עבודה זו מומנה על ידי מענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), פריץ תיסן-Stiftung וCharité / MDC.

1. הרדמת בעלי חיים וקצירת איברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכבר באמצעות זריקת intraperitoneal (IP) של קטמין (200 מ&quot;ג / קילו BW) וXylazine (20 מ&quot;ג / קילו BW). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לanticoagulate להזריק IP הפארין 250 יחב&quot;ל כדי למנוע היווצרות קרישי דם וקרישים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד ההרדמה עמוקה הוא הגיע, אשר מאופיינת על ידי areflexia. כדי לבדוק areflexia רפלקס, בדיקת קרנית על ידי נגיעה בקרנית או רפלקס טיסת ניסוי על ידי צביטת זנב בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר על שולחן ניתוחים ולתקן אותה במצב שכיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך העור וקיר הבטן מתחת xiphoid ולבצע פתיחת בית חזה צדפה: הארך את הקיצוץ לשני הצדדים לאורך קשת costal ולאחר מכן לחתוך את הצלעות בקו בית השחי המדיאלי, להסיט את בית החזה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קרום לב, אתר כולים נהדרים. לחץ בעדינות על זנב לב טוב יותר כדי להציג את אב העורקים. מהדק את אב העורקים באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הלב בקעירות זוג של<html> cissors וינתח את כל כלי חיבור עם חתך אחד אחד. הקפד לשמור על חלק גדול מספיק של אב עורקים עולים לcannulation Langendorff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר מייד ללב שחוט צלחת פטרי מלא בקרח קר ופתרון מראש חומצן 1 (לפתרונות, ראה טבלת 1). </li></ol> 2. הכנת זלוף לב וLangendorff <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate אב העורקים עם צינורית פלדת 1.8F. הקפד להימנע מתסחיף אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבע אב עורקים בצינורית עם תפר כירורגית והתקפי לב, מפוצץ ב1 מ&quot;ל של פתרון 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורית עם מנגנון Langendorff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא זמן מפתיחת בית החזה לcannulation Langendorff אינה עולה על 120 שניות כדי למנוע פציעה ממושכת איסכמיה / reperfusion לשריר הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב ינקב עם 10 מ&quot;ל של Ca 2 + ללא פתרון 2 (4 מ&quot;ל / דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב ינקב עם פתרון collagenase 3 דקות ל8 (4 מ&quot;ל / דקה). </li></ol>&quot;&gt; 3. מייקר דיסוציאציה le של הלב צ&#39;יימברס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב העברה לתוך צלחת שחוממה מראש 100-מ&quot;מ פטרי המכיל Ca 2 הנמוך פתרון + 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את אב עורקים ורקמות אחרות שאינן לבביות עם מספריים והשליכו אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אטרייה נפרדת וחדרי לב ולהמשיך בכל תא בנפרד. שמור על תאים שקועים בפתרון 4. השתמש בכמויות קטנות (פחות מ 5 מ&quot;ל). </li></ol> 4. דיסוציאציה נוספת של cardiomyocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cardiomyocytes פרוזדורים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייחד cardiomyocytes פרוזדורים להעביר אטרייה לתוך צלחת תרבות נפרדת מראש מחוממת 100-מ&quot;מ ולנתק את הרקמה באמצעות משייכתו בעדינות אותו לגזרים עם מלקחיים עדינים. ודא ניתוק כמעט מוחלט של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 1 מ&quot;ל עם קצה מוגדל אש מלוטשת פיפטה פלסטיק להשעות את התאים ב1 מ&quot;ל של פתרון 5 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את התאים מפסולת באמצעות מסנן תא (200 מיקרומטר גודל רשת). </li> &lt;li&gt; הוסף פתרון 5 מ&quot;ל 5 עד השעית התא וצנטריפוגה עבור 2 דקות בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים פעלו תחת מכסה מנוע תרבית תאים. בטל supernatant מחדש הושעה-גלול ב 5 מ&quot;ל של פתרון 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שקיעה על ידי כוח הכביד למשך 10 דקות בצינור מ&quot;ל 15, סרכזת לדקות 1 בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר. הסר את supernatant. Re-להשעות התאים בהתאם לכמותם ב1-5 מ&quot;ל של פתרון 6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cardiomyocytes חדרית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את אזור החדר השמאלי של עניין עם מלקחיים עדינים ב5 מ&quot;ל של פתרון 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את תאים על ידי pipetting בעדינות עד שרוב התאים המופרדים. להעביר את פתרון התא לאחר הסינון (200 גודל רשת מיקרומטר) לתוך צינור מ&quot;ל 50, להוסיף נפח של 25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עבור 2 דקות בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים פעלו תחת מכסה מנוע תרבית תאים. הסרת supernatant, מחדש להשעות הגלולה ב 25 מ&quot;ל שלפתרון 6 ולאפשר שקיעה של התאים למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ולהסיר את supernatant, להוסיף 25 - 50 מיליליטר פתרון 6 בתאים. </li></ol></li></ol> 5. הכנת cardiomyocytes לאלקטרופיזיולוגיה הניידת, או אם מחקרים ביוכימיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללימודי electrophysiology, לשמור על myocytes בפתרון 6 בצינור מ&quot;ל 50 ומעכב את השקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחקרים ביוכימיים, הדמית סיד למשל, myocytes צלחת על צלחת תרבות laminin מצופית תא (20 מיקרוגרם / המ&quot;ל laminin ב PBS ריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתמת immunofluorescence להכין צלחת צלחת תרבית תאים עם תלושי כיסוי זכוכית ומצופית בפתרון laminin (ריכוז סופי 50 מיקרוגרם / המ&quot;ל laminin ב PBS). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון לפני myocytes ציפוי. פלייט התאים ולשלוט בצפיפות התאים באמצעות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן myocytes לדבוק לכסות להחליק לשעת 1 ב 37 ° C ב2% CO 2, להסיר את הפתרוןולהתחיל מייד בפרוטוקול הליך הכתמה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם מקבע, למשל 4% PFA ב PBS (pH 7.5) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ופעל עם שלושה שלבי כביסת PBS עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לpermeabilize התאים ולעכב נוגדן מחייב נוקב דגירת myocytes עם סרום 10%, טריטון 0.3%, 0.2% BSA ב PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם הנוגדן הראשוני לשעה 1 ב 37 ° C ולשטוף כפי שתואר קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם הנוגדן המשני לשעה 1 בטמפרטורת חדר. לcounterstain גרעינים וα-actinin השימוש DAPI וphalloidin מצומדת fluorochrome (אלקסה פלואוריד 488, Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה, להעביר את כיסוי הזכוכית מחליק בזהירות על שקופיות מיקרוסקופ silane טופלו ותאים להטביע בהרכבה בינונית פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol> 6. הנייד אלקטרופיזיולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הקלטות כל תא תיקון-מהדק בfreמבודד cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים shly בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת cardiomyocytes מופיע בריא לתא זלוף מלא בנפח מוגדר של פתרון אמבטיה תאית. 117 mM NaCl, 4 המ&quot;מ KCl, 1 mM KH 2 4 ת.ד., 4 המ&quot;מ 3 NaHCO, 1.7 המ&quot;מ MgCl 2, 3 המ&quot;מ CoCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ, גלוקוז 10 מ&quot;מימ, וTetrodotoxin 0.02 מ&quot;מ (TTX), (pH 7.4) . השתמש NaOH להתאמת ערך ה-pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בציוד מהדק תיקון ראוי (IX71 מיקרוסקופ כלומר הפוך, מגבר 700B Multiclamp, מערכת Digidata 1440A רכישה ומחשב עם pClamp10.3 תוכנה (התקנים מולקולריים)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipettes תיקון עם התנגדויות של 3-5 MΩ כאשר התמלא פתרון תאי המכיל 130 מ&quot;מ KCl, 2 המ&quot;מ MgCl 2, HEPES 11 מ&quot;מ, 11 המ&quot;מ EGTA, 5 המ&quot;מ Na 2 ATP, 0.4 המ&quot;מ Na 2 GTP, 5 מ&quot;מ Na 2 CP ו -4.9 mM CaCl 2 (pH 7.2). השתמש KOH להתאמת ערך ה-pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר החוצה K + זרמי duצעדי טבעת 4.5-sec מתח לבחון פוטנציאלים בין -60 ו50 mV במרווחי 10-MV מפוטנציאל החזקת -70 mV לאחר 20-msec prepulse לmV -40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא זרמי דליפה תמיד &lt;100 הרשות פלסטינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחה של K + זרמים השונות להשתמש במעכבים ספציפיים כמו 4-aminopyridine (4-AP: Biomedicals ICN, אירווין, קליפורניה, ארה&quot;ב), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) או Tetraethylammonium (תה; סיגמא). פתרוני מניות צריכים להיות מוכנים בפתרון אמבטיה תאי, ולהחיל ישירות על הסביבה הקרובה ביותר האפשרית של התא דרך microtip לאחר הקלטות &quot;בסיסיות&quot;. האיזון צריך להיות מותר ל2-3 דקות לפני הקלטות &quot;סמים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח לנרמל אמפליטודות נוכחית בתאים בודדים לגודל תא (קרום קיבול כל תאים). לנתח נתונים מחוברים באמצעות pClamp10.3 תוכנה (התקנים מולקולריים) או תוכנה דומה. </li></ol>

<ol>
	<li>Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+all+voltage-gated+potassium+channels+use+MiRPs?.">Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs?.</a> Circ. Res. 88, 981-983 (2001).</li><li>Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRP1+forms+IKr+potassium+channels+with+HERG+and+is+associated+with+cardiac+arrhythmia.">MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia.</a> Cell. 97, 175-187 (1999).</li><li>Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+voltage-gated+K++channel+subunits+in+adult+rat+heart.+Relation+to+functional+K++channels?.">Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels?.</a> Circ. Res. 77, 361-369 (1995).</li><li>Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+atrial+fibrillation+on+the+risk+of+death:+the+Framingham+Heart+Study.">Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study.</a> Circulation. 98, 946-952 (1998).</li><li>Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+the+calcium-independent,+depolarization-activated+K++currents+in+rat+atrial+myocytes.">Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).</li><li>Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+atrial+ion+channel+and+transporter+subunit+gene-expression+remodeling+associated+with+valvular+heart+disease+and+atrial+fibrillation.">Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 471-481 (2005).</li><li>Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+transient+outward+K++current+diversity+in+mouse+ventricular+myocytes.">Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).</li><li>Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNE3+mutation+V17M+identified+in+a+patient+with+lone+atrial+fibrillation.">KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation.</a> Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).</li><li>Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+KCNQ1+current+by+atrial+fibrillation-associated+KCNE4+(145E/D)+gene+polymorphism.">Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism.</a> Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).</li><li>McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MinK-related+peptides.">The MinK-related peptides.</a> Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).</li><li>Pongs, O., Schwarz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancillary+subunits+associated+with+voltage-dependent+K++channels.">Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels.</a> Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).</li><li>Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+function+in+IKs+secondary+to+a+mutation+in+KCNE5+associated+with+atrial+fibrillation.">Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation.</a> Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).</li><li>Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+of+97T+polymorphism+in+KCNE5+to+risk+of+atrial+fibrillation.">Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation.</a> Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).</li><li>Roepke, T. K., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacogenetics+and+cardiac+ion+channels.">Pharmacogenetics and cardiac ion channels.</a> Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).</li><li>Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+kcne2+impairs+ventricular+repolarization+via+disruption+of+I(K,slow1)+and+I(to,f).">Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f).</a> FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).</li><li>Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+polymorphism+associated+with+antibiotic-induced+cardiac+arrhythmia.">A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).</li><li>Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+in+KCNE1-null+mice.">Atrial fibrillation in KCNE1-null mice.</a> Circ. Res. 97, 62-69 (2005).</li><li>Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+KCNE2+gain-of-function+mutation+in+patients+with+familial+atrial+fibrillation.">Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation.</a> Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).</li><li>Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[The+association+of+single+nucleotide+polymorphism+of+slow+delayed+rectifier+K++channel+genes+with+atrial+fibrillation+in+Han+nationality+Chinese].">[The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese].</a> Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).</li><li>Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=minK-related+peptide+1+associates+with+Kv4.2+and+modulates+its+gating+function:+potential+role+as+beta+subunit+of+cardiac+transient+outward+channel?+Circ.">minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ.</a> Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

עם ההתפתחות הגוברת של זני עכבר מהונדס גנטי כדי ללמוד תפקוד לב ולב הפתולוגיה הקשור למחיקת גן יש גם עניין גובר בשיטות מיוחדות כדי ללמוד השפעות של מחיקת הגן הספציפית במבחנה. במעבדתנו אנו לומדים את התפקידים של משפחה של תת יחידות עזר ערוץ KV על repolarization לב. גני KCNE מ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td></tr><tr><td> Tetrodotoxin </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> 4-aminopyridine </td><td> Biomedicals ICN </td></tr><tr><td> Heteropodatoxin 2 </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> Tetraethylammonium </td><td> כימיקלי סיגמה </td></tr><tr><td> סוג collagenase 2 </td><td> וורטינגטון </td></tr></tbody></table>

isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes

גני KCNE לקודד למשפחה קטנה של יחידות משנה נלווית ערוץ KV היוצרים קומפלקסי heteromeric עם יחידות משנת KV ערוץ אלפא לשנות את המאפיינים התפקודיים שלהם. מוטציות בגני KCNE כבר נמצא בחולים עם הפרעות בקצב לב, כגון תסמונת QT הארוכה ו / או פרפור פרוזדורים. עם זאת, הפתופיזיולוגיה המולקולרית המדויקת המובילה למחלות אלה נותרת חמקמקה. במחקרים קודמים את תכונות אלקטרו של המחלה גורמת למוטציות בגנים אלו בעיקר נחקרו במערכות ביטוי Heterologous ואנחנו לא יכולים להיות בטוחים אם ניתן לתרגם ישירות את ההשפעות שדווחו לcardiomyocytes ילידים. במעבדה שלנו ולכן אנו משתמשים בגישה שונה. אנחנו ישירות לחקור את ההשפעות של מחיקת גן KCNE בcardiomyocytes המבודד מעכברים בנוקאאוט על ידי סלולרי electrophysiology - טכניקה ייחודית שאנו מתארים בגיליון זה של כתב העת של ניסויים באופן חזותי. את הלב מGeneticaעכברים מהונדסים KCNE lly נכרתו במהירות ומותקן על גבי מכשיר Langendorff ידי cannulation אב עורקים. Ca 2 + חינם בשריר הלב, כבול בEGTA, וניתוק של myocytes הלב ואז הושג על ידי זלוף המדרדר של עורקים הכליליים עם התמחה נמוך Ca + 2 collagenase חיץ המכיל. אטרייה, קיר חופשי חדרית ימין והחדר השמאלי ואז יכולה להיות מופרדת על ידי טכניקות מייקרו. אז סיד חוזר ומוסיף לאט לcardiomyocytes המבודד בצעד מרובה הכולל הליך כביסה. cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים של מראה בריא ללא התכווצויות ספונטניות האז העביר מייד לניתוחים אלקטרופזיולוגים ידי טכניקת תיקון מהדק או ניתוחים ביוכימיים אחרים בתוך 6 השעות הראשונות שלאחר בידוד.

בידוד של cardiomyocytes Murine הבוגר מעכברים מהונדסים גנטי כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים של עניין במבחנה הפך לכלי רב עצמה עוד יותר להבין פתופיזיולוגיה לב. שיטה זו משמשת כיום על ידי מספר קטן, אך גדל רק במעבדות מדע בסיסיות ברחבי העולם. עם זאת, בידוד של cardiomyocytes Murine חדרי?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Kv ערוץ התפקוד קשור הפרעות בקצב לב. על מנת לחקור את המנגנונים המולקולריים שיובילו להפרעות קצב כאלה אנו מנצלים פרוטוקול שיטתי לבידודה של cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים מעכברי KV ערוץ נלווה למקטע בנוקאאוט. cardiomyocytes המבודד יכול מייד לאחר מכן לשמש למחקרים אלקטרו סלולריים, (IF) מבחנים ביוכימיים או immunofluorescence.

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

isolation-kv-channel-recordings-murine-atrial-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  Charité Medical Faculty and Max-Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC). Kv ערוץ התפקוד קשור הפרעות בקצב לב. על מנת לחקור את המנגנונים המולקולריים שיובילו להפרעות קצב כאלה אנו מנצלים פרוטוקול שיטתי לבידודה של cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים מעכברי KV ערוץ נלווה למקטע בנוקאאוט. cardiomyocytes המבודד יכול מייד לאחר מכן לשמש למחקרים אלקטרו סלולריים, (...

Video: Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a homogenous population of cells, the iPSC-CMs generated by current differentiation protocols represent a mixture of cells with ventricular-, atrial-, and nodal-like phenotypes, which complicates phenotypic analyses. Here, a method to optically record action potentials specifically from ventricular-like iPSC-CMs is presented. This is achieved by lentiviral transduction with a construct in which a genetically-encoded voltage indicator is under the control of a ventricular-specific promoter element. When iPSC-CMs are transduced with this construct, the voltage sensor is expressed exclusively in ventricular-like cells, enabling subtype-specific optical membrane potential recordings using time-lapse fluorescence microscopy.

Here we present a method to optically image action potentials, specifically in ventricular-like induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. The method is based on the promoter-driven expression of a voltage-sensitive fluorescent protein.