This study is supported by American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 and the National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). We thank Roberto Mendez from Wayne State University for assisting in the preparation of the manuscript.

1. ניתוק של אבי העורקים מעכברים כל הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש של וויין סטייט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר לתוך תא האינדוקציה של מכונת ההרדמה. הגדר את זרימת isoflurane ל 4% בשילוב עם 25% אוויר צח 75% O 2. להרדים את העכבר על ידי שאיפה של isoflurane (4% לזירוז, ± 1.0% לצורך תחזוקה) בשיתוף עם 25% אוויר צח 75% O 2 באמצעות תא אינדוקציה ואחריו חרטומו ייעודי. הערה: הרדמה עם isoflurane ניתן להעביר 75% חמצן / 25% האוויר או 100% חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את העכבר כל 5 דקות עד הרמה המתאימה של הרדמה הוא הגיעה (חוסר נסיגת קמצוץ בוהן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את העכבר מחוץ לתא האינדוקציה ולהמשיך משאיפת isoflurane למרות חרטומו הייעודי המחובר למכונת ההרדמה. הבוררisoflurane לזרום עד 1% כדי לשמור על הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם זה בהרדמה, לשים את העכבר על כרית ניתוח, ממוקמת על הגב שלו. השתמש קלטת מעבדה להבטחת הגפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנורת חימום כדי לשמור על חומו של העכבר. שמור את המנורה במרחק מתאים מן העכבר, כך העכבר לא יתר חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס החזה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים לנתיחה כדי לפתוח את הבטן מן קו האמצע, ולחשוף את אבי העורקים בבטן. פתח את חלל החזה ולחשוף את הלב והריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אבי העורקים בבטן באמצע במספריים לנתיחה כדי לשחרר את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 1 מ&quot;ל (עם 25 מחט G) עם 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 1,000 U / mL של הפרין. להזריק PBS המכיל 1,000 U / mL של הפרין אל החדר השמאלי ו perfuse האאורטה. דחוף את הלב ואת הריאות עם מלקחיים על העורקים הגדולים לצד ימין של עכברים כדי לחשוף את אבי העורקים החזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את אבי העורקים החזי באמצעות-di מיקרומלקחיים ssection והכניס אותו 1x קר כקרח PBS (סטרילי), ולאחר מכן להעביר את המיכל לתוך ברדס זרימת אוויר למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מזרק 1 מ&quot;ל מצויד עם 25 G מחט לתוך קצה אחד של אבי העורקים, בעדינות ולשטוף את אבי העורקים עם PBS קר כקרח כדי להסיר את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים מיקרו לנתיחה כדי להסיר כמה שיותר רקמת השומן המצורפת וקטנים כלי לרוחב ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את אבי העורקים אנדותל מדיום הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אבי העורקים לתוך 1 טבעות מ&quot;מ באמצעות סכין אזמל סטרילי. קציר על 8 - 10 טבעות לכל האאורטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח כל טבעת אבי העורקים באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה. </li></ol> זרע 2. מגזרי אבי העורקים על מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אינו בשימוש, לשמור על מטריקס צמיחה מופחתת גורם -20 ° C כדי למנוע התמצקות. שים את מטריקס גורם מופחת הצמיחה 4 מעלות צלזיוס לפחות לילה כדי לאפשר הפשרה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool טיפים צלחת pipet 6 גם ל -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות10 דק &#39;. מכניסים את הצלחת 6-היטב על קרח מעיל אחד טוב של צלחת עם 1 מ&quot;ל של מטריקס ללא החדרת בועות אוויר. מניח את הצלחת בתוך 37 ° C חממה עבור 20 דקות, כדי לאפשר המטריצה ​​כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתל החלקים אבי העורקים על מטריצה ​​הקרושה באמצעות מלקחיים מיקרו לנתיחה סטרילית. מניחים את חתיכות לומן-צדה על המטריצה ​​בלי לגעת האנדותל. מניחים 3 - 4 מגזרים אבי העורקים קרובים זה לזה על המטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מספיק מדיום גידול תא האנדותל כדי לשמור קטעים רטובים (~ 200 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 ל -4 עד 6 שעות. בסוף היום, להוסיף מספיק בינוני כדי לכסות את פלחי אבי העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו במגזר אבי העורקים הנבטה מעת לעת תחת מיקרוסקופ שלב ניגודיות. בדוק את הרמה בינונית צמיחת תאים בכל יום. הוסף בינוני במידת צורך לשמור מגזרי אב עורקים מכוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4 th, בעדינות להסיר את המדיום ולהסיר את f מגזרים אבי העורקיםROM מטריקס באמצעות מחט סטרילית בלי להפריע לתאי אנדותל גדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום הגידול סלולרי חדש אנדותל ולאפשר לתאי אנדותל ממשיכים להתרבות על מטריקס עבור 2 - 3 ימים. </li></ol> 3. Passaging ראשונית של לתאי אנדותל אבי העורקים עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל בקבוקון T12.5 חדש עם ג&#39;לטין (0.1%), דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את צלחות מטריקס בזהירות עם 37 סטרילי ° C PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של proteinase נייטרלי (50 U / mL) אל צלחות מטריקס דגירה בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה פלטפורמה עם רעד מדי פעם. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ שלב בניגוד לוודא שרוב התאים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של D-Val כדי להשבית את proteinase נייטרלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant בקפידה צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. לשטוף את הצלחת עם 2 מ&quot;ל D-Val ולאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב 900 XG במשך 5 דקות ב רוטמפרטורה מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התא גלולה ב 4 מ&quot;ל של מדיום הגידול תא האנדותל צלחת בבקבוק T12.5 מצופה ג&#39;לטין. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שהם 85% - 90% ומחוברות. </li></ol> 4. Passaging של לתאי אנדותל אבי העורקים עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל שתי צלוחיות T12.5 חדש עם ג&#39;לטין (0.1%), דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. טריפסין- EDTA טרום חום (0.25% טריפסין, 0.02 EDTA ב PBS) PBS סטרילית על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים בזהירות עם 37 סטרילי ° C PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של טריפסין- EDTA (0.25% טריפסין, 0.02 EDTA ב PBS) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 1 דקות או עד שרוב התאים להסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום הגידול תא האנדותל כדי לעצור את העיכול. פיפטה השעית התא למעלה ולמטה תוך זמני הבקבוק כמה. במידת הצורך, להשתמש בתאמגרד כדי לאסוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 900 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התא גלולה ב 4 מ&quot;ל של מדיום צלחת צמיחת תאים האנדותל 2 צלוחיות T12.5 מצופה ג&#39;לטין. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שהם 85% - 90% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאי האנדותל אבי העורקים עכבר לאחר 2 - 3 קטעים. </li></ol> אפיון 5. לתאי אנדותל אבי העורקים עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-צלחת התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 6-גם צלחת עם ג&#39;לטין (0.1%), דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. יש לשטוף את הצלחת עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו חימום מוקדם של טריפסין-EDTA ו PBS סטרילי עד 37 מעלות צלזיוס למשך כ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים סטריליים 3 PBS. הוסף 0.5 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA על התאים, דגירה של ~ 1 דקות ב 37 ° C or עד שרוב התאים להסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום הגידול תא האנדותל כדי לעצור את העיכול. פיפטה השעית התא למעלה ולמטה תוך זמני הבקבוק כמה. במידת הצורך, להשתמש מגרד תא לאסוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 900 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, מחדש להשעות את התאים במדיום גידול תא האנדותל. זרעים התאים בצלחת 6-היטב מצופה ג&#39;לטין בצפיפות של 3 x 10 5 / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאי הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לאפשר לתאים לצרף אל פני שטח התרבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיל-AC-LDL uptaken ו Ulex -lectin מחייב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את-3,3,3 1,1&#39;-dioctadecyl &#39;, 3&#39;- tetramethylindo-carbocyanine שכותרתו פרכלורט LDL acetylated (דיל-AC-LDL) ב -20 ° C. לפני מכתים, להפשיר דיל-AC-LDL על הקרח. Solu המניות דיל-AC-LDLtion הוא 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. אחסן את agglutinin europaeus Ulex FITC שכותרתו (Ulex -Lectin, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בשעה 4 מעלות צלזיוס. פתרון המניות Ulex -Lectin הוא 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. חנות Hoechst 33342 ב 4 מעלות צלזיוס. המניה Hoechst 33342 הפתרון הוא 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של פתרון המניות דיל-AC-LDL ל 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות לעשות לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מכתים, להסיר את המדיום הישן לשטוף את התאים בכל טוב עם המדיום החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום החדש ולהוסיף המדיום מכתים דיל-AC-LDL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של פורמלין 10% כדי לתקן את התאים. שים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך כ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. הימנע אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל סטרילי 1x PBS המכיל 10 μL של Ulex -Lectin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב חדר טמפרטורותמחדש בחושך במשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Ulex-לקטינים על ידי שטיפת התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Hoechst 33342 לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, דגירה 10 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את הקרינה של-LDL דיל-AC (אדום, גל עירור של 576 ננומטר), Ulex -Lectin (ירוק, גל עירור של 519 ננומטר) ו Hoechst (כחול, גל עירור של 361 ננומטר) עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים פלורסנט עבור CD31, VEGFR2, אינס, VE-cadherin ו Calponin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FITC- מצומדות חנות אנטי עכבר נוגדנים CD31, נוגדן אינס, VE-cadherin נוגדן, FITC- מצומדות IgG נגד ארנב ב 4 ° C בחושך. VEGFR2 חנות נוגדן -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של פורמלין 10% כדי לתקן את התאים. שים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך כ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים CD31, להוסיף 1 מ&quot;ל של 1x סטריליPBS המכיל 10 μL של נוגדן CD31-FITC. כדי להכתים או VEGFR2, אינס, VE-cadherin או calponin, להוסיף 1 מ&quot;ל של PBS 1x סטרילי המכיל 4 μL של VEGFR2, אינס, VE-cadherin או calponin נוגדן ראשוני, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים על קרח למשך 1 שעות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדנים על ידי שטיפת התאים עם פעמים סטריליים 3 PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים של VEGFR2, אינס, VE-cadherin או calponin, להוסיף 1 מ&quot;ל של PBS 1x סטרילי המכיל 10 μL של IgG נגד ארנב FITC- מצומדות. דגירת התאים על קרח למשך 1 שעות בחושך. הסר את IgG ידי שטיפת התאים עם פעמים סטריליים 3 PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Hoechst 33342 לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, דגירה 10 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את הקרינה של CD31, VEGFR2, אינס, VE-cadherin, calponin (ירוק, גל עירור של 518-535 ננומטר) ו Hoechst (כחול, גל עירור של 361 ננומטר) עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+early+structural-functional+changes+in+the+endothelium+for+vascular+disease.">Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).</li><li>Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells,+antineutrophil+cytoplasmic+antibodies,+and+cytokines+in+the+pathogenesis+of+systemic+vasculitis.">Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis.</a> Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).</li><li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Reactive+protein-induced+endothelial+microparticle+generation+in+HUVECs+is+related+to+BH4-dependent+NO+formation.">C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation.</a> Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).</li><li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+circulating+CD31+/CD42-+microparticles+are+associated+with+impaired+systemic+artery+elasticity+in+healthy+subjects.">Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects.</a> American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).</li><li>Mackay, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells+from+patients+with+severe+emphysema.">Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema.</a> Respiratory research. 14, 23 (2013).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue.">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).</li><li>Bowden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+alpha4+integrin+and+VCAM-1+in+CD18-independent+neutrophil+migration+across+mouse+cardiac+endothelium.">Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium.</a> Circulation research. 90, 562-569 (2002).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+induces+apoptosis+in+mouse+aortic+endothelial+cells+and+endothelial+dysfunction+in+mice+fed+high-calorie+and+high-cholesterol+diets.">Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets.</a> Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).</li><li>Atkins, G. B., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+differentiation:+molecular+mechanisms+of+specification+and+heterogeneity.">Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).</li><li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brothers+and+sisters:+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity.">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation research. 108, 929-939 (2008).</li><li>Shimamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+foods+on+contraction+of+endothelial+cells+as+a+key+mechanism+in+atherogenesis+and+treatment+of+atherosclerosis+with+endothelial-cell+relaxants+(cyclic+AMP+phosphodiesterase+inhibitors).">Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors).</a> Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).</li><li>Chiu, J. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium:+pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives.">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).</li><li>Rostgaard, J., Qvortrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+demonstrations+of+filamentous+molecular+sieve+plugs+in+capillary+fenestrae.">Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae.</a> Microvascular research. 53, 1-13 (1997).</li><li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מחקר זה מדגים שיטה פשוטה לבודדים תאי התרבות האנדותל מתוך האאורטה עכבר בלי שום ציוד מיוחד. מכתים immunofluorescence הצביע על כך שרוב התאים היו תאי אנדותל לאחר הקטע השני. הוא הציע כי תאים ב שני למעבר שלישי מתאימים במבחנה בניסויי vivo ללמוד ביולוגיה האנדותל. <p class="jove_conte...

האנדותל של כלי הדם הוא לא רק שכבת מחסום שמפרידה דם ורקמות, זה נחשב בלוטת אנדוקרינית עצומה המשתרעת על עץ כלי הדם כולו עם שטח פנים של 400 מ&quot;ר 1. את רווחתם של האנדותל חיוני הומאוסטזיס וסקולרית. האנדותל מתפקדת משתתף והפרעות שונות לב וכלי דם, כולל טרשת עורקים, וסקוליטיס ופציעות איסכמיה / reperfusion, וכו &#39;2-4. נכון להיום, את המנגנונים תאיים ומולקולריים הספציפיים המעורבים הגדרות מחלות אלה אינם מובנים היטב בשל אופי אנטומיים המתפזר של האנדותל. העכבר הוא מודל חשוב למחקר כי טכניקות מניפולציה גנטיות הן יותר התפתחו בעכברים מאשר בכל מיני יונקים אחרים. עם זאת, את הבידוד של תאי אנדותל אב עורקים בעכברים העיקריים נחשב קשה במיוחד בגלל גודלו הקטן של אב העורקים עושה enzymatעיכול ic של האנדותל מעשי. חלקם דיווחו נהלים לבודדים ולטהר ECS דורשות 5-7. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בשיטה פשוטה כדי לבודד להרחיב בתאי האנדותל מן האאורטה העכבר ללא שימוש בכל ציוד מיוחד. בפרוטוקול זה, האאורטה המבודד הטרי נחתך למקטעים קטנים זורע על מטריצה ​​עם האנדותל פונה כלפי מטה על מנת לאפשר הנבטה האנדותל. לאחר המגזרים יוסרו, תאי אנדותל מורחבים במדיום האנדותל מועדף והם מוכנים לניסויים אחרי שניים או שלושה קטעים. היתרונות של השיטה המתוארת הם כי: 1) מספרים גבוהים באופן משמעותי של תאי אנדותל נקצרים מן האאורטה יחיד; 2) כדאיות התא נשמר היטב; ו -3) לא נדרש ציוד או טכניקה מיוחדת. הוא מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים תאיים ומולקולריים ספציפיים פתופיזיולוגיה תא האנדותל. לאלו המעוניינים ללמוד יחסי ציבורimary בתרבית תאי אנדותל מעכברי נוק-אאוט או גן, גן עקום בעכברים, או מודל מחלה בעכברים, פרוטוקול זה הוא מאוד שימושי וקל לתרגל.

<table><tbody><tr><td>4- or 6-week-old mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>#10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth medium (Dulbeccos&amp;rsquo; Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium [DMEM] with 25&amp;nbsp;mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000&amp;nbsp;U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000&amp;nbsp;U/mL penicillin and 10&amp;nbsp;mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth factor reduced matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Neutral proteinase (Dispase, 1&amp;nbsp;U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034&amp;nbsp;g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos&amp;rsquo; Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1&#039;-dioctadecyl-3,3,3&#039;,3&#039;- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)</td><td>Life Technologies</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>FITC-labeled &lt;em&gt;Ulex europaeus&lt;/em&gt; agglutinin (&lt;em&gt;Ulex&lt;/em&gt;-Lectin)</td><td>Sigma</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553372</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9698</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase</td><td>Abcam</td><td>ab5589</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse vascular endothelium-cadherin</td><td>Abcam</td><td>33168</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse calponin</td><td>Abcam</td><td>700</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-rabbit IgG</td><td>Sigma</td><td>F6005</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe fitted with 25-G needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-900-04222</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Peri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-516</td><td></td></tr><tr><td>Six-well cell culture plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>T12.5 culture flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-076</td><td></td></tr><tr><td>Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine with isoflurane</td><td>Webster Veterianary Supply</td><td>07-806-3204</td><td></td></tr><tr><td>heating lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge machine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted phase-contrast microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inverted fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

הנבטת תא האנדותל תא האנדותל ספונטני נברא נכתב ממקטע עכבר אב עורקים. מגזר האאורטה העכבר היה מותר לגדל על מטריצה-מופחת גורם גדילה אז במדיום גידול תא האנדותל במשך 4 ימים. נביטת תא האנדותל מופיעה בדרך כלל 2 - 4 ימים. Photomicrographs נל...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

isolation-and-primary-culture-of-mouse-aortic-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

30.6K Views.  Wayne State University. The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Video: Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Neuroscience

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Medicine

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunology and Infection

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...