בעלי חיים מהונדסים הם בסיסיים למחקר ביו-רפואי מודרני מכיוון שהם מאפשרים מחקרים על תפקוד גנים באורגניזמים חיים. שיטות שונות של שינויים גנטיים יישמו במחקרים בבעלי חיים. כאן, אנו מציגים טכניקה נגישה ויעילה נרחבת המשתמשת בווקטורים lentiviral ככלי לשילוב טרנסג'נדרים בגנום של עובר עכברוש.
לאחר ניהול גונדוטרופין כוריוני אנושי, בן חמישה שבועות Wistar נקבה חולדות אחד לאחד עם פורה מינית שלושה עד 10 חודשים זכרים Wistar. בשעה 8 עד 10 בבוקר.m בבוקר שלמחרת, בדקו את הנקבות לנוכחות תקע וגינאלי וקצרו את האוביץ' מהנקבות עם תקע הזדווגות לא יאוחר מ-10 .m.
לתוך צלחת איסוף המכילה מדיום M2 מחומם מראש. כאשר כל oviducts נאספו, להעביר את הרקמות לתוך צלחת 35 מילימטר המכיל בינוני M2 מחומם מראש בתוספת 0.5 מיליגרם למיליליטר של hyaluronidase מן האשכים bovine ולמקום את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש מדפים עדין כדי לפתוח את הקירות של oviduct ולחץ על אמפולה עד העוברים משוחררים.
כדי להקל על שחרור העוברים מתאים cumulus, להשתמש פיפטה העברת זכוכית מחובר צינור שאופה המופעל על ידי הפה בעדינות pipette העוברים למעלה ולמטה. כאשר כל העוברים שוחררו, לשטוף את התאים כמה פעמים במדיום M2 טרי כדי להסיר את hyaluronidase ופסולת הסלולר. מעבירים את העוברים ל-50 טיפות מיקרוליטר בודדות של מדיום M16 שקוויטר מראש מכוסה בשמן מינרלי בצלחת של 60 מילימטר.
לאחר מכן מניחים את המנה לתוך חממה לחה 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספרה 5%פחמן דו חמצני עד הזריקה שלהם. עבור microinjection וקטור lentiviral תחת zona pellucida של עוברי שלב תא אחד, להשתמש מושך פיפטה להכין microinjection בורוזיליקט נימי זכוכית עם נימים. לאחר כל פעם נימי משתנה או נימי זכוכית חדש משמש, להפעיל בדיקת רמפה כדי להגדיר את הפרמטרים האופטימליים.
לאחר מכן, השתמש בקצה microloader כדי לטעון כשני microliters של פתרון lentiviral מופשר טרי לכל פיפטה microinjection תחת מכסה המנוע זרימה למינארי biosafety. מוסיפים טיפה של 100 מיקרוליטר של מדיום M2 למרכז המכסה מצלחת פטרי 60 מ"מ. מכסים את המדיום בשמן מינרלי והר את פיפטה מחזיק ואת הנגיף טעון נימי microinjection על מיקרומניפולטור.
מניחים את צלחת microinjection תחת מיקרוסקופ הפוך ולהעביר 15 עד 20 עוברי שלב תא אחד לתוך טיפת M2 בצלחת microinjection. ללכוד עובר אחד עם פיפטה מחזיק ולהשתמש הגדלה 400 פעמים נימי זכוכית להזריק את הפתרון lentiviral תחת zona pellucida לתוך החלל perivitelline מחזיק את נימי מתחת pellucida לרגע לאחר הנגיף נמסר. כאשר כל העוברים הוזרקו, השתמש פיפטה בסדר להחזיר את התאים מוזרק לצלחת התרבות ולהחזיר את המנה אינקובטור תרבות התא עד ההשתלה שלהם.
כדי להכין את האמהות המאמצות להעברת העובר, חבר לנקבות ספראג-דוולי בוגרות מינית עם זכרים vasectomized ולבדוק את הנקבות למחרת בבוקר לתקע הנרתיק. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה אצל נקבות הרדמה עם תקע קיימא, להחיל משחה על העיניים של החיה לגלח את הפרווה מהגב של כל חיה. מניחים את החולדה הראשונה במצב נוטה על משטח נקי על כרית חימום תחת מיקרוסקופ כירורגי.
מכסים את החולדה עם וילון סטרילי עם חור קטן לחתוך מעל הגב התחתון ולעשות חתך בעור כשני סנטימטרים במקביל לעמוד החוליות המותני. השתמש מספריים חדים כדי להפוך חתך בקיר הבטן ולהשתמש מטליות לתפוס כרית שומן השחלות. מוציאים את השחלה ואת ה-oviduct מתוך חלל הבטן אל חתיכת גזה ספוגה נתרן כלורי 0.9%.
לטעון M2 בינוני, שלוש בועות אוויר, ואת העוברים לתוך נימי העברה. השתמש microscissors לעשות חתך קטן לתוך oviduct בין infundibulum ו ampulla ולהכניס את קצה פיפטה העברה לתוך החתך. לגרש בעדינות את העוברים ואת בועות האוויר לתוך oviduct, ולאחר מכן להשתמש מדפים קהה למקם את מערכת הרבייה בחזרה לתוך חלל הבטן.
תפרו את דופן הבטן עם תפרים סופגים חומצה פוליגליקולית וסגרו את חתך העור עם פצעים והניחו את החיה בכלוב נקי על צלחת חימום עם ניטור עד לפציעה מלאה. כדי vasectomize בני זוג פוטנציאליים, לאחר הכנת החולדה הגברית לניתוח כפי שהוכח, להשתמש 70%אתנול קרצוף כירורגי כדי לחטא את העור על האשכים. בעדינות ללחוץ על הבטן כדי לחשוף את האשכים בעצם האשכים ולכסות את החולדה עם וילון סטרילי עם חור קטן מעל האתר הכירורגי ולהשתמש מספריים האשכים לעשות חתך 0.5 ס"מ באמצע הסק.
בזהירות לדחוף את האשכים שמאלה ולאתר את vas deferens בין האשכים ואת קו האמצע כמו צינור לבן עם כלי דם אחד. השתמש במטליות של השען כדי למשוך בעדינות את האגרטלים ממק הדם ולהחזיק את הכלי במטליות, השתמש במספריים עדין כדי להסיר שבר של סנטימטר אחד מהצינור. חזור על ההליך עבור האשכים השני כפי שהוכח רק ולסגור את העור עם תפרים ספיגה חומצה פוליגליקולית.
ואז למקם את החולדה לתוך כלוב נקי על צלחת התחממות עם ניטור עד חקירה מלאה. בניסוי מייצג זה, שבו הוזרקו עוברים בודדים מספר פעמים, שמונה חולדות נולדו עוברים שהוזרקו פעמיים, שלושה מהם אושרו לשאת את הטרנסג'ין. אחד המייסדים לא העביר את הטרנסג'ין וצאצאים ושלוש נקבות אומנה שימשו לכל מערך ניסיוני.
הגישה שנבחרה אפשרה את הדור של קווי חולדה מהופנטים יציבים שהביעו את חלבון ההיתוך TDP-43-eGFP תחת שליטת הסינפסה העצבית במקדם אחד בכל מערכת העצבים המרכזית. טרנסג'נסיס מבוססת Lentivirus הביאה להכנסת עותק יחיד של הטרנסג'ין כפי שהוכח על ידי PCR כמותי. כאשר שיטה זו שימשה עבור וקטורים lentiviral אחרים, שיעור ההישרדות כ 90% נצפתה.
אחוז העוברים ששרדו את זריקות הפרונוקלאר היה נמוך משמעותית. בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי חולדות נקבה בהריון יכול לשמש אמהות אומנה עם יעילות דומה. יש לציין כי הנתונים המספריים שנותחו עבור סבבים בודדים של microinjection הצביעו על כך שהיעילות של ההשתלה תלויה ישירות במספר הזריקות לעובר אחד ותוך עקיפה בעומס הנגיפי.
השימוש בווקטורים lentiviral מבטיח את האינטגרציה הגנומית והעברת הטרנסג'ין ומאפשר שיעור הישרדות גבוה של העוברים micromanipulated גם כאשר זריקות תת עוריות מרובות מבוצעות. הליך זה עשוי להיות מיושם ביעילות על מינים אחרים והוא יכול להיחשב חלופה transgenesis קונבנציונאלי.
