서 프레임과 메시지의 리보솜을 삭제해야합니다 ) 9,000 아미노산 가능한 한 오래. </li><li> 같은 puromycin 등 억제제는 초기 체인의 조기 배출을 촉진하므로 polysomes 12 중단. 그러나 완전히 mRNA와 puromycin - 처리 리보솜의 연결을 방해하는 등 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 같은 마그네슘 chelators는 digitonin 추출 버퍼 11 추가해야합니다. </li> &lt;리&gt;이 실험에서 세포는 200 μM의 puromycin, 5 μM의 HHT 또는 추출하기 전에 30 분을위한 제어 매체 처리됩니다. </li></ol></li><li> Digitonin 추출 버퍼의 작성. 무료 (즉 세포질, 비 ER-관련) 성적 증명서의 방해없이 ER-지역화 mRNAs를 시각화하기 위해, 우리는 선택적으로 digitonin, 3β-hydroxysterols을 우선적으로 상호 작용 스테로이드 glycoside있는 셀을 permeabilize. 낮은 농도에서 digitonin 선택적으로 &#39;leakiness&#39;16 발생, 플라즈마 막의 일부를 permeabilizes. 대조적으로, 콜레스테롤의 가난한 ER 막과 핵 봉투, 16,17 그대로 남아 있습니다. <ol><li> Digitonin (시그마 알드리치) 분말 5 % 중량 / 부피에 증류수에 용해되며,이 주식 솔루션은 작은 볼륨으로 aliquoted되어 있으며 -20 ° C.에 저장 우리의 경험에서 여러 동결 - 해동주기는 해산 digitonin의 효율성을 낮 춥니 다. </li><li> 의 주식 솔루션10X CHO 버퍼는 (1X 작업 솔루션 농도 : 115 MM KAC, 25 MM HEPES 산도 7.4, 2.5 MM MgCl 2, 2 MM EGTA 150 밀리미터 자당) RNase 무료 시약을 준비 -20 ° C.에 저장됩니다 작업 솔루션은 (1X CHO 버퍼) RNase 무료 물과 주식 솔루션을 diluting에 의해 준비가되어 있습니다, 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li></ol> 2. Digitonin 추출 <ol><li> 추출 솔루션을 준비 <ol><li> 평평한 표면과 가열 블록은 사전 가열 40 ° C 및 추출에 동안이 온도에서 유지. </li><li> RNase 무료입니다 평면 작업 표면을 형성하기 위해 가열 블록 parafilm M (Bemis 회사, 주식회사)의 새로운 조각을 물과 겹쳐로 moistened 있습니다. parafilm 시트 및 난방 블록 사이의 기포는 RNase 무료 장갑과 kimwipes (VWR)를 사용하여 밖으로 부드럽게 있습니다. </li><li> 1X CHO 버퍼는 물 목욕에 잠복기가 37 ° C로 예열합니다. </li><li> 6 잘 플레이트는 씻어하는 데 사용됩니다그리고 세포를 해결할 수 있습니다. 세 우물의 각 행은 하나 커버 슬립에 사용됩니다. 행의 처음 두 우물까지 따뜻하게 CHO 버퍼의 2 ML이 추가됩니다. 마지막으로 잘까지 고정 솔루션 2 ML은 (PBS + 4 % paraformaldehyde (전자 현미경 과학))이 추가됩니다. 세포 추출을위한 준비가 될 때까지이 트레이는 37 ° C 배양기에 저장 할 수 있습니다. </li><li> Digitonin 추출 솔루션은 단지 사용 전에 따뜻한 CHO 버퍼와 0.025 %로 주식 digitonin 솔루션을 diluting에 의해 준비가되어 있습니다. 다시 puromycin - 처리 세포에 대해 추출 버퍼가 추가로 효율적으로 리보솜 11 방해하는 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 포함해야합니다. 추출 솔루션 100 μl의 방울 추출하기 전에 즉시 parafilm 덮인 가열 블록에 게재됩니다. </li></ol></li><li> Digitonin 추출 및 세포 고정 <ol><li> 37 ° C 배양기에서 세포를 제거합니다. </li><li> 추출 과정 coverslips는 jewler의 포셉의 도움으로 조작됩니다. 과포셉은 coverslip을 선택하고 성장 매체의 세탁 할 수있는 잘 포함 된 두 번째 한 후 첫 번째와 CHO 버퍼에 떨어 뜨릴. </li><li> 신속하게 kimwipe로 coverslip의 뒷면에서 초과 버퍼를 가릴 즉시 추출 솔루션을 아래로 직면하고있는 coverslip, 셀 측을 배치합니다. </li><li> 10 초 후, 포셉으로 coverslip을 수령 즉시 세포면이 잘 포함 된 4 % paraformaldehyde 고정 버퍼에 최대 직면하고, 그것을 전송할 수 있습니다. </li><li> 상온에서 최소 15 분 동안 정착액의 예제 길러 보자. </li></ol></li><li> Unextracted 제어 셀의 작성. 이 unextracted 제어 샘플을 준비하는 것이 좋습니다 세포질에서 mRNA의 총 양을 결정합니다. <ol><li> coverslips에 성장 세포는 digitonin 추출 단계 (2.2.3)이 생략되는 경우를 제외하고 (2.2 절 참조) 위와 같이 준비가되어 있습니다. </li><li> 고정 후 취소 - 압축을 푼 세포는 PBS에 permeabilized 할 필요가 + 0.1 % 튼을X-100 실온에서 15 분에. </li></ol></li></ol> 3. 생선 착색 <ol><li> 원위치 하이브리드 화에 형광을위한 프로브를 설계 <ol><li> 관심의 mRNA의 주요 순서는 해당 RNAstructure 5.0 18와 같은 RNA 차 구조 예측 소프트웨어를 사용하여 통합되어 있습니다. mRNA의 주름은 시각적으로 주요 이차 구조 무료입니다 약 50 세포핵의 영역을 식별하기 위해 평가됩니다. </li><li> 이 지역의 역 보완는 프로브의 5 &#39;끝 (통합 DNA 기술에서 구입)에 부착 Alexa546 형광으로 합성된다. </li><li> 프로브는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 100 μm의 주식 농도에 RNase 무료 물을 희석되어 </li></ol></li><li> 생선 프로브로 얼룩 <ol><li> digitonin - 압축을 푼 세포가 더 permeabilization을 필요로하지 않지만, 0.1 %의 2 ML과 함께 고정 된 샘플을 치료합니다 트리톤 X-100에 희석PBS는 생선 착색하기 전에 상온에서 15 분 동안 배경 신호를 감소하는 데 도움이됩니다. </li><li> 슬라이드 그런 다음 잔여 paraformaldehyde 또는 트라이 튼 X-100을 제거하는 PBS로 두 번 세척하고 있습니다. </li><li> 세포는 다음 1X 나트륨 구연산 버퍼 (150 MM NaCl, 15 MM 나트륨 시트르산) 25 % 60 % 포름 아미드로 두 번 세척하고 있습니다. 일반적으로, 길이 50​​-60 세포핵 구체적인 생선 프로브에 대해 60 %의 포름 아미드가 사용되지만, oligo (DT) 생선 프로브와 폴리 (A) mRNA의 착색을 위해 포름 아미드의 수준은 25 % 아래로 감소된다. </li><li> 착색 챔버를 준비하려면, 150mm 페트리 접시의 바닥이 물로 덮여 있으며, parafilm의 한 부분이 물에 떠내려 수 있습니다. 물은 따라서 parafilm는 접시​​의 바닥을 준수 할 수 있도록, 요리를 통해 돌려 제거됩니다. 기포를 수동으로 kimwipes으로 제거됩니다. </li><li> 각 coverslip을 물들 일하기 위해서는 파에 관심 물고기 프로브를 포함하는 하이브리드 솔루션의 100 μl 드롭 피펫착색 챔버에 afilm. 재고 생선 프로브의 작동 농도에 하이브 리다이 제이션 버퍼 25 % 60 % 포름 아미드 (1X SSC, 100 MG / ML dextran 황산염, 1 MG / ML 효모 tRNA, 5mM vanadyl riboside 단지, 25~60% 포름 아미드)로 희석합니다 0.2 μM. 포름 아미드의 양이 사용되는 특정 프로브에 대해 최적화되어 있으며 SSC 세척 버퍼에 같은 농도 (단계 3.3.3 참조)에 존재해야합니다. </li><li> coverslip이 같은 조직 문화 인큐베이터로 humidified 챔버에 37 ° C에서 착색 챔버에서 생선 솔루션에 셀 사이드 얼굴을 아래로 배치하고 5-24 시간에 대한 incubated 수 있습니다. </li></ol></li><li> 스테인드 샘플을 세정 장착 <ol><li> RNase 무료 세탁 영역을 준비하려면 이러한 실험실 벤치와 같은 수준의 평평한 표면에 parafilm의 스트립은 바칠 것이다. parafilm는 수준의 표면 서부 유럽 표준시, 평면인지 확인하려면, 상단에있는 parafilm을 배치하고 수동 kimwipes과 아무런 기포를 제거합니다. </li><li> 착색 챔버는보육에서 제거 및 평면 수준의 표면에 위치. coverslips는 다음 각 coverslip의 가장자리 근처에 물고기 세척 버퍼의 약 500 μl를 pipetting하여 떠내려 수 있습니다. 솔루션은 모세관 작용을 통해 coverslip과 parafilm 인 사이에 그려집니다. </li><li> 각 coverslip를 들어, 세탁 버퍼 1 ML (1X SCC 25-60%의 포름 아미드로, 3.3.3 단계를 참조하십시오)은 세탁기 지역 parafilm (단계 3.4.1 참조)에 pipetted 있습니다. </li><li> 집게를 사용하여 coverslips는 착색 챔버에서 제거됩니다 및 각 세척 버퍼의 드롭에 위치하며 5 분 동안 실온에서 incubated. 세척 과정은 3 번 반복됩니다. </li><li> 유리 슬라이드는 70 % 에탄올로 세척하고, kimwipes로 건조됩니다. </li><li> 각 coverslip를 들어, 마운트 솔루션 (DAPI Fluoromount G, 남부 생명 공학)의 25 μl은 슬라이드에 pipetted 있습니다. 이 솔루션 4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI), 얼룩의 DNA를 포함하고 핵의 시각화를 허용합니다. </li><li> UsiNG 포셉 및 kimwipes는 coverslip의 뒷면은 건조하고 초과 물고기 세척 버퍼는 샘플을 건조하지 않고 해제 blotted 있습니다. 각 coverslip 그런 다음 설치 솔루션의 드롭에, 아래에 직면 세포 측에 저장됩니다. </li><li> 마운트 샘플 그런 다음 표시되며, 4시에 저장 할 수 있습니다 ° C. </li></ol></li></ol> 4. 이미징 및 정량화 <ol><li> 영상 <ol><li> epifluorescence 현미경은 이미지 생선 착색 따라 셀을하는 데 사용됩니다. transfected 세포는 적절한 채널에 밝은 형광 신호로 untransfected 세포에서 차별화 할 수 있습니다. 이상적으로, 각 인수 필드는 또한 정량화의 배경 형광을 결정하는 데 사용되는 untransfected 셀을 포함합니다. </li><li> 를 들어 생선과 DAPI 채널의 각 필드 이미지가 획득됩니다. 세포 단백질 마커와 공동 묻은 경우 또한, immunofluorescence 채널의 이미지도 취득하고 있습니다. digitonin 추출도 사용할 수 있습니다ER-바운드 리보솜과 단백질 11 시각화합니다. </li><li> 분야 사이의 형광 강도를 비교할 수 있도록하려면 각 채널에 대한 노출 시간은 실험의 각 집합에 대해 일정하게 유지해야합니다. </li><li> 다시 다른 coverslips에 세포 사이의 형광 강도를 비교할 수 있도록, 물고기 신호의 epiluminescence 강도 나 부식에 매일 변경 이미징 하나의 좌석에 coverslips의 모든이 최소화되어야합니다. </li></ol></li><li> 정량화. ER에 지역화 mRNA의 양을 정량화하기 위해, 우리는 니콘 NIS 요소 소프트웨어를 사용합니다. 그러나 이러한 ImageJ와 같은 다른 이미지 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. <ol><li> 니콘 NIS 요소 이미지 분석 도구 사용, 셀 주변 및 핵은 관심 분야 (ROIs)의 별도의 지역으로 설명되어 있습니다. </li><li> 각 투자 수익 (ROI), 형광 강도 (I T 전체 셀 강도 및 내 용 N에 대한핵 강도)과 지역 (A T 및 A N) 기록하고 Excel 스프레드 시트에 수출하고 있습니다. </li><li> 각 이미지를 들어, 배경 형광 강도 (I B)가 아닌 transfected 세포의 강도를 기록에 의해 결정됩니다. 폴리 (A) mRNA 수준을 분석하는 경우, 셀 - 무료 지역이 선택됩니다. </li><li> 총 ER의 양 (추출 셀) 또는 세포질은 (unextracted 세포에서) 형광이 공식에 의해 계산됩니다 : [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B] </li><li> 핵 염색 강도도 계산 및 다양한 트리트먼트를 사이에 내부 통제으로 사용할 수 있습니다. 핵이 digitonin 치료 17 ribosome 파괴 11에 의해 영향을받지 않기 때문에 핵 mRNA의 양이 트리트먼트를 각각의 사이에 일정하게 유지해야합니다. 다음 수식을 사용 핵 형광을 계​​산하려면 : [A N] [I N - IB] </li><li> ER 타겟이 세포질 mRNA의 비율은 30-40 unextracted 세포 (다시 4.2.4 참조)의 평균 세포질 형광으로 나눈 30-40 추출한 세포의 평균 ER의 형광을 (4.2.4 참조) 복용에 의해 계산 될 수있다 . 이 추출 unextracted 세포가 준비 묻은와 병렬로 이미징하는 것이 중요합니다. </li></ol></li></ol>

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다양한 subcellular 사이트에 mRNAs의 현지화는 mRNA의 현지화 단백질과 성적의 상호 작용을 통해 subcellular의 로컬 요구 사항에 대한 그들의 최종 목적지 단백질의 적절한 정렬을위한, 그리고 유전자 표현의 미세 조정에 중요한 널리 현상입니다 지역 19,20. 검정을 사용하면 여기에 설명 된, 우리는 분비 단백질을 인코딩 mRNAs는 리보솜 또는 번역의 유무에 ER에서 유지 될 수 ?...

eukaryotes에서 mRNA 인코딩 번역 3,4 동안 리보솜과 translocons 사이의 직접 상호 작용을 통해 분비와 막 단백질은 공동 translationally 신호 인식 입자 1,2에 의해 응급실로 타겟팅 할 수 있으며, ER에서 유지 관리 할 수 있습니다. 그러나, mRNAs가 타겟팅하고 리보솜 또는 번역 중의 ER 독립을 유지 할 수 있는지 여부 것은 매우 최근까지 불분명했다. 이전 연구는 세포 분획 기법을 사용하여 ER로 번역 독립적 인 mRNA 협회가 있는지 해결하기 위해 시도했습니다. 거친 화학 조건이 잠재적으로 민감한 mRNA-ER 협회가 바뀐다 ER 파생 소포에서 리보솜을 해제해야 되었기 때문에,이 연구는 5-8에 대한 증거를 제공하고, 결정적이었고 9,10에 대한 ribosomal 독립적 인 mRNA의 응급실로 고정 . 이러한 문제를 회피하기 위해 우리는 proto을 개발했습니다콜 분리 및 이미지 ER-바운드 mRNAs를합니다. 이 절차를 동시에 ER 형태와 관련 분자의 모든을 유지하면서 효과적으로 세포 (비 ER-바운드 mRNAs 포함)의 모든 세포질 내용을 제거 가벼운 추출 치료를하는 것입니다. 이 프로토콜 사용 우리는 mRNAs의 일부 타겟팅하고 독립적으로 리보솜 또는 번역 (11)의 ER에 유지하는 증명하고있다.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

eukaryotes에서 분비와 막 단백질이 소포체 endoplasmic (ER)의 표면에 지역화 아르 인코딩 메신저 RNAs (mRNAs)의 대부분. 그러나 이러한 mRNAs의 시각화가 도전 할 수 있습니다. 이것은 mRNA의 일부만이 ER-관련 될 때 특히 사실이다이 세포 기관과의 배포가 아닌 타겟 (예 : &quot;무료&quot;) 성적 증명서에 의해 가려합니다. 동시에 ER의 무결성을 유지하면서 ER-관련 mRNAs을 모니터링하기 위해, 우리는 세포가 선택적으로 플라즈마 멤브레인을 permeabilizes digitonin 추출 솔루션에 대한 짧은 노출로 치료되는 방법을 개발하고, 따라서 세포질 내용을 제거했습니다 . 이 방법은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광와 결합 될 때, 하나는 분명 형광 현미경으로 ER-바운드 mRNAs를 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 대량 폴리 (A) 성적 증명서 또는 특정 mRNAs 중 하나에 ER-협회의 정도를 평가 할 수 있습니다심지어 정량. 이 과정에서, 하나는 mRNA-ER 상호 작용의 특성을 조사하기 위해이 분석을 사용할 수 있습니다.

ER-연결되어있는 mRNA의 비율, 태반 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (ALPP) 또는 시토크롬 P450-8B1이 (CYP8B1) 또는 digitonin로 추출 후 수정, 또는 직접 수정되었습니다를 포함 plasmids와 transfected 된 COS-7 세포를 확인하려면 (그림 1 참조, 비교 &quot;Ctrl 키를 추출&quot;을 &quot;Ctrl 키를 Unextracted&quot;). 비 핵 형광은 샘플 및 ER-관련 mRNA의 분율은 (그림 2) 계산에 모두 정량화되...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 - 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을 포함<em&gt; 현장에서</em어느 대량 폴리 (A) mRNA 또는 특정 기록을 검색 할 수&gt; 하이브리드.

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

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14.2K 조회수.  University of Toronto. 여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 - 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을 포함 현장에서 하이브리드.