אנו מודים לפרופ &#39;אמריטוס ז&#39;אן קלוד Perriard ואוולין Perriard (מכון שוויצרי פדרלי לטכנולוגיה, שוויץ) למבוא לטכניקות בידוד לעכברוש בילוד ושריר לב עכבר. ברצוננו להודות לפרופ &#39;ג&#39;ו חן ופרופ&#39; סילביה אוונס (UCSD, ארה&quot;ב) על תמיכתם. עבודה במעבדה של EE מומנה על ידי MRC קריירה הקמת גרנט. SL נתמך על ידי מסלול K99/R00 להעניק עצמאות מ-NIH / NHLBI (HL107744). TMM נתמכה על ידי מלגה הבתר מאיגוד הלב האמריקאי (11POST7310066).

ההליך הבא מתאר 16,17 פרוטוקול בן יומיים לבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. כל הפתרונות עקרים או עקרים מסונן. כל הכלים הם מעוקרים על ידי עיקור משטח עם 75% אתנול. פרט למיצוי הרקמה הראשוני, כל הצעדים שבוצעו במכסת מנוע בתרבית תא זרימה למינרית סטרילי. פרוטוקול זה מיועד לבידוד של לב עכבר בילוד מהמלטה אחת ושתיים (ים) - כ 5-14 גורים, אך הוא עשוי להיות מותאם לגדלי המלטה גדולים ושריר לב בילוד חולדה. שימוש במדיה בקנה מידה / אנזים כמתאים. לעבודה עם מכרסמים בילוד, עיינו בהנחיות המקומיות שלך באוניברסיטה וכללים שנקבעו על ידי המחוקק ו / או תוכניות טיפול בבעלי חיים, ולדבוק בפרוטוקול שאושר על בעלי החיים המוסדי שלך. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC), ולדבוק fedeתקנות RAL ומדינה. יום 1. 1. בידוד של רקמת לב מעכברי ילודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיליליטר של 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) בתוספת 20 מ&quot;מ BDM 6-8, ולפזר לשתי מנות חיידקי סטרילי מונחות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיליליטר של מדיום בידוד ב50 מיליליטר צינור פלקון חרוטי סטרילי. שמור את כל הפתרונות על קרח. לעקר מספריים (אחד מעוגל; ישרה אחד), ומלקחיים (מעוגלים, דומון מס &#39;7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים בילוד בן 1-3 ימים הם שטופים במהירות ב75% אתנול פתרון לעיקור פני השטח. גורים הם ערופים באמצעות מספריים סטרילי (ישר), והחזה נפתח לאורך עצם החזה כדי לאפשר גישה לבית החזה והלב (איור 1 א, משלימה הסרט S1). תגובה טכנית: ניתן להשתמש בעכברים יילודים יותר מ 3 ימים, אבל לגרום לתאי קיימא פחות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבבות המחולציםהגוף עם מספריים מעוגלים והועבר מייד לצלחת המכילה חיידקי 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) עם 20 מ&quot;מ BDM, על קרח. כל הצעדים הבאים מבוצעים במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמת ריאה, כלי גדול יותר (ואטרייה, אם רוצה). לבבות לשטוף בפתרון 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) עם 20 מ&quot;מ BDM (על קרח) כדי להסיר דם. העברה שטפה את לב מהמנה ראשונה למנה השנייה בקטריאלי המכילה 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) עם 20 מ&quot;מ BDM (על קרח) באמצעות מלקחיים או כף מחוררת (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה ניקתה / שטף את לב לירידה של מדיום בידוד (כ 250 μl; איור 1 ג) בצלחת שלישית בקטריאלי (על קרח) ולהשתמש במספריים מעוגלים לברר בלבם לחתיכות (כ 0.5-1 מ&quot;מ 3, או קטנים יותר קטנות; איור 1D, 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הלבבות טחונים לתוך חרוטיצינור המכיל 10 מיליליטר של מדיום הבידוד (על קרח), ודגירה עם תסיסה עדינה על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה. </li></ol> יום 2. 2. רקמות אנזימתי עיכול וציפוי של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ב15 מ&quot;ג של תערובת collagenase / dispase (Roche), ולפזר את תערובת האנזים ב10 מיליליטר 5 L15-המדיום השלימו עם 20 מ&quot;מ BDM (בינוני עיכול). סינון סטרילי בינוני העיכול במכסת מנוע תרבית תאים לתוך צינור סטרילי חדש 50 מיליליטר פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום 30 מיליליטר L-15 תוספת 20 מ&quot;מ BDM, ובינוני ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מעיל תרבית תאים עם פתרון קולגן (Sigma C-8919) למינימום של 1 שעה. הסר פתרון קולגן (ניתן לעשות שימוש חוזר) ומנות תרבית תאי קולגן מצופים יבשות במכסת מנוע תרבית תאי זרימה למינרית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור חרוטי המכיל לבבות המעוכלים מראש מ4 ° C. יש מצטברים שברי רקמה (איור 1G). בואו שברי הרקמה לשקועהחלק התחתון של הצינור ולהסיר את supernatant (לוודא שלא יאבדו את כל שברי רקמה;. בדרך כלל, כ 1 מיליליטר של מדיום הבידוד עשוי להישאר בצינור). הוסף 5 מיליליטר של מדיום עיכול ו5 מיליליטר של L-15 תוספת 20 מ&quot;מ BDM לברי רקמה והשעית חמצן באמצעות חמצן או אוויר דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צינור חרוטי החתום המכיל שברי רקמת לב במדיום עיכול ל37 ° C אמבט מים למשך כ -2 דקות כדי להתאים את הטמפרטורה של פתרון העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שברי רקמת לב על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה של 20-30 דקות (לדוגמא שייקר על 37 מעלות צלזיוס, מוגדר לא יותר מ60rpm). זמני עיכול עשויים להיות תלויים במידה רבה על תערובת אנזים ומספר הרבה זהירות:. תקופות דגירה ארוכות יותר או ריכוזי אנזים גבוהים יותר עשויות להפחית את כדאיות תא. </li></ol> תגובה טכנית: אנו ממליצים שימוש בתערובת collagenase / dispase מרוש (Cat.No.: 102,69638001) שיש לו מעט מאוד שונות הרבה להרבה. האנזים הקלאסי לבידוד של שריר לב עכבר הוא טריפסין ו / או סוג collagenase השני 3,16-20 זמין וורטינגטון (חתול לא CLS-2). עם זאת, ביצועים של collagenase השני עשויים להיות שונים באופן מהותי מהרבה להרבה. וורטינגטון מאפשר בדרך כלל לבדיקה של כמה הרבה collagenase כדי לייעל את זמני עיכול ואנזים שימוש. לחלופין, וורטינגטון מוכר ערכת בידוד cardiomyocyte בתערובת אנזים נבדקה מראש כלל שיכול להיות מותאם לבידוד של cardiomyocytes עכבר (מס &#39;חתול: NCIS) 17. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח תא מסננת סטרילי (40-100 רשת ניילון מיקרומטר) ב50 מיליליטר סטרילי הטרי צינור בז חרוטי. מסננת תא טרום רטובה עם 5 L-15 מיליליטר בתוספת 20 מ&quot;מ BDM. שברי רקמת העדינות triturate באמצעות פיפטה תרבית תאי 10 מיליליטר רטוב מראש במשך כ 10-20 פעמים. שברי הרקמה צריכים בעיקר לפזר במהלך שלב זה, משחררים את התאים לתוך suspension (איור 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שברי רקמה גדולים יותר משקעים וsupernatant העברה המכיל תאים מושעים לתוך צינור חרוטי טרי דרך תא מסננת (איור 1I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את שברי רקמות מעוכלים ב5 בינוני עיכול מיליליטר ו דגירה של 5-10 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיכול מתמשך של שברי רקמה שנותרו, בעדינות triturate רקמות ל10-20 פעמים ולהוסיף לתאי צינור המכיל חרוטי מלעכל הראשון דרך מסננת תא. יש לשטוף את תא מסננת עם 5 L-15 מיליליטר בתוספת 20 מ&quot;מ BDM כדי לאפשר מעבר של כל התאים מתעכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור חרוטי Centrifugate המכיל שריר לב על תנאים למשך 5 דקות ב300 סל&quot;ד (כ XG 50-100). הסר את supernatant (המכיל בעיקר fibroblasts ותאי האנדותל) ותא גלולה מחדש להשעות ב10 מיליליטר ציפוי בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים ל10 צלחת תא סנטימטר התרבות (איור 2 א) ו דגירה של 1שעה -3 בחממת תרבות תא. צעד לפני ציפוי זה מסיר fibroblasts ותאי אנדותל (איור 2), שידבק לצלחת ללא ציפוי תרבית תאים (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשטוף את שריר לב שאינו חסיד מ10 צלחת תרבות סנטימטר (תאים מחדש להשעות ידי pipetting בינוני ציפוי מעל הצלחת שוב ושוב), ותאי resuspended להעביר צינור סטרילי חרוטי צנטריפוגות פלקון (15 מיליליטר או 50 מיליליטר). אופציונאלי: חזור על השלב טרום ציפוי להסיר fibroblasts נוסף מתא השעיה. אם תרצה, תאי פיברובלסטים ואנדותל חסיד יכולים להיות מתורבתים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים (למשל על ידי השימוש בhemocytometer נויבאואר, trypan הדרה כחולה מכתימה 21). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים לתוך צלחות תרבית תאי קולגן מצופה בצפיפות של כ 1.5 x 10 5 תאים לכל 2 סנטימטר (איור 2 ד, וראה גם הערות בטבלה 1 בציפויוציפוי). הנח כלים בתרבית תאי חממה ולהשאיר באין מפריע במשך 12-18 שעה כדי לאפשר לדבקות והפצה של שריר לב. </li></ol> יום 3 - תרבות של שריר לב בילוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תחזוקה וprewarm ב37 אמבט מים C °. עיין בטבלת 1 לתוספת של מעכבי התפשטות או סוכני chronotropic, או הליך transfection liposomal של cardiomyocytes עכבר בילוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לאחר ציפוי, שריר לב צריך דבק בצלחת תרבית תאים בצורה אופטימלית ולהתחיל באופן ספונטני לחוזה (איור 2E, 2F; משלימה הסרט S2; עיין בטבלה 2 לבעיות נפוצות במהלך הליך בידוד / התרבות). החלפת ציפוי בינוני עם בינוני תחזוקה, ותרבות ל1-5 ימים נוספים. שנה בינונית במידת צורך. </li></ol>

אף אחד.

השימוש במודלים של בעלי חיים כדי ללמוד מחלות לב הפך סטנדרטיים במחקר לב וכלי דם. אפיון ביוכימי קרוב יותר של מודלים אלה (כלומר, לומדים את תגובות ישירות של תאי לב לגירויים ביוכימי או ביומכנית) בדרך כלל דורש הבידוד של רקמות לב או שריר לב. מחקרים חוקרים תגובות פיסיולוגי...

הדיווחים המוקדמים ביותר לניתוק והתרבות המוצלחים של תאי לב מכרסמים שתחילתה ב1960 של 1,2. גם אז, הררי ופארלי שמו לב ששריר לב בתרבית &quot;עשוי לספק מערכת ייחודית ללימוד הדרישות של ההתכווצות התקופתית [ואולי] לספק אמצעי קביעת התרומה של מסלולי מטבוליים שונים ל[ מכות] התהליך&quot;. למרות ששריר לב מבודד ומתורבת הררי ופארלי מחולדות צעירות, והפרוטוקול המקורי הותאם והותאם על ידי מדענים רבים במשך השנים, הליך הבידוד וculturing הכללי לא השתנה באופן משמעותי. עם זאת, אנזימים טובים יותר 3, פתרונות סטנדרטיים 4,5, והתוספת של הערוץ הפיך וBDM מעכבי ATPase שרירן כדי להגן על תאים במהלך הליך בידוד 6-9 השתפרו באופן משמעותי תא תשואה וכדאיות. מבוגרים לעומת cardiomyo בילודcytes יש לי cardiomyocytes המבודד ומתורבת מעכברים או חולדות בילוד מספר יתרונות על פני תרבויות של שריר לב מבוגר. בראש ובראשונה, הליך הבידוד ללבם עכבר או עכברוש בילוד הוא קל יותר ויקר פחות, בהשוואה לבידוד של שריר לב מעכבר בוגר או חולדה 10. cardiomyocytes ילודים הם הרבה פחות רגיש להשבה לטבע לבינוני מכיל סידן לאחר ניתוק, מאוד להגדיל תא תשואה. יתרון גדול נוסף הוא ששריר לב עכבר בילוד עובר טשטוש הבדלים מהיר יותר - מחזור redifferentiation שבדרך כלל תוצאות באופן ספונטני להכות תאים 20 שעות לאחר ציפוי, בעוד שבדרך כלל שריר לב מבוגר דורש לצעוד כדי לגרום להתכווצות. cardiomyocytes ילודים הם גם יותר בקלות transfectable עם שיטות transfection liposomal, ואילו שריר לב מבוגר דורש וקטורים ויראליים למסירה מוצלחת של ה-DNA המהונדס. בניגוד לcardiomyocyte בילודים, התרבות של cardiomyocytes מכרסמים המבוגר 11-13 מאפשרת לחקירות של השפלה myofibrillar והקמתה מחדש סופו של דבר את מנגנון ההתכווצות. שינויים מורפולוגיים האופייניים אלה בשריר לב בוגרים מתרחשים על פני תקופות של 1-2 שבועות. טשטוש ההבדלים - מחזור redifferentiation מלווה reexpression של התכנית הגנטית של העובר, ובכך מחקה שינויים פתולוגיים שנצפו בcardiomyopathies אדם 14. יתרון נוסף של שריר לב חולדה בוגר מעל התרבות של שריר לב בילוד הוא יכולת תרבות תאים אלה לפרקי זמן ארוכים. עכברוש לעומת cardiomyocytes עכבר יש הבידוד והתרבות של שריר לב בילוד חולדה כמה יתרונות על פני זו של שריר לב בילוד עכבר, כוללים תשואות גבוהות יותר של תאי קיימא ושיעורי transfection מוגברים. עם זאת, השימוש הרחב של מודלים עכבר מהונדסים גנטי למחלות לב (כגון: &lt;/ Em&gt; העכבר בנוקאאוט חלבון Lim השרירים כמודל לcardiomyopathy מורחב 15) הוביל לעיבוד של הליך הבידוד לשריר לב שנלקח מעכברים בילוד. למרות שהפרוטוקולים המשמשים לבודד את שריר לב חולדה ועכבר בילוד הם כמעט זהים, טיפול גדול יותר יש לקחת בבחירת תמהיל אנזים מתאים לאפשרות השנייה. אכן, שריר לב עכבר בילוד הוא בדרך כלל רגיש יותר לoverdigestion, וכתוצאה מכך תא תשואה וכדאיות מופחתים. יתר על כן, צפיפות ציפוי צריכה להיות מותאמת, כי שריר לב שנלקח מעכברי יילודים הם מעט קטן יותר בהשוואה לתאי שמקורם בלב חולדה בילוד. עם שימושים רבים לחקירה של פרמטרים מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי ויומכנית, כמו גם לתהליך של myofibrillogenesis, שריר לב בילוד בתרבית הפכו לאחד המערכות המגוונות ביותר ללימודפונקציות תא לב במבחנה. הצעד הראשון לassay מוצלח לעומת זאת, תלוי במתודולוגיה קלה ואמינה לבודד את שריר לב עכבר בילוד. הפרוטוקול שלנו שואב את המתודולוגיה שלה ממקורות רבים והיה מותאם לשחזור וחוסן. אנו דנים בגורמים המשפיעים על cardiomyocyte תשואה וכדאיות, ולספק מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

שריר לב בילוד תרבותי כבר מזמן משמש ללמוד myofibrillogenesis ופונקציות myofibrillar. שריר לב בתרבית מאפשר חקירה קלה ומניפולציה של מסלולים ביוכימיים, וההשפעה שלהם על המאפיינים ביומכניים של ספונטני להכות שריר לב. פרוטוקול 2 הימים הבאים מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. אנו מראים כיצד לנתח בקלות את לב מילודים, לנתק את רקמת הלב ולהעשיר את שריר לב מתאי אוכלוסיית לב. אנחנו דנים בשימוש בתערובות אנזים שונות לתא דיסוציאציה, וההשפעות שלהם על תא את יכולת הקיום. שריר הלב המבודד יכול לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי או ביומכנית. אנו מותאמים הפרוטוקול לחוסן ושחזור, על ידי שימוש בפתרונות רק זמינים מסחרית ואנזים מתערבב שshהשתנות קטנות ow הרבה להרבה. אנחנו גם להתמודד עם בעיות נפוצות הקשורות לבידוד והתרבות של שריר לב, ומציעים מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.

באמצעות פרוטוקול זה, אנו מבודדים לבבות מ8 עכברי יום אחד ישן בילוד (איורים 1 א, 1 ב &#39;, משלים הסרט S1). לאחר הכביסה וקוצץ את הלבבות עם מספריים (איורים 1C-1F), שברי רקמה היו מעוכלים מראש במדיום בידוד במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. בעקבות predigestion <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

isolation-and-culture-of-neonatal-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

62.1K Views.  King’s College London.  תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ...

Video: Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Speed

Subtitles

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד