העבודה של סופרי FCO, DF, י&quot;נ, DJH וGDS הוזכרה לעיל ממומן על ידי משרד המדען הראשי, מספר מענק: ETM37 ונתמך על ידי המרכז לחקר הסרטן בבריטניה הניסויית סרטן הרפואה. עבודתו של אל ממומנת על ידי מכללת מנתחים המלכותית של אדינבורו רוברטסון נאמנות, מלוויל הנאמנות לטיפול והריפוי של הסרטן והמועצה למחקר הרפואי. IO נתמך על ידי אגודה מלכותית למלגת ממשלת סקוטלנד אדינבורו cofunded פעולות Curie מארי ובריטניה המועצה למחקר הרפואי. המחברים מבקשים להודות לעמיתים ולמשתפי פעולה SCOTRRCC מועמדים לדיונים השימושיים שלהם על חלק מהנושאים שנדונו במאמר זה.

1. זיהוי של ההטרוגניות גידול מורפולוגי והמולקולריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידולים הוסרו מ-80 ° C מקפיא ושמרו על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלק גידולים למקטעים של כ 1 סנטימטר 3. למפות את המיקום המקורי של כל סעיף יחסית לזה גידול ותווית עם שם ייחודיים. דגימות חנות ב cryovials הבודד ב-80 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מעייל באוקטובר ולקצץ בcryostat ב-22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות מוכתמות באמצעות Hematoxylin ושיטת counterstaining Eosin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניתוח מיקרוסקופי של חלקים קפואים כדי לוודא שהם בטבע ccRCC, גידול בר קיימא ולדירוג (ציון נמוך, ציון נמוך / גבוה בכיתה או מעורב גבוה, המאתגרים להבחין Fuhrman ציוני 1-4 בקטע שהוקפא). איור 1 &amp; b (צביעת H &amp; E מדרגה נמוכה ומעורבת גבוהה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עד 4 דגימות מכל אזור מורפולוגית שונה בתוך כל גידול להפקת חלבון. </li></ol> 2. הפקת חלבון מדגימות גידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך מדגם גידול מאוקטובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 50-75 מ&quot;ג של רקמה לתוך 2 צינורות מ&quot;ל עם 990 μl של חיץ תמוגה [50 mM טריס-HCl (pH 7.5), 5 המ&quot;מ EGTA (pH 8.5), 150 המ&quot;מ NaCl] השלים עם aprotinin (סיגמה A6279) (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל), הקוקטייל phosphatase מעכב 2 (Sigma, P5716), קוקטייל מעכב phosphatase 3 (Sigma, P0044) וקוקטייל מעכב פרוטאז (Roche, 11836153001). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כדור פלדה אחת 5 מ&quot;מ לכל צינור והומוגני ב50Hz במשך 5 דקות פעמים באמצעות TissueLyser, בודקות את הרמה של הומוגניזציה אחרי כל תקופה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מדגם הומוגני לצינור החדש מ&quot;ל 2 באמצעות פיפטה משאירה מאחורי כדור הפלדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של טריטון X-100 לכל דגימה לפני צנטריפוגה ב XG 13000 למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatants לצינורות microcentrifuge טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון באמצעות BCA assay (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לנרמל ריכוזי חלבון ב1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li></ol> 3. דודו נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות חלבון (המופק משורות תאים מתאימות או רקמות) לכתם מערבי ולהפעיל על 10% ג&#39;ל SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות על קרום ניטרוצלולוזה הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הקרום במאגר חסימת אודיסיאה Li-קור (בדילול 50:50 בPBS) עבור 1 שעה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדנים הראשוניים במאגר חסימת אודיסיאה Li-קור (בדילול 50:50 בPBS) ביצרנים מומלץ בדרך כלל דילול 1 ב1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת קרום בנוגדני הלילה עיקריים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור 0.1% PBS-Tween20 (PBS-T; 1 המ&quot;ל Tween20 / 1L PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הקרום בPBS-T בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות (x3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל fluorescently שכותרתו נוגדנים משניים במאגר אודיסיאה חסימה (בדילול 50:50 בPBS) 0.01% SDS בדילול 1:10,000 (1.5 μl/15 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת קרום בתיכוןנוגדנים בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות עם טלטול עדין - חשוב להגן על הקרום מן האור עד לזמן שזה כבר סוף הסוף סרוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הקרום בPBS-T בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות (x3), שמירה על הקרום בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הקרום ב PBS בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות (x3) להסיר Tween20 שייר, שוב שמירת הקרום בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקר קרום שטוח על פיסת נייר סינון בחושך ולאפשר לייבוש באוויר - דבר המאפשר את הקרום להתייבש עשוי להגביר את האות ולהפחית רקע, אבל להפוך אותו חסר תועלת להפשטה ומחדש חיטוט-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הקרום בסורק אודיסיאה LiCor. שמור על הקרום בחושך עד למועד שבו נסרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר רק נוגדנים שיוצרים להקה שולטת יחידה במשקל המולקולרי הנכון. איור 3 מציג דוגמאות של נוגדנים מקובלים ולא מקובלים לשימוש עם RPPA. </li></ol> 4. RPPA פריnting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysates החלבון נצפו על שקופיות זכוכית מצופית ניטרוצלולוזה (Fastslides-Whatman) באמצעות MicroGrid השני רובוטית משקיף. את השקופיות השתמשו הכילו 2 רפידות שעליו דגימות נכתמו. כל כרית הייתה מוכתמת בדגימות זהות, במקרה זה 100 דגימות. פורמטים נוספים זמינים כוללים 1, 8 ו 16 שקופיות כרית. המספר הגבוה יותר של רפידות קטנים יותר במספר הדגימות שניתן הבחין על גבי כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרה של חמישה דילולים 2-קיפול נעשתה מכל מדגם וכל אחד היה אז הבחינה בשלושה עותקים (וכתוצאה מכך הסכום כולל של 15 נקודות לדגימה). </li></ol> 5. איתור החלבון RPPA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות רטובות במאגר חסימת LiCor עודף (בדילול 50:50 בPBS). לדגור על RT לשעה 1 בפלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 800 μl של נוגדנים עיקריים במאגר חסימת LiCor (בדילול 50:50 בPBS) בריכוזים הרצויים ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את השקופיות באחת (אני) קליפ יפ מסגרת אחתאו (ii) החזיק שקופיות המפרץ &quot;FastFrame &#39;4, כך שחותם חזק נוצר בין השקופיות ותא הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ השיורי מהבארות ולהוסיף נוגדן ראשוני 600 μl לבארות בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השקף והחדר לתוך קופסה אטומה רטובה ולדגור על הפלטפורמה מתנדנד בין הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור 0.1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 20 Tween μl / המ&quot;ל PBS 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות מהחדר הקר ולהסיר את הנוגדנים העיקריים בזהירות מכל באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 600 μl של PBS-T ולשטוף שקופיות על נדנדת פלטפורמה בRT למשך 5 דקות (X3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן fluorescently שכותרתו נוגדנים משניים על ידי דילול במאגר אודיסיאה חסימה (בדילול 50:50 בPBS) 0.01% SDS ב1:2,000 דילול (μl 1/2 מ&quot;ל) בערכאה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ מהבארות ולהוסיף 600 μl נוגדנים משניים שהכותרת-fluorescently לבארות בהתאמה. דגירת נוגדנים משניים בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות עם טלטול עדין - זהחשוב להגן על הקרום מן האור עד לזמן שזה כבר סוף סוף הסריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדנים משניים מלשטוף היטב ובקצרה (x3) ב600 μl PBS-T בטמפרטורת חדר. הסר שקופית ממנשא, להעביר למכל מתאים ולשטוף בעודף PBS-T במשך 15 דקות, תוך שמירה על הקרום בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קרום נוסף לשטוף עם PBS בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות PBS-T ולהסיר-20 Tween השיורית, שוב מקפיד על הקרום בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את Fastslide בתנור 50 ° C למשך 10 דקות ולאחר מכן לסרוק בסורק אודיסיאה Li-הקור. שמור את השקופית בחושך עד שנסרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את השקופית ב680 ננומטר ו / או 800 ננומטר בהתאם הנוגדן / נוגדנים משמשים המשני. לאיתור שני צבעים תמיד להשתמש נוגדנים משניים החוצים adsorbed מאוד למזער תגובה צולבת. בחירה זהירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים היא הכרחית לזיהוי בשני צבעים. חשיבות העיקרית היא הבחירה שלמינים שונים מארחים (ארנב ועכבר למשל) לשני הנוגדנים היסודיים. זה מאפשר אפליה על ידי נוגדנים משניים נגד ארנב ואנטי עכבר שכותרתו עם צבע בספקטרום פליטה להבחין בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבצי תמונות נשמרים כקבצים. tiff. איור 4 (תמונה של קבצים סרוקים). </li></ol> 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת MicroVigene (VigeneTech, קרלייל, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח. קובץ תמונת TIFF המכיל סריקה של שקופית RPPA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר קובץ תבנית מוגדרת מראש שיהיה לו רשת לכיסוי על התמונה של שקופית RPPA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הגדרת אזורים של עניין כפתור (ROI), כדי להעלות את הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הרשת מעל נקודתי RPPA. איור 6 א (דמותה של רשת מעל תמונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן בחר הכל כדי לסמן את כל את ההחזר על ההשקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ מצא הכל. MicroVigene יהיה automatically למצוא את ההחזר על ההשקעה, מוצא את הנקודות, לחסר רקע, להסיר כל אבק וכתמים לכמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלחצן Curve הדילול צפו להעלות את התוצאות לכל הדגימות בשקופית RPPA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על שמירת נתוני דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל דגימה מודפסת על פני 5 נקודות כל דילול בשלושה עותקים יש 15 נקודות לניתוח, אשר מפחית את הסיכון לטעויות ומשפר את האיכות הולמת עקומה. MicroVigene מייצר לוגיסטי-4-יומן אלגוריתם פרמטר מודל &quot;Supercurve&quot; (איור 6 ב), המשלב את כל הנקודות כדי לייצר עקומת סיגמואיד של קינטיקה המחייבת אנטיגן נוגדן. ההנחה היא שקינטיקה המחייבת נוגדנים אנטיגן הזהה מתרחשת בכל מקום מדגם, אפילו בדגימות השונות, ולכן על ידי לקיחה כל הכתמים על מערך שיתאים לעקומת תגובה משותפת יכול להגביר את האמון של התאמת עקומות 10,11 Y = + (BA) (/ (1 + e (ג * D-ln (x))) כאשר x הוא dilution הגורם וY הוא עוצמת האות. דוגמאות ניתן לנתח יחסית באמצעות y0 הערך, אשר בניתוח שלנו תואם את ערך Y בנקודת האמצע של ערכי x לאחר מיפוי אלה על supercurve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים ב-Microsoft Excel ועלילת y0 כמו באיור 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שונות חלבון intratumoral חושבו בנפרד עבור מטופלים שלא טופלו ויטופלו במסגרת ניתוח שונה. הפצות שונות המשלבות נתונים מכל החלבונים נתחו הושוו על ידי מאן ויטני מבחן (MWT). סטיות intratumoral לחלבונים בודדים הושוו ע&quot;י מבחן F שבו נחות של נורמליות וhomoscedasticity התקיימו, בהתאמה הוערכו באמצעות Lillefours ובדיקות Fligner; שיעור גילוי שקר (רוזוולט) תיקון יושם 12. ביטוי חלבון הפרש בין דגימות חולה לא טופלו ומטופלים נבדק עבור כל חלבון באמצעות תלמיד מבחן t של נורמליות שבו והנחת homoscedasticityזה היה נפגש, אחרת MWT בוצע; רוזוולט היה מוחל על ערכי t-מבחן וMWT משולבים 12. משמעותו של ביטוי חלבון ומתאם פירסון השונה של החלבונים נאמדה באמצעות גישה סטנדרטית [R התייחסות] ורוזוולט מיושם 12. </li></ol>

<ol>
	<li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma.">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li><li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li><li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets.">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52 (2010).</li><li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors.">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li><li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter+and+intratumour+heterogeneity:+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma.">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49 (2012).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma.">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557 (2012).</li><li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis.">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li><li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays.">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li><li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions.">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53 (2011).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת RPPA מוצגת כאן מייצגת אלטרנטיבת תפוקה גבוהה לשימוש נרחב, אך נמוכה יחסית טכניקת הכתם מערבי תפוקה של ניתוח חלבון. השיטה מאפשרת מאת דגימות להיות חצי כמותית נתחו והשוואה בו זמנית מאפשר השוואה ישירה של חלבוני מפתח במגוון רחב של שורות תאים ודגימות רקמה. ריבוב עם מיני נו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> aprotinin </td><td> סיגמא </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> קוקטייל מעכב phosphatase 2 </td><td> סיגמא </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> קוקטייל מעכב phosphatase 3 </td><td> סיגמא </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> קוקטייל מעכב פרוטאז </td><td> רוש </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> טריטון-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> אודיסיאה Li-קור חסימת המאגר </td><td> Li-קור </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85600 </td></tr><tr><td> MicroGrid השני רובוטית טיווח </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> 4 החזיק שקופיות המפרץ &quot;FastFrame </td><td> Whatman </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> שקופיות FAST - 2-Pad </td><td> Whatman </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT עיזים אנטי עכבר IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW עיזים נגד ארנב IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers

כיום לא קיים טיפול מרפא לטיפול בסרטן גרורתי של תאי הכליה ברור תא, הגרסה הנפוצה ביותר של המחלה. גורם מרכזי בעמידות לטיפול זה נחשב למורכבות המולקולרית של המחלה 1. טיפול ממוקד כגון מעכבי טירוזין קינאז (TKI)-sunitinib כבר נוצל, אבל רק 40% מחולים יגיבו, עם הרוב המכריע של חולים אלו התקפיים בתוך שנת 1 2. כפי השאלה כזו של התנגדות פנימית ורכש בחולי סרטן תאי כליה היא רלוונטית מאוד 3. כדי ללמוד התנגדות לTKIs, עם המטרה הסופית של פיתוח טיפולים יעילים ומותאם אישית, רקמה רציפה לאחר תקופה מסוימת של טיפול ממוקד היא חובה, גישה שהוכיחה את הצלחתה ב4 לוקמיה מיאלואידית כרוניות. עם זאת יישום של אסטרטגיה כזו בקרצינומה של תאי כליות הוא מסובך בשל הרמה הגבוהה של both ההטרוגניות ובין intratumoral, בו היא תכונה של קרצינומה של תאים של כלית 5,6, כמו גם גידולים מוצקים אחרים 7. ההטרוגניות Intertumoral בשל הבדלים גנטיים transcriptomic ומבוססת היטב גם בחולים עם מצגת דומה, שלב ודרגה של גידול. בנוסף ברור שיש הטרוגניות רבה המורפולוגי (intratumoral) בRCC, שעשוי לייצג את ההטרוגניות מולקולרית גדולה עוד יותר. מיפוי וסיווג מפורט של גידולי RCC ידי ניתוח צורני משולב ודירוג Fuhrman מאפשרים בחירה של אזורים יציגים לניתוח proteomic. ניתוח מבוסס חלבון של RCC 8 הוא אטרקטיבי בשל הזמינות הנרחבת שלה במעבדות פתולוגיה, עם זאת, יישומה עלול להיות בעייתי בשל הזמינות המוגבלת של נוגדנים ספציפיים 9. בשל אופי נקודת הכתם של מערכי חלבון השלב ההפוכים (RPPA), סגולי נוגדנים ב חובהדואר מראש תוקף; כבקרת איכות קפדנית כל כך של נוגדנים המשמשים הוא בעלת חשיבות עליונה. למרות מגבלה זו פורמט כתם הנקודה אינו מאפשר מזעור assay, המאפשר הדפסה של מאה דגימות לשקופית ניטרוצלולוזה אחת. שקופיות מודפסות אז ניתן לנתח באופן דומה לניתוח מערבי עם השימוש בנוגדני היעד ספציפיים עיקריים ונוגדנים משניים שכותרתו fluorescently, המאפשרות ריבוב. ביטוי חלבון הפרש בכל הדגימות בשקופית אז ניתן לנתח בו זמנית על ידי השוואת הרמה היחסית של קרינה באופן יעיל, חסכוניים יותר ותפוקה גבוהה.

דוגמה לשקופית RPPA סרוקה ניתן לראות באיור 4 (א) עם שני 680 ו 800 ערוצי ננומטר המוצגים. מפריד את התמונות על ידי אורך גל, איור 4 (ב) מאפשר לכל משטח על ביטוי חלבון בודד נקבע איור 4 (ג) שקופית RPPA להיות מנותחים. כפי שניתן לראות באיור 4 (ג) לביטוי של ח...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA מאפשר ביטוי החלבונים של מאה דגימות, שהודפסו בשקופיות ניטרוצלולוזה לחקירה בו זמנית, תוך שימוש בנוגדנים שכותרתו fluorescently. טכניקה זו יושמה כדי לבחון את ההשפעה של טיפול תרופתי בהטרוגניות קרצינומה של תאים של כליה ברורה.

השימוש במערכי חלבון שלב הפוכים (RPPA) לחקור וריאצית ביטוי חלבון בתוך הסרטן של תאי כליה בודד

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

the-use-reverse-phase-protein-arrays-rppa-to-explore-protein

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

33.5K Views.  University of Edinburgh. RPPA מאפשר ביטוי החלבונים של מאה דגימות, שהודפסו בשקופיות ניטרוצלולוזה לחקירה בו זמנית, תוך שימוש בנוגדנים שכותרתו fluorescently. טכניקה זו יושמה כדי לבחון את ההשפעה של טיפול תרופתי בהטרוגניות קרצינומה של תאים של כליה ברורה.

Video: The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

השימוש במערכת תלוי במשקל עבור חסימת עורק הכליה מבודדת

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a large extracellular domain and a short cytosolic domain termed the APP intracellular domain (AICD). During maturation through the secretory pathway, APP can be cleaved by proteases termed &alpha;, &beta;, and &gamma;-secretases1. Sequential proteolytic cleavage of APP with &beta; and &gamma;-secretases leads to the production of a small proteolytic peptide, termed A&beta;, which is amyloidogenic and the core constituent of senile plaques. The AICD is also liberated from the membrane after secretase processing, and through interactions with Fe65 and Tip60, can translocate to the nucleus to participate in transcription regulation of multiple target genes2,3. Protein-protein interactions involving the AICD may affect trafficking, processing, and cellular functions of holo-APP and its C-terminal fragments. We have recently shown that AICD can aggregate in vitro, and this process is inhibited by the AD-implicated molecular chaperone ubiquilin-14. Consistent with these findings, the AICD has exposed hydrophobic domains and is intrinsically disordered in vitro5,6, however it obtains stable secondary structure when bound to Fe657. We have proposed that ubiquilin-1 prevents inappropriate inter- and intramolecular interactions of AICD, preventing aggregation in vitro and in intact cells4. While most studies focus on the role of APP in the pathogenesis of AD, the role of AICD in this process is not clear. Expression of AICD has been shown to induce apoptosis8, to modulate signaling pathways9, and to regulate calcium signaling10. Over-expression of AICD and Fe65 in a transgenic mouse model induces Alzheimer's like pathology11, and recently AICD has been detected in brain lysates by western blotting when using appropriate antigen retrieval techniques12. To facilitate structural, biochemical, and biophysical studies of the AICD, we have developed a procedure to produce recombinantly large amounts of highly pure AICD protein. We further describe a method for inducing the in vitro thermal aggregation of AICD and analysis by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical, biophysical, and structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on AICD aggregation.

A method for large-scale purification of the APP intracellular domain (AICD) is described. We also describe methodology to induce in vitro AICD aggregation and visualization by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical/structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on its aggregation.

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary to produce erythema (inflammatory reddening) on the surface of the skin. In this context, the MED is regarded as a key factor in determining starting doses for UV phototherapy for common skin conditions such as psoriasis and eczema. In research settings, MED testing also has potential to be a powerful tool for assessing within- and between-persons variation in inflammatory responses. However, MED testing has not been widely adopted for use in research settings, likely owing to a lack of published guidelines, which is a barrier to obtaining reproducible results from this assay. Also, protocols and equipment for establishing MED vary widely, making it difficult to compare results across laboratories. Here, we describe a precise and reproducible method to induce and measure superficial erythema using newly designed protocols and methods that can easily be adapted to other equipment and laboratory environments. The method described here includes detail on procedures that will allow extrapolation of a standardized dosage schedule to other equipment so that this protocol can be adapted to any UV radiation source.

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is used to establish dosage schedules for ultraviolet radiation phototherapy. It can assess individual variation in inflammatory response but lacks methodology for achieving reproducible results. Here, we present a precision implementation of MED and demonstrate its ability to capture individual variation in inflammatory response.

הטמעה מדויקת של מינון מינימלי של אריתמה (מד) בדיקות להערכת וריאציה אינדיבידואלית בתגובה דלקתית אנושית

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research field. Accumulation of drugs in certain organs may give rise to adverse and unwanted effects, depending on the nature of injectate. To minimize spillover and/or accumulation in other tissues, the herein described method directs the formulation into the renal artery bloodstream by inserting a catheter in the infra renal aorta, just below where it branches into the renal artery, resulting in the kidney as first reached organ and distributing of formulation throughout the kidney.
This manuscript provides a detailed description of the method, as well as its challenges and difficulties. It guides the experimenter to become skillful with this type of microsurgery that requires accuracy under sterile conditions. Speed is crucial for minimizing the ischemia and practicing the procedure will increase the chance of successful injections without adverse effects. By modulating the time between injection and reperfusion as well as the injected volume, the risk of spillover to other organs is mitigated. 
Note that this technique is suitable for single dosing strategies.

This manuscript describes a method for targeted delivery to a single kidney via a catheter placed in the infrarenal abdominal aorta in the mouse.

משלוח תרופות ישיר לכליות דרך עורק הכליה

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...