מחקר במעבדה שלנו נתמך על ידי מקס פון Pettenkofer המכון, לודוויג מקסימיליאן, אוניברסיטת מינכן, קרן המחקר הגרמנית (DFG, HI 1511/3-1) ואת הפרווה Bundesministerium Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Genomics זיהום רפואי&quot; היוזמה ( 0315834C).

1. ההכנות בידוד LCV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס ייצור את הלגיונלה pneumophila DsRed-Express 13,14 ממניות וגליצרול על צלחות אגר CYE עם 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל chloramphenicol (רמ&quot;א) ארבעה ימים לפני בידוד LCV. דגירה של חיידקים על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את זרעי 1 x 10 7 ד discoideum בהפקת ה-GFP-calnexin או RAW264.7 מקרופאגים Murine ב 75 התרבות 2 ס&quot;מ רקמות צלוחיות 1 זיהום לפני יום. השתמש 10 מ&quot;ל HL5 בינוני עם 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל G418 של ד discoideum ו דגירה אמבות ב 23 ° C. עבור RAW264.7 מקרופאגים להשתמש 10 מ&quot;ל RPMI 1640 בינוני השלימו עם FCS 10% (חום מומת) ו גלוטמין 1%, ולהגדיל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. השתמש לפחות שלוש צלוחיות 75 2 ס&quot;מ לכל זיהום המדגם (6 מינימום 7 x 10 תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תרבות בין לילה עם ל &#39; pneumophila מהצלחת CYE. קח מבחנה 15 מ&quot;ל עם 3 מ&quot;ל בינוני כןו 5 מיקרוגרם / CAM מ&quot;ל. לחסן עם μl 100 ההשעיה חיידקי להניב OD 600nm של 0.1. דגירה התרבות לילה על ההגה סיבוב מעל הראש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 21-22 שעות. </li></ol> 2. LCV בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום של ד תאים discoideum להסיר את האנטיביוטיקה, אשר יפריע זיהום הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את OD של תרבות לילה. חיידקים צריכים להגיע infectivity לשיאם ב 600nm OD של ≥ 3, אשר תואמים את 2 x 10 9 חיידקים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את התאים על ידי הוספת כ 500 μl של ל &#39; pneumophila התרבות לילה לתאים הגדלים בינוני HL5 10 מ&quot;ל (discoideum ד) או 10 מ&quot;ל RPMI 1640 (מקרופאגים). זה מתאים ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 50. לאחר מכן הזיהום מסונכרן על ידי צנטריפוגה של החיידק לתוך התאים ב 500 × ג&#39;10 דקות. צנטריפוגה אחריועל דגירה של ד discoideum תאים במהירות של 25 ° C ואת RAW264.7 מקרופאגים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, בהתאמה. זמן ההדבקה של שעה 1 כוללת את הצעד צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדבקה להסיר בינוני לשטוף את התאים פעם אחת כדי להסיר את החיידקים תאיים. השתמש קר כקרח חיץ Sorc עבור ד discoideum וקרח קר PBS עבור RAW264.7 מקרופאגים. הוסף 3 מ&quot;ל HS חיץ, השלימו עם מעכבי פרוטאז (רוש) על כל בקבוק ולאסוף את התאים באמצעות מגרד התא. בריכת דגימות המתאימים במבחנה 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור homogenization של השימוש מדגם 3 מ&quot;ל פלסטיק Luer-נעל מזרקים פלדה אל חלד הכדור homogenizer. ודא כי אתה עובד על קרח. לפני שמתחילים, לשטוף homogenizer הכדור עם מים מזוקקים, כדי למנוע זיהום חומר ניקוי ולשטוף אותו עם חיץ קר קרח HS להיפטר בועות אוויר. השתמש 8 אישור הכדור מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מ&quot;ל 1 3 לתוך und את המזרק להרכיב אותו על הדואר homogenizer. לחצו על מדגם הלוך ושוב תשע פעמים דרך homogenizer. להחליף את המזרקים לאחר מכן, כדי למנוע זיהום בחומר הלא הומוגני. איסוף ובריכת מדגם הומוגני במבחנה 15 מ&quot;ל ולקחת מדגם 150 μl ניתוח מיקרוסקופי. לפני שתמשיך מדגם שונה לפרק ולשטוף homogenizer הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום homogenate עם CS 2% או FCS למשך 30 דקות על שאכר על הקרח או על גלגל תקורה-ספינינג (10-20 סל&quot;ד) בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חסימת משתמשים נוגדן זיקה-מטוהרים העיקרי נגד SidC (דילול 1:3000) או נגד הסמן כל חיידקי אחר מחייב אך ורק קרום LCV. מערבולת נוגדנים פתרון לפני הוספתו homogenate. דגירה לדוגמה עבור שעות 1 על שאכר על הקרח או על הגלגל מעל הראש, ספינינג (10-20 סל&quot;ד) בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, מכינים את שיפוע Histodenz. השתמש מבחנה 15 מ&quot;ל לכל צבע ושלושה 75 ס&quot;מ 2 בקבוקי מדגם 1. אשוחרחוב, להוסיף 5.75 מ&quot;ל של Histodenz 35% ל הצינור, ושנית, בזהירות להוסיף 5.75 מ&quot;ל של תמיסת Histodenz 10% למעלה. לאחר מכן בזהירות להניח את הצינורות לאורך אופקית של 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של homogenate מגיב עם חסימת נוגדן ראשוני, צנטריפוגות ב × 600 גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C עד גלולה המדגם. מחק supernatant ו resuspend גלולה במאגר HS 1.5 מ&quot;ל. להעביר את דגימות צינור טרי 15 מ&quot;ל הבדיקה לקחת דגימה 40 μl ניתוח מיקרוסקופי בהמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה גלולה עם נוגדנים משני - מחשבי Mac נגד ארנב עיזים IgG חרוזים Micro (דילול 01:25) - למשך 30 דקות על שאכר ב 4 ° C. בינתיים, לשים את העמודות על בעל MACS מגנטי לאזן אותם עם מאגר 0.5 HS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, החל את דגימות לעמודה. איסוף 150 μl של זרימה באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לאחר מכן. לשטוף את הטור שלוש פעמים עם חיץ 0.5 HS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודות מ tהוא מגנט eluate את LCVs עם חיץ 0.5 HS מ&quot;ל של גמירה מיידית. קח לדוגמה 20 μl לניתוח מיקרוסקופיים. שלב טיהור על ידי הפרדה חיסונית מגנטי צפוי להניב ל 1 × 10 7 נגוע ד discoideum תאים כ -1 × 10 6 LCVs שלמים, אשר על פי שבעה מועשר ב eluate לעומת זרימה עד 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צינורות מעבר צבע Histodenz בחזרה למצב אנכי ובזהירות לטעון eluate למעלה. בצנטריפוגה צינורות ב 3350 × g עבור שעות 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה לקחת 1.5 מ&quot;ל שברים החל מהחלק התחתון של המבחנה באמצעות ארוכה זכוכית פיפטה פסטר. בסך הכל שמונה לאסוף שברים, כל אחד מהחלק התחתון של הצינור. שכבות לא נראים לעין נצפות שיפוע Histodenz מתמשך. התשואה הגבוהה ביותר LCVs צפוי בדרך כלל ביחס של ~ 2 בשבריר 4 × 10 5 LCVs שלמים לכל 1 × 10 7fected אמבות 13. כמויות קטנות של LCVs נוכחים גם שברים 3 ו -5 בהתאמה. כך, התשואה הכוללת של LCVs מטוהרים הוא ~ 1 × 10 6 LCVs שלמים לכל 6 × 10 7 נגוע ד discoideum תאים 13. ההתאוששות של LCVs יכול להתבצע בטמפרטורת החדר (RT), ו LCVs נראים יציבים במשך כמה שעות. </li></ol> 3. ניתוח מיקרוסקופי של דגימות שנאספו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 24 גם שטוח התחתונה התרבות צלחת רקמות עם פולי-L-ליזין coverslips מצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה כל מדגם נלקח במהלך טיהור LCV בתוספת 150 μl של חלק זה צפיפות הדרגתי לתוך צלחת של 24 הבאר. הוסף 0.5 מ&quot;ל חיץ HS היטב בכל לדלל את ריכוז גבוה Histodenz. לאחר מכן, בצנטריפוגה צלחת ב 600 × ג&#39;10 דקות ב 4 ° C. מוציאים בזהירות את supernatant ולתקן את הדגימות עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות ב RT. לאחר קיבוע לשטוף את דגימות פעמיים. לנודואר Sorc עבור ד discoideum ו PBS עבור RAW264.7 מקרופאגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את דגימות ה-GFP-calnexin המבטאים ד discoideum, נלקחה ב שלבים שונים במהלך הבידוד LCV, ישירות למוצרי שקופיות הזכוכית באמצעות Vectashield למשל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של דגימות RAW264.7 מקרופאגים, שצולמו במהלך שלבים שונים בידוד LCV, עם פתרון חסימת (1% BSA ב PBS) 10 דקות ב RT. השתמש נוגדנים נגד SidC העיקרי להכתים את LCVs ו דגירה של 1h בחדר רטוב ב RT (זיקה, מזוכך הארנב נגד SidC: 1:1000 בחסימת המאגר). לאחר מכן לשטוף את דגימות שלוש פעמים עם PBS. דגירה עם נוגדנים משני (למשל נגד ארנב Cy5: 1:200 לבלום פתרון) למשך 30 דקות בחדר רטוב כהה RT. סוף סוף, לשטוף את דגימות שלוש פעמים עם PBS ו הר להם on-שקופיות הזכוכית באמצעות Vectashield למשל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , מורפולוגיה שלמות וכמות של LCVs מבודד GFP-calnexin להביע ד דיסcoideum או RAW264.7 מקרופאגים הם נותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצוידים במסננים הולמים. </li></ol> 4. נציג תוצאות איכות תשואה של טיהור LCV ידי הפרדה חיסונית הזיקה ואת שיפוע צנטריפוגה צפיפות יכולה להיות מלווה מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). סקירה של דגימות שנאספו במהלך הבידוד LCV מ ד discoideu מ &#39;או מקרופאגים מוצג (איור 2). Homogenate של ל pneumophila נגועים phagocytes מראה LCVs שלמים, אבל גם הרבה פסולת תאים וחיידקים תאיים. לאחר pelleting לדוגמה, התמונה דומה homogenate, לפעמים קצת צפוף. מאז LCVs שלמים לדבוק הטור, זרימה דרך מכיל בעיקר חיידקים תאיים ופסולת התא. לאחר משחררי מדגם מהעמודה, eluate מכיל LCVs שלמים בכמות גדולה. בידינו, LCV purificati<html> ב נראה יעיל יותר עבור ד discoideum מאשר מקרופאגים. ב ד את discoideum vacuoles פתוגן מופיעים עגולים תשואה של LCVs מבודדים הוא יותר מ -10 פעמים גבוה יותר בהשוואה מקרופאגים (איור 3). ב מקרופאגים שלמים LVCs מוכתמים נוגדנים שונים מופיעים גם יותר צורה בלתי מוגדרת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig1.jpg" /> 1. תרשים סכמטי סקירה של בידוד LCV. א) בידוד של LCVs ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדן זיקה, מטוהרים מפני SidC חלבון חיידקי מפעיל, למקם אך ורק קרום LCV. MACS משני מיקרו חרוז מצמידים נוגדנים ואת מגנט משמשים לבודד LCVs מן ההריסות התא. ב) לאחר חיסוני מגנטיים LCVs ההפרדה מטוהרים עוד יותר על ידי צנטריפוגה שיפוע Histodenz צפיפות. LCVs מועשרים בשבריר 4. upload/4118/4118fig2.jpg &quot;/&gt; דוגמאות באיור 2. שנאסף במהלך טיהור LCV. תמונות homogenate, גלולה, זרימה דרך eluate ו מ ד discoideum או מקרופאגים מתוארים. דגימות עולה ל pneumophila לייצר DsRed-Express (אדום) ד discoideum בהפקת ה-GFP-calnexin האות (על לוח ירוק, העליון) או מקרופאגים מוכתמים נוגדנים נגד SidC (ציאן, הפאנל התחתון). ברים, 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig3.jpg" /> איור 3. מטוהרים LCVs מ ד discoideum או מקרופאגים. הדגימות להראות חלק 4 לאחר צנטריפוגה צפיפות Histodenz שיפוע של ל pneumophila לייצר DsRed-Express (אדום) (א) ד discoideum בהפקת ה-GFP-calnexin האות (ירוק) או (ב) מקרופאגים מוכתמים נוגדנים נגד SidC (ציאן). ברים, 10 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li><li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638 (2011).</li><li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchors+for+effectors:+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella.">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles.">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li><li>L&#252;hrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li><li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., L&#252;hrmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage.">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li><li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila.">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li><li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation.">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

בניגוד לשיטות שפורסמו בעבר, פרוטוקול זה מבוסס על שני שלבים, 1 הפרדת LCVs ידי גישה חיסונית מגנטי, והשני, טיהור LCVs על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. בידוד LCV ניתן בעקבות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כאשר גם חיידקים שכותרתו fluorescently ו-GFP תאים מייצרי נוגדנים או כתמים משמש. פרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, ישר קדימה השיטה, מה שגורם להעשרת LCVs עם טוהר גבוה. חשוב לציין, מעכבי פרוטאז במאגר homogenization נדרש RAW264.7 מקרופאגים, אבל לא חובה עבור discoideum ד 13. בעיקרון, פרוטוקול יכול להיות מאומץ על פתוגנים אחרים או תאים מארחים, כל עוד סמן ספציפי, סלקטיבי לאיתור קיים, אשר יש צורך לשלב ההפרדה. באופן אידיאלי, סמן מובהק הוא ממוצא חיידקי, מועברים אל קרום vacuole,ND סלקטיבי למקם שם. מיקוד התא המאכסן סמן תוצאות סביר רצוי שיתוף טיהור vacuole הפתוגן עם תאים תאים אחרים המארחות. לאחר סמן מובהק של vacuole הפתוגן מזוהה, נוגדן חד שבטי או polyclonal מתאים צריך לגדול. עבור כל נוגדן ראשוני ריכוז מגיב חסימת צריך להיות מותאם, כמו חסימת חומרים כימיים שאינם FCS יכול להיות מתאים יותר (למשל ה-BSA, דה lipidated חלב, חומרים כימיים אחרים החוסמים זמינים מסחרית). עוד נקודה קריטית היא infectivity של הפתוגן. החיידקים המשמשים זיהום צריך להיות בשלב ביותר שלהם מזהם. ל pneumophila, למשל, צריך להיות מבוגר לשלב הצמיחה נייח post-exponential/early בתרבות נוזלי. בתנאים אלה, החיידקים גם מורפולוגית אחידה (~ 2 x 0.5 מיקרומטר), לעומת חיידקים הגדלים על צלחות אגר CYE. יתר על כן, antibiotics בשימוש ואולי במדיום תרבית תאים יש להסיר לפני ההדבקה, כדי למנוע נזק infectivity נמוך על חיידקים. כדי למנוע השפעה שלילית על יעילות ספיגת, phagocytes צריכים הגיעו confluency של כ% 80 (לא יותר) בזמן של זיהום. לבסוף, אם כי תקופת הדגירה של שעה 1 זה הזמן זיהום תקן ל pneumophila, מניב האוכלוסייה הומוגנית למדי ויציב של LCVs, בנקודות זמן אחרות ניתן לבחור ללימודי proteomic או ביוכימי על היווצרות LCV 13. פעם השיטה הנ&quot;ל היא הוקמה עבור זוג הפתוגן-מארח נתון בתא, אפשר גם לבחון זני חיידקים מוטנטים ו / או תאים מארחים שונים, כולל ד &#39; discoideum מוגדר מוטציות המחיקה. באופן כללי, vacuoles פתוגן מטוהרים עם פרוטוקול זה ניתן לנתח בשיטות שונות, כולל מיקרוסקופיה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרונים), ביוכימיות (מבחני המערבי כתם), כפי שאנוLL כמו proteomics ו lipidomics. על שיטות האחרונים, מומלץ לתאם עם הממונה על proteomics / lipidomics ניתוח התנאים חיץ, כמויות מדגם ועיבוד במורד מטוהרים vacuoles הפתוגן.

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

פתוגן אופורטוניסטי הלגיונלה pneumophila הוא חיידק עמיד אמבה, אשר גם משכפל ב מקרופאגים מכתשיים ובכך גורם לדלקת ריאות חמורה &quot;הליגיונרים&quot; מחלה &quot;1. ב phagocytes protozoan ו יונקים, ל pneumophila מעסיקה מנגנון משומר כדי ליצור מסוים, שכפול התא, מתירנית, &quot;הלגיונלה המכיל vacuole&quot; (LCV). היווצרות LCV דורש חיידקי ICM / דוט סוג מערכת הפרשת IV (T4SS), אשר translocates רבים כמו 275 &quot;מפעיל&quot; חלבונים לתוך התאים המארחים. Effectors לתפעל את החלבונים המארחות, כמו גם שומנים לתקשר עם הפרשה, האברונים endosomal ואת המיטוכונדריה 2-4. היווצרות LCVs מהווה תהליך מורכב, חזק מיותר, שהיא קשה להבנה בצורה רדוקציוניסטית. גישה אינטגרטיבית נדרש להבין באופן מקיף היווצרות LCV, כולל ניתוח גלובלי של נתיבעוגן מארח גורם האינטראקציות והדינמיקה הזמן והמרחב שלהם. כצעד ראשון לקראת מטרה זו, LCVs שלמים הם מטוהרים ונותחו על ידי proteomics ו lipidomics. הרכב היווצרות של הפתוגן המכילים vacuoles נחקר על ידי ניתוח proteomic באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית או 2-D ג&#39;ל אלקטרופורזה מצמידים את ספקטרומטר מסה. Vacuoles מבודד או discoideum אדמה חברתית אמבה Dictyostelium או phagocytes יונקים טיפח שושנת יריחו 5, 6 ליסטריה, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 או סלמונלה הלגיונלה spp. 10. עם זאת, הפרוטוקולים טיהור המועסקים מחקרים אלה זמן רב ומייגע, כפי שהם דורשים מיקרוסקופ אלקטרונים למשל לנתח מורפולוגיה LCV, יושר וטוהר. בנוסף, פרוטוקולים אלה אינם מנצלים תכונות ספציפיות של vacuole הפתוגן עבור enrichment. השיטה המוצגת כאן מתגבר על מגבלות אלה על ידי העסקת ד discoideum לייצר סמן פלואורסצנטי LCV ועל ידי מיקוד SidC חיידקי חלבון מפעיל, אשר סלקטיבי עוגנים קרום LCV באמצעות קשירה phosphatidylinositol 4-פוספט (PtdIns (4) P) 3,11. LCVs מועשרים בשלב הראשון על ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדן זיקה-מטוהרים העיקרי נגד SidC ו נוגדנים משני מצמידים את החרוזים מגנטיים, ולאחר מכן בשלב השני על ידי צנטריפוגה קלאסית צפיפות Histodenz שיפוע 12,13 (איור 1) . המחקר proteome של LCVs מבודד ד discoideum עולה יותר מ 560 התא המארח חלבונים, כולל חלבונים הקשורים שלפוחית ​​phagocytic, המיטוכונדריה, מיון, Golgi, כמו גם GTPases שונים, אשר לא היו מעורבים ביצירת LCV לפני 13. LCVs מועשר מטוהרים עםפרוטוקול המתואר כאן ניתן לנתח עוד יותר על ידי מיקרוסקופ (immunofluorescence, במיקרוסקופ אלקטרונים), בשיטות ביוכימיות (מערב כתם) וגישות proteomic או lipidomic.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

מאמר זה מתאר שיטה בידוד וטיהור של שלמה<em&gt; הלגיונלה</em&gt; המכילים vacuoles (LCVs) של אמבה ומקרופגים. פרוטוקול שני שלבים כולל העשרת LCV ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדנים נגד סמן LCV חיידקים טיהור נוספת על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.

טיהור vacuoles הפתוגן מ<em&gt; הלגיונלה</em&gt; נגועים phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

purification-of-pathogen-vacuoles-from-legionella-infected-phagocytes

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

12.4K Views.  Ludwig-Maximilians-Universität. מאמר זה מתאר שיטה בידוד וטיהור של שלמה הלגיונלה המכילים vacuoles (LCVs) של אמבה ומקרופגים. פרוטוקול שני שלבים כולל העשרת LCV ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדנים נגד סמן LCV חיידקים טיהור נוספת על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.

Video: Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA טיהור מן intracellularly Grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי Macrophage

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes<em&gt; במבחנה</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.