המחברים מודים לCore פתולוגיה המולקולרית וההדמיה של מרכז NIDDK UPenn מולקולרית מחקרים בעיכול ומחלות כבד (DK50306 P30) לקבלת סיוע בהדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01 DK-092,111) ומפרד וסוזן Biesecker ילדים מרכז כבד (לRGW) ועל ידי מענק מרשת ילדות מחלת הכבד מחקר והחינוך (לSK).

התהליך כולו מתבצע בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוין אחרת. כל העבודה של בעלי החיים צריכה להתבצע בתנאים אנושיים תחת פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המקומית בבעלי חיים מוסדיים טיפול ושימוש (IACUC). 1. הכנת הציוד ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את השולחן כירורגית העכבר בסמיכות למכסת המנוע בתרבית הרקמה והחממה (איור 1 א). הערה: ציוד הנדרש כולל מיקרוסקופ לנתח, מקור אור, איריס מספריים ארוכה וישרה 12.5 סנטימטר, מלקחיים 6 אינץ שאינו משוננים מעוגלים עם טיפים בסדר, ו4 אינץ מלקחיים משוננים, עם קצוות מעוגלים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מכשירים מעוקרים בכוס זכוכית של אלכוהול 70% על שולחן הניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שלוש 60 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילית עם תקשורת בידוד סטרילי (טבלת 1); הנח שתי על שולחן ניתוחים ואחד בשכונה, כולם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קולגן זנב חולדה,תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (PBS), מים סטריליים, סטרילי N NaOH 1 ותאים אפיתל מרה תקשורת (BEC) (טבלת 1) במכסת המנוע בתרבית הרקמה. הערה: קולגן צריך להיות על קרח. </li></ol> 2. בידוד המרה Duct ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים ילודים בין 0-3 ימים של חיים, על ידי חשיפה לפחמן דו חמצני עד אבדן הכרה ואחריו נקע בצוואר הרחם, על פי הנחיות IACUC (תרשים 1C). הערה: ניתן להשתמש בעכברים מבוגרים בהתאם לצרכימים של ניסוי ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח לבעלי חיים במצב שכיבה ולעשות חתך אופקי קטן שחצה את קו האמצע באזור של האגן. הרחב את החתך הזה רוחבי ואת שני הצדדים של הבטן, ויצר דש בצורת U. הפעל דש כדי לחשוף את איברי הבטן. ברגע שהבטן פתוחה, לנוע בזהירות את המעיים מתוך חלל הבטן לכיוון צד ימין של בעלי החיים להדמיה טובה יותר של צינור הכבד ומרה משותפת. הערה: ייתכן שיהיה צורך להאריך את החתכים הרוחב לתוך בית החזה כדי לקבל זיהוי טוב יותר של הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לזהות את צינור מרה המשותפת, כבד ומעיים. זהה את צינור המרה המשותף ראשון (1D איור), תוך שימוש בזהירות, כמבנים הם מאוד עדינים. עם מלקחיים המשוננים המשוננים ולא, בקפדנות נקייה ולאסוף את רקמות חיבור כולל שומן המקיף את המרה. השתמש באחד מלקחיים להחזיק את הצינור ואחר לניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה דומה כדי לנקות את כיס המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הצינוריות וכיס המרה ניקו לתוך הצלחת הראשונה של מדיה בידוד על קרח. לעסות בעדינות את המבנים עם המלקחיים משוננים שאינו בזמן בתקשורת כדי להסיר עוד יותר רקמות חיבור ולהסיר מרה מן כיס המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצינורות וכיס מרה למנה השנייה של תקשורת בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבידוד של צינורות וכיס מרה מ5 בעלי חיים, להעביר אתחתיכות לצלחת פטרי השלישית, במכסת המנוע. הערה: אם תאים הם להיות מבודדים יותר מ 5 בעלי חיים, לעשות בקבוצות, תוך שימוש בפתרונות מפתיעים לכל קבוצה של 5 בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי קולגן עבה במכסת המנוע בתרבית רקמה: הערה: כל מנה בגודל ניתן להשתמש. צלחת תרבות 60 מ&quot;מ עם נפח סופי של 3 מיליליטר קולגן לכל קבוצה של 5 ילודים עובדת היטב. זה צריך להיות מוכן טרי בעת הטבעת צינורות מבודדים טרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קולגן עכברוש זנב, תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (10x PBS), סטרילי DH 2 O, וסטרילי N NaOH 1 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמויות של DH 2 0, 10x PBS, NaOH, וקולגן הנדרש לג&#39;לי עם ריכוז סופי של 2 קולגן מ&quot;ג / מיליליטר ב 1x PBS, באמצעות נפח של 1 N NaOH שווה 0.023 פעמים הנפח של קולגן, הוסיף. הערה: אם מקור חלופי של קולגן משמש, בצע את הוראות היצרן לנטרול והיווצרות ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים יחד DH 2 0, 10x PBS, ו1 N NaOH, ולאחר מכן להוסיף קולגן וגם פיפטה כדי להבטיח גם ערבוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שפתרון קולגן התעבה לג&#39;ל כמו עקביות בטמפרטורת חדר, כדי לשבץ באופן מיידי את הצינורות בקולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאפשר קולגן כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ג&#39;ל יש הקרושה (שינויי צבע מברורים ללבן), כיסוי עם 3.5 מיליליטר של תקשורת BEC (טבלת 1) ו לדגור על 37 ° C CO, 2 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת BEC 3 פעמים בשבוע ולהחליף עם תקשורת טרי 3.5 מיליליטר. </li></ol> 3. בידוד Cholangiocytes הראשי מהעבה קולגן ג&#39;ל הערה: תוך 3 שבועות, גיליונות של cholangiocytes (תאים עם גרעינים גדולים הארכה ישירות מצינורות מוטבעים) יהיו גלויים בקולגן העבה. אם יש מספר גדול של fibroblasts בצלחת, זה צריך להיות מושלך. אם יש כמה אזורים של המנהגידול פיברובלסטים, אלה ניתן לגזור עם אזמל ולהסיר לפני פיצול cholangiocytes. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי קולגן דק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל קולגן לריכוז של 1 מ&quot;ג / מיליליטר עם PBS סטרילית. שים לב: שימוש 1 מיליליטר ל100 צלחת מ&quot;מ; להתאים בהתאם לכלים בגודל אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את פתרון קולגן באופן שווה עם מפזר תא (מנות גדולות) או קצה פיפטה (מנות קטנות), ולאחר מכן משאיר בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף עם 1x PBS. מייד לשאוב PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל עם שכבה שנייה דקה של קולגן, מתפשטת על ידי החלפה של הצלחת או הצבת צלחת על שייקר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קולגן יש הקרושה, כיסוי צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים מהג&#39;ל קולגן איכס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מרית תרבית תאים או מגרד תא, לגרד ג&#39;ל קולגן בעדינות מהצלחת, כך שהוא צף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון collagenase על ידי דילול collagenase סוג XI (ראה רשימת חומרים) ל10 מ&quot;ג / מיליליטר עם DMEM/F12. מערבבים היטב וסינון סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תמיסת collagenase (לעיל) ל60 מנה מ&quot;מ של תאים בקולגן העבה. אל תסיר את תקשורת BEC (שאמורה להיות 3 מיליליטר). דגירה צלחת ל30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תמיסה המכילה תאים, ואת המקום ב15 מיליליטר צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב2,200 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה בנפח דומה של DMEM/F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין פתרון שוב ב2,200 XG במשך 5 דקות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 3 מיליליטר של טריפסין 0.5%, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. לאחר דגירה, פיפטה הפתרון למעלה ולמטה כדי לשבור את הגיליונות של cholangiocytes. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת BECפתרון ספין nd ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, וגלול resuspend ב DMEM/F12, אז ספין פתרון ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מחדש להשעות גלולה בתקשורת BEC (טבלת 1). פלייט תאים על ג&#39;ל קולגן הדק שנעשה בעבר. </li></ol></li></ol> 4. מעבר ואחסון של תאים הערה: תאים על ג&#39;ל קולגן הדק ניתן לפצל לפי צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות עם PBS סטרילי לפני דוגרים בטריפסין 0.25% ב37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל עם נפח שווה של מדיה BEC, וגלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות. יש לשטוף גלולה עם DMEM/F12, ולאחר מכן גלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend בתקשורת BEC לחלוקה לצלחות תרבית תאי קולגן מצופים. הערה: לחלופין, ניתן resuspended תאים באמצעי אחסון ומאוחסנים במקפיא -80 ° C או חנקן נוזלי (טבלה 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+bile+ducts:+Essentials+for+the+clinical+hepatologist.">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li><li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes,+periportal+hepatocytes,+and+adult+liver+progenitor+cells.">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li><li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver.">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li><li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia.">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li><li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium:+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment.">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

שתואר כאן הוא טכניקה לבודד cholangiocytes הטהור מדרכי המרה extrahepatic של עכברים של עכברים בכל הגילים, כולל תינוקות. הטכניקה מציעה את היתרון שניתן ללמוד cholangiocytes extrahepatic בנפרד מcholangiocytes intrahepatic, ועשויה להקל על מחקרים כדי לזהות את ההבדלים עיקריים בין האוכלוסיות של תאים אלה. אנו פורסמו לאחרונה מחקר אשר הוכיח ירידת cilia בcholangiocytes extrahepatic מבודדת בשיטה זו ונגועה בrotavirus רזוס 8. חסרונות כוללים שהטכניקה היא עבודה אינטנסיבית, והנתיחה מדוקדקת נדרשת על מנת למנוע זיהום פיברובלסטים; בנוסף, תוצאה ולפחות 3 שבועות בתרבות נדרשים להשיג תאים מספיק עבור רוב הניסויים. לכן, תאים אלה עשויים לשקף שינויים הקשורים לשתי תרבות ממדית. זה טרם נקבע אם אוכלוסיות התאים שהושגו כוללות מספרים משמעותיים של תאי גזע או תאיםים מבלוטות peribiliary 9,10. אנחנו ניסינו להשתמש בשיטה זו כדי לבודד cholangiocytes extrahepatic מחולדות; עם זאת, תאים לא הצליחו לגדול בתרבות. בין אם גורם צמיחה מרכזי חסר בתקשורת והתרבות, או אם תנאים אחרים שיהיה הצורך לשנות הוא כעת תחת חקירה. סופו של דבר, בשיטה זו כדי לבודד cholangiocytes extrahepatic עשויה לתרום להבנת הבדלים בצורות הפנים וextrahepatic של סיסטיק מרה, כמו גם הבדלים בין תאי יילודים ומבוגרים.

המקור וההתפתחות של cholangiocytes הפנים וextrahepatic הם שונים במידה ניכרת. הכבד מתפתח מdiverticulum של האנדודרם המעי הקדמי הגחון 5. אזור הזנב של diverticulum מהווה את עץ המרה extrahepatic, ואילו באזור הגולגולת יוצר עץ המרה intrahepatic 5. cholangiocytes צינור intrahepatic נגזרים מתאים סביב צלחת ductal באזורי פורטל פרי 6. תאים אלה היכולת להתמיין גם hepatocytes או cholangiocytes 6. יש לכך השלכות קליניות משמעותיות בהתחשב בעובדה שcholangiopathies עשוי במיוחד למטרת קטגוריה אחת של cholangiocytes. לדוגמא, atresia מרה בתחילה משפיע על צינוריות extrahepatic של הילוד, בעוד Alagille תסמונת משפיעה על צינוריות intrahepatic. יש תיאורים רבים של הבידוד של cholangiocytes intrahepatic ויחידות צינור מרה מעכברים וחולדות. בתוךvestigators הצליח לבודד תאים בודדים על ידי בידוד צינור ותוצאה שלאחר מכן, או על ידי עיכול כבד ונוגדנים לנתץ של cholangiocytes להביע סמנים פני תא ספציפיים 1-4. יחידות צינור מרה פונקציונליות ומקוטבות היו מבודדות על ידי עיכול כבד וסינון גודל 7. יחידות צינור מרה הן מסוגלים להגיב לגירויי הפרשה ולהפגין הפרשת נוזלי 7, בעוד cholangiocytes המבודד הוכחו לפתח מבני ductular במבחנה 1,2. מגבלות של שיטות אלה כוללים את הצורך במומחיות מיוחדת טכנית וציוד מיוחד לזלוף כבד עם אנזימי עיכול. בנוסף, קיים סיכון של זיהום עם תאי mesenchymal 3. שיטה לבודד cholangiocytes צינור המרה extrahepatic, במיוחד מצינורות מרה extrahepatic בילוד, לא תוארה בעבר. מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לבודד בילודזה גם תאי צינור המרה extrahepatic מבוגרים ברמות גבוהות של טוהר. טכניקה זו תאפשר המחקר של הבדלים בין cholangiocytes ומחקר במנגנונים של מחלות כמו atresia מרה שכוללות צינורות extrahepatic הפנים וextrahepatic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="942">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:323px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>500ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">FBS</td>
			<td style="width:323px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11150</td>
			<td>25 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM with non-essential amino acids</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140-019</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">51300-044</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Chemically-defined lipid concentrate</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11905-031</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">30-002-CI</td>
			<td>5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td>0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9508-100ml</td>
			<td>0.13ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM vitamin solution</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11120-052</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:323px;">Biowhittaker</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td style="width:323px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">500-102</td>
			<td>1.1ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">3 3&#39;,5-triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Epidermal growth factor</td>
			<td style="width:323px;">millipore</td>
			<td style="width:119px;">01-101</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forskolin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td>5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fungizone</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td>1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:323px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354236</td>
			<td>variable depending on concentration of collagen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:323px;">USB Corporation</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75889</td>
			<td>use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">dH2O</td>
			<td style="width:323px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">NaOH 10N</td>
			<td style="width:323px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ss255-1</td>
			<td>Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">collagenase type XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7657</td>
			<td>dilute in DMEM and sterile filter before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (10x) 0.5%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Light source (fiberoptic illuminator)</td>
			<td style="width:323px;">Schott-Fostec</td>
			<td style="width:119px;">Ace EKE LR 92240</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">12.5 cm straight iris scissors</td>
			<td style="width:323px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">6&#34; non-serrated curved forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4&#34; serrated stainless forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes

דרכי מרת התוך וextrahepatic של הכבד הן התפתחותית מובהקת, ועשויה להיות מושפע באופן דיפרנציאלי על ידי מחלות מסוימות. עם זאת, הבדלים בין cholangiocytes הפנים וextrahepatic, ובין תאי יילודים ומבוגרים, אינם מובנה היטב. שיטות לבידוד של cholangiocytes מצינורות המרה intrahepatic מבוססים היטב 1-4. בידוד של תאי ductal extrahepatic, במיוחד מהילוד, עדיין לא תאר, אם כי זה יהיה יתרון גדול בהבנת ההבדלים בין אוכלוסיות שונות וcholangiocyte בחקר מחלות כמו atresia מרה המופיעות למקד את צינוריות extrahepatic. שתואר כאן הוא טכניקה מותאמת לבודד תאי צינור המרה extrahepatic שני יילודים ועכבר מבוגר. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תא טהורה עם זיהום מינימאלי מתאי mesenchymal כמו fibroblasts. metho זהד מבוסס על הסרת צינוריות extrahepatic וכיס המרה, ואחריו לנתיחה קפדנית וגירוד כדי להסיר שכבות שומן ופיברובלסטים. מבנים מוטבעים בשכבות עבות של קולגן ותרבית למשך כ 3 שבועות כדי לאפשר תולדה של cholangiocytes בmonolayers, אשר לאחר מכן ניתן trypsinized ומחדש מצופים לשימוש ניסיוני.

השימוש בתוצאות פרוטוקול זה בבידודה של אוכלוסייה של cholangiocytes ילוד עכבר extrahepatic עם טוהר מעולה, כפי שהודגם על ידי מכתים immunofluorescence K19 (2A דמויות ו2B); אנו משיגים תוצאות דומות לבודד תאים מעכברים בוגרים. יש לנו ציינו כי זה לוקח 3 שבועות לתאים מצינורות מרה מבודדים טרי כדי ליצור monolayers על ג&#39;לי קולגן עבה. Cholangiocytes לגדול בצורה ליניארית לאורך קולגן העבה, ויוצר יריעות של תאים מהצינורות המבודדים. יש לפצל תאים מחדש מצופים על ג&#39;ל קולגן הדק לפני monolayers להיות מגודל, שכן חורים מופיעים בגיליונות של תאים אם תרבויות לא לפצל לפני 3 שבועות. לצמיחת תאים אופטימלית וכדי למזער את הזיהום פיברובלסטים, חשוב להסיר את רקמות חיבור המקיפות את צינורות extrahepatic העדינים בזהירות ובקפדנות במהלך שלבי נתיחה וניקוי (2.3, 2.4). אם יש צמיחה של סיביתקיעות, הסרת האזור הנגוע של קולגן העבה עם אזמל או שאיבה עדינה יכולות להפחית את ההעברה של fibroblasts לפני תאי פיצול. תאים אלה מתחלקים במהירות במהלך שלושת הקטעים הראשונים, אבל בנקודות מעבר גבוהות יותר, קצב הצמיחה מואט, והתאים הופכים לגדולים יותר וvacuolated. יש לנו קפוא בהצלחה דגימות של cholangiocytes, ומחדש בציפוים בתקופות מאוחרות יותר עם כדאיות מצוינת; cholangiocytes מופשר, לעומת זאת, לא לשכפל מהר ככל מבודד טרי ותאים מפוצלים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51621/51621fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51621/51621fig1.jpg" /> 1. ציוד כירורגי איור יש להגדיר בסמיכות למנגנון בתרבית רקמה. () מקור אור ממוקם מאחורי מיקרוסקופ לנתח. (ב) ציוד כירורגי כולל sc החדissors, hemostat, פינצטה משוננת מעוקלת, ופינצטה מעוקלת בלתי משוננת (ג);.. גודל של עכבר 3 ימים ישן המשמש לבידודים (ד &#39;) מלקחיים מחזיקים את צינור מרה המשותף בעכבר בילוד. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51621/51621fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51621/51621fig2.jpg" /> איור 2. אוכלוסיות טהורה של cholangiocytes extrahepatic מבודדות עם זיהום מינימאלי עם תאי mesenchymal. Cholangiocytes הוכתמו K19 (ירוק) עם ההדמיה DAPI גרעינית (כחולה). ברים סולם, 25 מיקרומטר. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:243px;"> כלי תקשורת </td><td style="width:227px;"> רכיב </td><td style="width:177px;"> הסכום </td></tr><tr height="21"><td height="84"rowspan = בסגנון &quot;4&quot; = &quot;גובה: 84px; רוחב: 243px;&quot;&gt; מדיה בידוד </td><td style="width:227px;"> גנטמיצין </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Fungizone </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> DMEM/F12 (1:1) </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="398" rowspan="18" style="height:398px;width:243px;"> תא המרה אפיתל (BEC) מדיה </td><td style="width:227px;"> FBS </td><td style="width:177px;"> 25 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> DMEM/F12 (1:1) </td><td style="width:177px;"> 500 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> M<html> EM חומצות אמינו לא חיוניות </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> אינסולין transferrin-סלניום </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Na פירובט </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:227px;"> תרכיז שומנים כימי מוגדר </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> גנטמיצין </td><td style="width:177px;"> 0.2 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Ethanolamine </td><td style="width:177px;"> 0.13 מיליליטר </td></tr><tr height="21">רוחב: 227px; &quot;&gt; פתרון ויטמין MEM </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> מעכבי טריפסין הסויה * </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> L-גלוטמין </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> תמצית בלוטת יותרת המוח שור </td><td style="width:177px;"> 1.1 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> * דקסאמתאזון </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> 3,3 &#39;,5-triiodo-L-thyronine * </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> גורם הגדילה באפידרמיס * </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21"style = &quot;גובה: 21px; רוחב: 227px;&quot;&gt; Forskolin * </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Fungizone </td><td style="width:177px;"> 1 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="63" rowspan="3" style="height:63px;width:243px;"> מדיית אחסון (להקפאת תאים) </td><td style="width:227px;"> תא המרה אפיתל תקשורת (BEC) </td><td style="width:177px;"> 7 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> DMSO </td><td style="width:177px;"> 1 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> FBS סטרילי </td><td style="width:177px;"> 2 מיליליטר </td></tr><tr height="100"><td colspan="3" height="100" style="height:100px;width:647px;"> * מצרכים צריכים להיות מוכנים לריכוזים מתאימים לפני הוספה לתקשורת. עיין ברשימת חומר להוראה נוספת. </td></tr><tr height="100"><td colspan="3"סגנון height = &quot;100&quot; &quot;גובה: 100px; רוחב: 647px;&quot; =&gt; ** לאחר המרכיבים מעורבבים, מדיה סינון סטרילי וaliquot. אפשר להקפיא את מדיה עד 6 חודשים ב-- 20 ˚ C. </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רכיבי מדיה.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes at JoVE.com

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג&#39;ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Google

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia.  טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג'ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה. 

Video: Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

חשיפת דלקת מפרקים דלקתית: חקירת תפקודים של תאים סינוביאליים

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central roles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. It is important to understand the functions of both cell populations to reveal the mechanisms underlying pathological progression and remission in inflammatory arthritis. In general, in vitro experimental conditions should mimic the in vivo environment as much as possible. Primary tissue-derived cells have been used in experiments characterizing synovial fibroblasts in arthritis. In contrast, in experiments investigating the biological functions of macrophages in inflammatory arthritis, cell lines, bone marrow-derived macrophages, and blood monocyte-derived macrophages have been used. However, it is unclear whether such macrophages actually reflect the functions of tissue-resident macrophages. To obtain resident macrophages, previous protocols were modified to isolate and expand both primary macrophages and fibroblasts from synovial tissue in an inflammatory arthritis mouse model. These primary synovial cells may be useful for in vitro analysis of inflammatory arthritis.

מחבר זרקור: בידוד ותרבות של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין  

The present study provides a modified protocol to isolate synovial macrophages and fibroblasts from murine inflammatory arthritis tissue.

בידוד ותרבית של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...