אנו מבקשים להודות לד&quot;ר קלמנס Wendtner למתן tmuCD40-ליגנד, הלה קו התא.

פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים Murine B (mCD40B) מ splenocytes מחולק לשני חלקים: חלק א &#39;מדגים את הכנת CD40 ליגנד Murine (CD40L) להביע תאים הלה (tmuCD40L הלה), אשר ישמש צלחת מחויב תאים מזין. חלק ב &#39;מתאר את התרבות בפועל Murine CD40-B. א הכנת תאים מזין (tmuCD40L הלה) הלה tmuCD40L הוא קו חסיד האנושי תא אפיתל, אשר מעולם לא צריך להיות ומחוברות לגמרי. התאים splitted ולכן פעמיים בשבוע. Culturing על יותר מ 6 שבועות לא מומלץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הישן מתרבות הראשוני עם פיפטה סטרילית ולשטוף תאים עם 10 מ&quot;ל של 1x PBS. לשאוב PBS לאחר כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של 1x טריפסין / EDTA בתוך בקבוקון 75 ס&quot;מ 2 במשך 10-15 דקות על 37 ° C. השתמש הקשה עדין לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום סוג בר המסתובב בעדינות להפסיק עיכול עם טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל עם טפטפת סטרילית ספין התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ&quot;ל של מדיום סוג בר. ספירת תאים של aliquot ההשעיה התא להכין שלושה צינורות 50 מ&quot;ל עם מספר מתאים של תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 x 10 6 תאים תת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.4 x 10 6 תאים / היטב הקרנה המשמש בתרבות CD40-B Murine תא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאר להקפיא (במידת הצורך). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור subculturing: resuspend 2.5 x 10 6 תאים בינוניים 10 מ&quot;ל הבחירה 75 ס&quot;מ 2 בקבוק תא התרבות (צפיפות התאים 2.5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל) ו דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2. פיצול התאים פעמיים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור התרבות CD40-B Murine התא: אתה צריך 2.4 x 10 6 תאים צלחת 6-גם אחד. Resuspend התאים tmuCD40L הלה בינוני סוג בר בצפיפות של 0.2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ו - מקרינים אותם 78 Gy. פלייט 2 מ&quot;ל של ההשעיה לתוך כל תא היטב דגירה אותם 37 ° C עם 5% CO 2. השתמש צלחות מוכן גירוי B-cell כאשר tmuCD40L תאים הלה הם חסיד (לפחות 4 שעות: לבדוק הדבקות באמצעות מיקרוסקופ, לא לחכות יותר מ 24 שעות כדי להתחיל B-cell גירוי). (המשך ב) </li></ol></li></ol> ב Murine CD40-B תרבית תאים I. הכנת splenocytes לגירוי-CD40 (יום 0): שימו לב: לפני שאתה ממשיך לוודא כי הם תאים מזין חסיד. תמיד להוסיף פתרונות טרי מיד interleukin-4, ו - β-Mercaptoethanol ציקלוספורין למדיום הגידול Murine לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח טחול של C57BL / 6 עכברים (haplotype H-2B) ולשטוף אותו פעמיים 10-20 מ&quot;ל DMEM בתוספת Gentamycin [15μg/mL] על ידי העברת אותה עם טיפ 10 מ&quot;ל פיפטה משפופרת אחת לאחרת. הימנע העברת מזהמים (למשל שיער) של העכבר. בשר טחון הטחול על ידי העברת אותו דרך מסננת תא (100μm) ולשטוף מסננת עם עוד 10 מ&quot;ל של מדיום. ספין למטה splenocytes ב XG 265 7 דקות בטמפרטורת החדר, resuspend אותם 7ml muCD40-B בינוני התא לימפוציטים נפרד על ידי צנטריפוגה צפיפות Ficoll. לשם כך התאים בשכבה על 5 מ&quot;ל עכבר Pancoll (שחומם מראש בטמפרטורת החדר) בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב XG 450 למשך 30 דקות ללא הבלם בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את רוב השכבה העליונה, ומשאיר את השכבה הלימפוציטים באין מפריע על הממשק. העברת שכבת הלימפוציטים לצינור 50 מ&quot;ל טרי, לשטוף פעם עם DMEM 30 מ&quot;ל עם Gentamycin [15μg/mL] על ידי ספינינג למטה XG 265 דקות 7 להסיר תאים אחרים. בטל supernatant ו resuspend התאים 10 מ&quot;ל של מדיום mCD40 B-הכביסה. קבע את מספר תא aliquot ההשעיה התא. קביעת מספר תאים על ידי ספירת aliquot ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה את הכמות הנדרשת של התאים ב XG 265 במשך 7 דקות. עבור צלחת 6-באר 5 x 10 6 תאים / גם יש צורך, ובכך 30 x 10 6 תאים לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend לימפוציטים ב 1.25 x 10 6 תאים / מ&quot;ל במדיום mCD40 B-תרבות בתוספת טרי עם 1 U / mL של interleukin-4 כגורם גדילה, 100 מיקרומטר β-Mercaptoethanol ו 0.63 מיקרוגרם / מ&quot;ל ציקלוספורין כדי למנוע תולדה של T-תאים (ריכוזים בהתחשב מתייחסים בינוני תרבות אחת מ&quot;ל!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם תאים tmuCD40L הלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 4 מ&quot;ל של ההשעיה הלימפוציטים (1.25 x 10 6 תאים / מ&quot;ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 reculture התאים (המשך II.1.). </li></ol> השנייה. תת של תאים mCD40B (יום 3 ולאחר מכן פעמיים בשבוע): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר mCD40B תא מצרר על ידי pipetting במרץ מעלה ומטה עם פיפטה 10 מ&quot;ל ובריכת אותם לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG 265 במשך 7 דקות, לגמרי להחליף את supernatant עם המדיום mCD40 B-הכביסה. בעוד לספור את כמות התאים של aliquot, לסובב את התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות. Resuspend mCD40B תאים בינוניים mCD40 B-תרבות בריכוז של 0.75 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרונות טרי Murine interleukin-4 בריכוז של 1 U / mL, 100 Mercaptoethanol-β מיקרומטר ו 0.63 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ציקלוספורין למדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם תאים tmuCD40L מוקרן הלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 4 מ&quot;ל של ההשעיה תא mCD40B (0.75 x 10 6 תאים / מ&quot;ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב תת התאים כל 3-4 ימים כדי לגמור עם טהור מאוד CD40 המופעל בתאים Murine B לאחר סך של 14 ימים. </li></ol> ג בעיות הירי: מה אם CD40-B תאים לא גדלים? <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקת ביטוי CD40 ליגנד של תאים מזין? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם הצלחת הנכנס מזין תאים המשמשים גירוי מבוגר 24 שעות? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם יש זיהום עם mycoplasma? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם הפתרון interleukin-4 המשמש כתוסף מופשר טרי עשה את זה יש את הפעילות הביולוגית המתאים? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם β-Mercaptoethanol ו ציקלוספורין נוסף בריכוז הנכון? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="איור 1" /> איור 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="איור 1 ב" /> איור 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="איור 1 ד" /> איור 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2.

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הלאומית האירופי לשמירה על חיות מעבדה. בהתייחסו לחוק הגרמני רווחת בעלי החיים החיות נשלטו באופן סדיר על ידי הרשויות המתאימות.

שינויים של פרוטוקול זה אפשרי, במיוחד לגבי מקורו של הגירוי-CD40 ואת סוג של זן העכבר משמש, גם מניב בדור יעילה של תאים Murine CD40-B מופעל. אחמדי et al. הראו תוצאות דומות עבור fibroblasts העכבר transfected עם Murine-CD40 ליגנד. במצגת זו בהקשר של אנטיגן קסנו ניתן לשלול בוודאות, אך מחקרים אינטנסיביים ?...

א הכנת מדיה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תא מזין בינוני סוג בר </td><td> תא מזין מבחר בינוני </td><td></td></tr><tr><td> מגיב </td><td> ריכוז </td><td> מגיב </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 300 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> L-גלוטמין </td><td> 300 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycin B </td><td> 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> mCD40-B בינוני כביסה </td><td> mCD40-B בינוני תרבות </td></tr><tr><td> מגיב </td><td> ריכוז </td><td> מגיב </td><td> ריכוז </td></tr><tr></tr><tr><td> D-ממ </td><td> </td><td> D-ממ </td><td> </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 580 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> L-גלוטמין </td><td> 580 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 4.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> גלוקוז </td><td> 4.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> מ </td><td> 0.1mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> ב שונות ריאגנטים: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> אין סדר </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-ממ </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> חתול לא H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> דלתא בחר </td><td> לאמנות אין 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> חתול לא DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES הצפת </td><td> PAA </td><td> חתול לא S11-001 </td></tr><tr><td> ממ NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> PAA </td><td> חתול לא P02-015 </td></tr><tr><td> רקומביננטי Murine אינטרלויקין 4 </td><td> Immunotools </td><td> חתול לא 12340045 </td></tr><tr><td> ציקלוספורין </td><td> נוברטיס </td><td> חתול לא 0078-0109-01 NDC </td></tr><tr><td> טריפסין / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> ג שונות וחומרים: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> אין סדר </td></tr><tr><td> סטרילי פיפטה טיפים </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 גם צלחת </td><td> NUNC </td><td> חתול לא 140675 </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל צינור חרוטי </td><td> BD פלקון ™ </td><td> חתול לא 352070 </td></tr><tr><td> תרבות רקמות צפחת </td><td> Sarstedt </td><td> חתול לא 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

המחקר על תאים B הוכיחו כי CD40 ההפעלה משפר את יכולת הצגת האנטיגן שלהן. כאשר מגורה עם interleukin-4 ו CD40 ליגנד (CD40L), תאים B האדם ניתן להרחיב ללא קשיים של כמויות קטנות של דם היקפיים בתוך 14 ימים על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; התאים לחולה) מתורמים בריאים, כמו גם חולי סרטן<sup&gt; 1-4</sup&gt;. תאים CD40-B להביע חשוב הלימפה מולקולות ביות והוא יכול למשוך ותאי T<em&gt; במבחנה</em<sup&gt; 5</sup&gt;. יתר על כן הם תופסים ביעילות, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T<sup&gt; 6,7</sup&gt;. תאים CD40-B הוצגו נאיבי לא רק הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון T לתאים<sup&gt; 8,9</sup&gt;. לכן CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) נחקרו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור מבוססי תאים immunotherapy1, 5,10. כדי ללמוד עוד אם התאים CD40-B לגרום האפקטיבית התגובות תא T in vivo ו ללמוד את המנגנון הבסיסי הקמנו מערכת תרבית תאים עבור הדור של CD40 המופעל בתאים Murine B. שימוש splenocytes או מטוהרים תאים B מעכברים C57BL / 6 להפעלה CD40, תנאים אופטימליים זוהו כדלקמן: החל מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים (haplotype H-2B) לימפוציטים הם מטוהרים על ידי צנטריפוגה צפיפות שיפוע ושיתוף תרבותי עם הלה תאים להביע רקומביננטי Murine CD40 ליגנד (tmuCD40L הלה)<sup&gt; 11</sup&gt;. תאים הם recultured כל 3-4 ימים רכיבי מפתח כגון CD40L, interleukin-4, ו-Mercaptoethanol ציקלוספורין הם מתחדש. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו Murine CD40-B תאים (mCD40B) עם פנוטיפ דומה APC-CD40 ל-B תאים אנושיים (איור 1 א, ב). CD40-גירוי מוביל תולדה מהיר והרחבת טהורים ביותר (&gt; 90%) CD19 + B תאים בתוך 14 ימים של תרבית תאים (איור 1 ג, ד). כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 Murine על transfectants חייב להיות מבוקר באופן קבוע (איור 2). Murine CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell הפעלה התמיינות, וכן לחקור את הפוטנציאל שלהם לתפקד APC במבחנה in vivo. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור יצירת חיסון או טיפול מונע נגד גידולים יסייע לענות על שאלות לגבי בטיחות immunogenicity של גישה זו<sup&gt; 12</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Murine Model of CD40-activation of B cells

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.6K Views.  University Hospital of Cologne. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.

Video: Murine Model of CD40-activation of B cells

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

דגם Murine של אסטמה אלרגן מושרה

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Assay רובד לnorovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or mucosa and ensure humoral immunity. Due to their low frequency and location, the study of PCs is difficult in human. We reported a B to PC in vitro differentiation model using selected combinations of cytokines and activation molecules that allow to reproduce the sequential cell differentiation occurring in vivo. In this in vitro model, memory B cells (MBCs) will differentiate into pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), early PCs and finally, into long-lived PCs, with a phenotype close to their counterparts in healthy individuals.&#160;We also built an open access bioinformatics tools to analyze the most prominent information from GEP data related to PC differentiation. These resources can be used to study human B to PC differentiation and in the current study, we investigated the gene expression regulation of epigenetic factors during human B to PC differentiation.

Using multi-step culture systems, we report an in vitro B cell to plasma cell differentiation model.

חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...