המחברים מודים לCore פתולוגיה המולקולרית וההדמיה של מרכז NIDDK UPenn מולקולרית מחקרים בעיכול ומחלות כבד (DK50306 P30) לקבלת סיוע בהדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01 DK-092,111) ומפרד וסוזן Biesecker ילדים מרכז כבד (לRGW) ועל ידי מענק מרשת ילדות מחלת הכבד מחקר והחינוך (לSK).

התהליך כולו מתבצע בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוין אחרת. כל העבודה של בעלי החיים צריכה להתבצע בתנאים אנושיים תחת פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המקומית בבעלי חיים מוסדיים טיפול ושימוש (IACUC). 1. הכנת הציוד ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את השולחן כירורגית העכבר בסמיכות למכסת המנוע בתרבית הרקמה והחממה (איור 1 א). הערה: ציוד הנדרש כולל מיקרוסקופ לנתח, מקור אור, איריס מספריים ארוכה וישרה 12.5 סנטימטר, מלקחיים 6 אינץ שאינו משוננים מעוגלים עם טיפים בסדר, ו4 אינץ מלקחיים משוננים, עם קצוות מעוגלים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מכשירים מעוקרים בכוס זכוכית של אלכוהול 70% על שולחן הניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שלוש 60 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילית עם תקשורת בידוד סטרילי (טבלת 1); הנח שתי על שולחן ניתוחים ואחד בשכונה, כולם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קולגן זנב חולדה,תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (PBS), מים סטריליים, סטרילי N NaOH 1 ותאים אפיתל מרה תקשורת (BEC) (טבלת 1) במכסת המנוע בתרבית הרקמה. הערה: קולגן צריך להיות על קרח. </li></ol> 2. בידוד המרה Duct ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים ילודים בין 0-3 ימים של חיים, על ידי חשיפה לפחמן דו חמצני עד אבדן הכרה ואחריו נקע בצוואר הרחם, על פי הנחיות IACUC (תרשים 1C). הערה: ניתן להשתמש בעכברים מבוגרים בהתאם לצרכימים של ניסוי ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח לבעלי חיים במצב שכיבה ולעשות חתך אופקי קטן שחצה את קו האמצע באזור של האגן. הרחב את החתך הזה רוחבי ואת שני הצדדים של הבטן, ויצר דש בצורת U. הפעל דש כדי לחשוף את איברי הבטן. ברגע שהבטן פתוחה, לנוע בזהירות את המעיים מתוך חלל הבטן לכיוון צד ימין של בעלי החיים להדמיה טובה יותר של צינור הכבד ומרה משותפת. הערה: ייתכן שיהיה צורך להאריך את החתכים הרוחב לתוך בית החזה כדי לקבל זיהוי טוב יותר של הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לזהות את צינור מרה המשותפת, כבד ומעיים. זהה את צינור המרה המשותף ראשון (1D איור), תוך שימוש בזהירות, כמבנים הם מאוד עדינים. עם מלקחיים המשוננים המשוננים ולא, בקפדנות נקייה ולאסוף את רקמות חיבור כולל שומן המקיף את המרה. השתמש באחד מלקחיים להחזיק את הצינור ואחר לניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה דומה כדי לנקות את כיס המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הצינוריות וכיס המרה ניקו לתוך הצלחת הראשונה של מדיה בידוד על קרח. לעסות בעדינות את המבנים עם המלקחיים משוננים שאינו בזמן בתקשורת כדי להסיר עוד יותר רקמות חיבור ולהסיר מרה מן כיס המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצינורות וכיס מרה למנה השנייה של תקשורת בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבידוד של צינורות וכיס מרה מ5 בעלי חיים, להעביר אתחתיכות לצלחת פטרי השלישית, במכסת המנוע. הערה: אם תאים הם להיות מבודדים יותר מ 5 בעלי חיים, לעשות בקבוצות, תוך שימוש בפתרונות מפתיעים לכל קבוצה של 5 בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי קולגן עבה במכסת המנוע בתרבית רקמה: הערה: כל מנה בגודל ניתן להשתמש. צלחת תרבות 60 מ&quot;מ עם נפח סופי של 3 מיליליטר קולגן לכל קבוצה של 5 ילודים עובדת היטב. זה צריך להיות מוכן טרי בעת הטבעת צינורות מבודדים טרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קולגן עכברוש זנב, תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (10x PBS), סטרילי DH 2 O, וסטרילי N NaOH 1 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמויות של DH 2 0, 10x PBS, NaOH, וקולגן הנדרש לג&#39;לי עם ריכוז סופי של 2 קולגן מ&quot;ג / מיליליטר ב 1x PBS, באמצעות נפח של 1 N NaOH שווה 0.023 פעמים הנפח של קולגן, הוסיף. הערה: אם מקור חלופי של קולגן משמש, בצע את הוראות היצרן לנטרול והיווצרות ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים יחד DH 2 0, 10x PBS, ו1 N NaOH, ולאחר מכן להוסיף קולגן וגם פיפטה כדי להבטיח גם ערבוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שפתרון קולגן התעבה לג&#39;ל כמו עקביות בטמפרטורת חדר, כדי לשבץ באופן מיידי את הצינורות בקולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאפשר קולגן כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ג&#39;ל יש הקרושה (שינויי צבע מברורים ללבן), כיסוי עם 3.5 מיליליטר של תקשורת BEC (טבלת 1) ו לדגור על 37 ° C CO, 2 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת BEC 3 פעמים בשבוע ולהחליף עם תקשורת טרי 3.5 מיליליטר. </li></ol> 3. בידוד Cholangiocytes הראשי מהעבה קולגן ג&#39;ל הערה: תוך 3 שבועות, גיליונות של cholangiocytes (תאים עם גרעינים גדולים הארכה ישירות מצינורות מוטבעים) יהיו גלויים בקולגן העבה. אם יש מספר גדול של fibroblasts בצלחת, זה צריך להיות מושלך. אם יש כמה אזורים של המנהגידול פיברובלסטים, אלה ניתן לגזור עם אזמל ולהסיר לפני פיצול cholangiocytes. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי קולגן דק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל קולגן לריכוז של 1 מ&quot;ג / מיליליטר עם PBS סטרילית. שים לב: שימוש 1 מיליליטר ל100 צלחת מ&quot;מ; להתאים בהתאם לכלים בגודל אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את פתרון קולגן באופן שווה עם מפזר תא (מנות גדולות) או קצה פיפטה (מנות קטנות), ולאחר מכן משאיר בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף עם 1x PBS. מייד לשאוב PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל עם שכבה שנייה דקה של קולגן, מתפשטת על ידי החלפה של הצלחת או הצבת צלחת על שייקר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קולגן יש הקרושה, כיסוי צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים מהג&#39;ל קולגן איכס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מרית תרבית תאים או מגרד תא, לגרד ג&#39;ל קולגן בעדינות מהצלחת, כך שהוא צף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון collagenase על ידי דילול collagenase סוג XI (ראה רשימת חומרים) ל10 מ&quot;ג / מיליליטר עם DMEM/F12. מערבבים היטב וסינון סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תמיסת collagenase (לעיל) ל60 מנה מ&quot;מ של תאים בקולגן העבה. אל תסיר את תקשורת BEC (שאמורה להיות 3 מיליליטר). דגירה צלחת ל30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תמיסה המכילה תאים, ואת המקום ב15 מיליליטר צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב2,200 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה בנפח דומה של DMEM/F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין פתרון שוב ב2,200 XG במשך 5 דקות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 3 מיליליטר של טריפסין 0.5%, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. לאחר דגירה, פיפטה הפתרון למעלה ולמטה כדי לשבור את הגיליונות של cholangiocytes. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת BECפתרון ספין nd ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, וגלול resuspend ב DMEM/F12, אז ספין פתרון ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מחדש להשעות גלולה בתקשורת BEC (טבלת 1). פלייט תאים על ג&#39;ל קולגן הדק שנעשה בעבר. </li></ol></li></ol> 4. מעבר ואחסון של תאים הערה: תאים על ג&#39;ל קולגן הדק ניתן לפצל לפי צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות עם PBS סטרילי לפני דוגרים בטריפסין 0.25% ב37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל עם נפח שווה של מדיה BEC, וגלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות. יש לשטוף גלולה עם DMEM/F12, ולאחר מכן גלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend בתקשורת BEC לחלוקה לצלחות תרבית תאי קולגן מצופים. הערה: לחלופין, ניתן resuspended תאים באמצעי אחסון ומאוחסנים במקפיא -80 ° C או חנקן נוזלי (טבלה 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+bile+ducts:+Essentials+for+the+clinical+hepatologist.">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li><li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes,+periportal+hepatocytes,+and+adult+liver+progenitor+cells.">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li><li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver.">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li><li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia.">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li><li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium:+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment.">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

שתואר כאן הוא טכניקה לבודד cholangiocytes הטהור מדרכי המרה extrahepatic של עכברים של עכברים בכל הגילים, כולל תינוקות. הטכניקה מציעה את היתרון שניתן ללמוד cholangiocytes extrahepatic בנפרד מcholangiocytes intrahepatic, ועשויה להקל על מחקרים כדי לזהות את ההבדלים עיקריים בין האוכלוסיות של תאים אלה. אנו פורס?...

המקור וההתפתחות של cholangiocytes הפנים וextrahepatic הם שונים במידה ניכרת. הכבד מתפתח מdiverticulum של האנדודרם המעי הקדמי הגחון 5. אזור הזנב של diverticulum מהווה את עץ המרה extrahepatic, ואילו באזור הגולגולת יוצר עץ המרה intrahepatic 5. cholangiocytes צינור intrahepatic נגזרים מתאים סביב צלחת ductal באזורי פורטל פרי 6. תאים אלה היכולת להתמיין גם hepatocytes או cholangiocytes 6. יש לכך השלכות קליניות משמעותיות בהתחשב בעובדה שcholangiopathies עשוי במיוחד למטרת קטגוריה אחת של cholangiocytes. לדוגמא, atresia מרה בתחילה משפיע על צינוריות extrahepatic של הילוד, בעוד Alagille תסמונת משפיעה על צינוריות intrahepatic. יש תיאורים רבים של הבידוד של cholangiocytes intrahepatic ויחידות צינור מרה מעכברים וחולדות. בתוךvestigators הצליח לבודד תאים בודדים על ידי בידוד צינור ותוצאה שלאחר מכן, או על ידי עיכול כבד ונוגדנים לנתץ של cholangiocytes להביע סמנים פני תא ספציפיים 1-4. יחידות צינור מרה פונקציונליות ומקוטבות היו מבודדות על ידי עיכול כבד וסינון גודל 7. יחידות צינור מרה הן מסוגלים להגיב לגירויי הפרשה ולהפגין הפרשת נוזלי 7, בעוד cholangiocytes המבודד הוכחו לפתח מבני ductular במבחנה 1,2. מגבלות של שיטות אלה כוללים את הצורך במומחיות מיוחדת טכנית וציוד מיוחד לזלוף כבד עם אנזימי עיכול. בנוסף, קיים סיכון של זיהום עם תאי mesenchymal 3. שיטה לבודד cholangiocytes צינור המרה extrahepatic, במיוחד מצינורות מרה extrahepatic בילוד, לא תוארה בעבר. מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לבודד בילודזה גם תאי צינור המרה extrahepatic מבוגרים ברמות גבוהות של טוהר. טכניקה זו תאפשר המחקר של הבדלים בין cholangiocytes ומחקר במנגנונים של מחלות כמו atresia מרה שכוללות צינורות extrahepatic הפנים וextrahepatic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="942">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:323px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>500ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">FBS</td>
			<td style="width:323px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11150</td>
			<td>25 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM with non-essential amino acids</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140-019</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">51300-044</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Chemically-defined lipid concentrate</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11905-031</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">30-002-CI</td>
			<td>5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td>0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9508-100ml</td>
			<td>0.13ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM vitamin solution</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11120-052</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:323px;">Biowhittaker</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td style="width:323px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">500-102</td>
			<td>1.1ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">3 3&#39;,5-triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Epidermal growth factor</td>
			<td style="width:323px;">millipore</td>
			<td style="width:119px;">01-101</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forskolin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td>5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fungizone</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td>1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:323px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354236</td>
			<td>variable depending on concentration of collagen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:323px;">USB Corporation</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75889</td>
			<td>use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">dH2O</td>
			<td style="width:323px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">NaOH 10N</td>
			<td style="width:323px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ss255-1</td>
			<td>Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">collagenase type XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7657</td>
			<td>dilute in DMEM and sterile filter before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (10x) 0.5%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Light source (fiberoptic illuminator)</td>
			<td style="width:323px;">Schott-Fostec</td>
			<td style="width:119px;">Ace EKE LR 92240</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">12.5 cm straight iris scissors</td>
			<td style="width:323px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">6&#34; non-serrated curved forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4&#34; serrated stainless forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes

דרכי מרת התוך וextrahepatic של הכבד הן התפתחותית מובהקת, ועשויה להיות מושפע באופן דיפרנציאלי על ידי מחלות מסוימות. עם זאת, הבדלים בין cholangiocytes הפנים וextrahepatic, ובין תאי יילודים ומבוגרים, אינם מובנה היטב. שיטות לבידוד של cholangiocytes מצינורות המרה intrahepatic מבוססים היטב 1-4. בידוד של תאי ductal extrahepatic, במיוחד מהילוד, עדיין לא תאר, אם כי זה יהיה יתרון גדול בהבנת ההבדלים בין אוכלוסיות שונות וcholangiocyte בחקר מחלות כמו atresia מרה המופיעות למקד את צינוריות extrahepatic. שתואר כאן הוא טכניקה מותאמת לבודד תאי צינור המרה extrahepatic שני יילודים ועכבר מבוגר. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תא טהורה עם זיהום מינימאלי מתאי mesenchymal כמו fibroblasts. metho זהד מבוסס על הסרת צינוריות extrahepatic וכיס המרה, ואחריו לנתיחה קפדנית וגירוד כדי להסיר שכבות שומן ופיברובלסטים. מבנים מוטבעים בשכבות עבות של קולגן ותרבית למשך כ 3 שבועות כדי לאפשר תולדה של cholangiocytes בmonolayers, אשר לאחר מכן ניתן trypsinized ומחדש מצופים לשימוש ניסיוני.

השימוש בתוצאות פרוטוקול זה בבידודה של אוכלוסייה של cholangiocytes ילוד עכבר extrahepatic עם טוהר מעולה, כפי שהודגם על ידי מכתים immunofluorescence K19 (2A דמויות ו2B); אנו משיגים תוצאות דומות לבודד תאים מעכברים בוגרים. יש לנו ציינו כי זה לוקח 3 שבועות לתאים מצינורות מרה מבודדים טרי כד?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes at JoVE.com

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג&#39;ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia.  טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג'ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה. 

Video: Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

בידוד מחקר Biophysical של cuticles פירות

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.