אנו רוצים לציין את התמיכה של האוניברסיטה שיקגו סעיף לאורולוגיה בראשותו של ד&quot;ר אריה להב, ומנהל מחקר אורולוגית ד&quot;ר קארי רינקר-שפר. אנחנו גם רוצים להכיר את התמיכה מאוניברסיטת המרכז לסרטן של שיקגו (UCCCC) בראשות של ד&quot;ר מישל Le Beau. אנחנו גם עם להודות לסיוע טכני מומחה של מתקן הרקמה האנושי מרכז משאבי ליבה בראשות ד&quot;ר מארק Lingen, וסיוע של לזלי מרטין ומרי ג&#39;ו פקטה. אנו מודים גם מתקן Core אימונוהיסטוכימיה מנוהל על ידי טרי לי. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת שיקגו מחלקה לכירורגיה, אורולוגיה של סעיף; האגודה אמריקנית לסרטן מוסדי מענק מחקר (ACS-IRG, # IRG-58-004); מרכז סרטן התמיכה גרנט (P30 CA14599); Brinson קרן; קרן אלווין באום המשפחה; אוניברסיטת שיקגו דירקטוריון קרן לחקר סרטן של הנשים; ס Kregel נתמך על ידי HHMI: עמיתי מד ל- גראדירך (56006772) וסרטן הביולוגיה הדרכה גרנט (T32-CA09594). לבסוף, ברצוננו להודות לרוברט קלארק, ד&quot;ר VenkateshKrishnan, ונתן Stadick להערכה הביקורתית של כתב היד שלהם.

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים מוסדי ועדת שימוש שיקגו (IACUC, מספרים והפרוטוקול 72,066 72,231). כל הניתוח בוצע תחת הרדמה, וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. תאי הגזע העוברי האנושי הקו WA01 (H1; NIH-רישום # 0043) נרכש מWiCell (מדיסון, ויסקונסין) ותרבותי באמצעות פרוטוקול מזין עצמאי באמצעות mTeSR1 תקשורת (תאי גזע טכנולוגיות; ונקובר, BC). תאי גזע עובריים שמשו בתוך עשרה קטעים של הפשרה. 1. בידוד של סינוס ואברי המין מעוברי עכברים או עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר מתוזמן בהריון (17.5 יום) או עכברוש (יום 18.5) על ידי שאיפה של CO 2 למשך 5 דקות. מוות הוא אושר על ידי הפסקה של סימנים חיוניים בחולדה. ואז לשבור את צווארו אנושי. Rבהוא מורדמים בשלב זה. לרסס 70% אתנול לחיטוי העור ואגפי הבטן. חותכים את עור הבטן ושכבות שרירים ולאחר מכן לחתוך את הרחם, להפריד את עוברי עכברים מהשק מי השפיר, ולחתוך את חבל הטבור. מעבירים את העוברים לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל המכיל תמיסת מלח מאוזנת של האנק הקר כקרח (HBSS) ולשמור על קרח. עוברים מומתים על ידי עריפת ראש עם מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העובר בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ. לחצות את העובר עם מספריים ברמה של הטבור (איור 1 א). הסר את הקיבה ומעי הדק. לחשוף את השחלות בנקבת העובר והאשך בעובר הזכר (איור 1 ו1C). (השחלות נמצאות בקטבים הזנב של הכליות. האשכים הם בערך ברמה של שלפוחית ​​השתן). בשלב התפתחותי זה, UGSM מבודד משני העוברים ממין זכר ונקבה הם מסוגלים גרימת שושלת האפיתל של הערמונית בנוכחותו של מארחטסטוסטרון. 4 אחרי נקודת הזמן ההתפתחותי הזה, לעומת זאת, בלוטות ערמונית מתחילות לגבש לUGSM, והבידוד של UGSM הטהור הוא מאוד מאתגר. 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתיחה, לחתוך את דופן הבטן בקו האמצע עם מספריים Vannas כדי לחשוף את שלפוחית ​​השתן והדופן אחורי של הבטן. דרכי המין העליונות החופשית מקבצים מצורפים (בעוברים ממין זכר, לחתוך את השופכן, Wolffian הצינור וצינור Müllerian; בעוברים ממין נקבה, לחתוך את השופכן וMüllerian הצינור). לשחרר את שלפוחית ​​השתן מחבל הטבור. לחתוך עצם ערווה ונפרד בבוטות מהקיר הקדמי של סינוס ואברי המין עם מלקחיים קצה קנס דומונט. לבסוף, להפריד את הקיר האחורי של סינוס ואברי המין מפי הטבעת. חותכים את סינוס ואברי המין עם השלפוחית ​​בקצה התחתון (מהשופכה) ולאחסן את סינוס כמקשה אחת ואברי המין (עם שלפוחית ​​השתן) בHBSS הקר כקרח. </li></ol> 2. הפרדת mesenchyme סינוס ואברי המין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; הסר את שלפוחית ​​השתן ואברי המין מסינוס תחת מיקרוסקופ לנתיחה (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את סינוס ואברי המין לצינור פלקון המכיל טריפסין 1% בסידן (Ca 2 +) ומגנזיום (Mg 2 +) HBSS חינם. מניחים את הצינור במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 75 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את טריפסין ולנטרל trypsinization עם 10% עוברי בובין סרום (FBS) בDMEM/F12 בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקניט בזהירות את שרוול mesenchymal הדביק מצינור אפיתל עם מחט או מלקחיים קצה קנס דומון (שמירה על שלמות צינור אפיתל מפחית את הסיכוי לזיהום תאי אפיתל של mesenchyme, זה יכול לגרום לבלוטות מכרסמים ויצר יחד עם הגזע אנושי שלך תאים שמקורם אפיתל בלוטות) (1D איור). 12 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר UGSM לתוך צינור חדש פלקון המכיל DMEM/F12 בינוני + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס; 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) + 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) בתוספת 1nm R1881. Plאייס הצינור באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 רקמות וזורקים supernatant. לשטוף עם פוספט חיץ מלוח (PBS) (נא לא להפריע רקמת גלולה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף collagenase 0.2% (בDMEM/F12) מחדש להשעות את הרקמות. דגירה של 37 ° C עם נדנדה עדינה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ מערבולת רקמת העיכול שלוש פעמים עד שהוא הופך תערובת הומוגנית מתא בודד ולהוסיף DMEM/F12 בינוני + 10% FBS 1% + P / S 1% + + NEAA 1nm R1881 לנטרל collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 ולאחר מכן לשטוף מחדש על ידי השעיית-תאי UGSM בHBSS, וחזור שלוש פעמים לשטוף את UGSM באופן מלא. לבסוף להשעות תאי mesenchymal בDMEM/F12 ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או מכשיר ספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את תאי הס פרוטוקול ללא מזין באמצעות תרבותי עם mTeSR1 תקשורת (גזע טכנולוגיות סלולריים, ונקובר, BC) באמצעות עיכול Accutase (Millipore; Billerica, MA). שטוף את תאי הסבשלב היומן של הצמיחה שלהם בDMEM/F12 תקשורת חמה, ואז מוסיף פתרון Accutase 1x חם, ודגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 15-20 דקות עד שתאים בודדים הם ניתקו באופן אחיד ממושבות. הוסף כמות שווה של 1x מוגדר טריפסין מונעי (Invitrogen; גרנד איילנד, ניו יורק) כדי לנטרל את Accutase ופיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב ולשבור את גושי תאים. תאי פיפטה לתוך צינור צנטריפוגות וצנטריפוגות במשך 3 דקות ב 200 XG, מחדש להשעות תא גלולה בDMEM/F12 תקשורת. צנטריפוגה צינור 3 דקות ב 200 XG שוב ולהסיר את supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות בHBSS הקר או DMEM/F12 בנפח רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תאי הס עם יחס של 1:2.5 הס / תאי mesenchymal. 3 זה יהיה הרכב תאי של 5 תאי UGSM 1E עם 4 hESCs 4E להזרקת 10 מ&quot;ל (חולדה אחת UGS בדרך כלל תשואות על 6 תאי mesenchymal 2E). צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ולאחר מכן לבטל את supernatant. Re-להשעות עם 75% Matrigel (BD Biosciences,סן חוזה, קליפורניה, מעורבב עם 25% HBSS הקר לטיפול קל יותר) ולמקם את הצינור בקרח להזרקה תת הקפסולה כליות. </li></ol> 3. השתלה של רקמות רקומביננטי מתחת לקפסולת הכליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אזור ניתוח סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר עירום athymic גברי עם ה-IP של קטמין / xylazine; להשתמש בתערובת טריות המכילה יחס 1:01:08 של קטמין: xylazine: מלוחה. מינון יהיה קטמין מ&quot;ג / ק&quot;ג 100 ו2.5 Xylazine מ&quot;ג / ק&quot;ג. בעלי חיים שאינם מגיבים לבוהן קמצוץ צריכים להיות באופן מלא תחת במשך 20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח להכין את העכבר על ידי גילוח האתר כירורגית (אם לא משתמש בעכבר בעירום), ניקוי עם שלושה מגבונים מתחלפים של אלכוהול 70% ואחריו התמיסה פולידין ויישום וילון כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים משחה לחות העין (משחת עיני Altalube) לעיניו של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ניתוח, קצב נשימה וטמפרטורת גוף ליבה של העכברים מנוטרים. את קצב הנשימה should להיות יציב ונשמר בתוך 40-90 נשימות / דקה. טמפרטורת גוף ליבה היא פיקוח עם תצפית של הצבע של הריריות והכפות ורודות של כפות רגליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ס&quot;מ חתך בגב עור אורך זמן 1.0. תמשיך לחתוך את דופן הבטן בחתך אורכי 0.5 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוחץ בעדינות את הכליה מתוך הבטן ולשמור על לחות פני השטח הכליות באמצעות טיפות של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לנקב את הקפסולה הכליות באמצעות מחט מזרק 27 מד ריק. לנקב רדוד מאוד מספיק. זה יהיה איפה אתה מכניס מחט הקהה להזריק התערובת הסלולרית שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מחט מזרק בוטה 28 מד עם 10 μl של התערובת הסלולרי שלך. לאט לאט להכניס את האתר לנקב ולחדור parenchyma הכליות להגיע לאזור שמתחת הקפסולה הכליות. הזרק 10 μl של התערובת הסלולרית כדי ליצור בולוס על הכליות מתחת הקפסולה הכליות. נסיגת המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הכליות לעבדוחלל minal. אבטח את השכבה השרירית של הצפק עם תפרי ניילון 4-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור עם או תפר או סיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את הדם מהעור באמצעות תמיסת מלח סטרילית. </li></ol> 4. שיכוך כאבים שלאחר ניתוח וניטור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את החיה עם עצירות (0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג בכל שעה 12) או ketoprofen (3-5 מ&quot;ג / ק&quot;ג בכל שעה 12 מלוחה) לטיפול בכאב שלאחר ניתוח, ו1 מ&quot;ל של 37 מעלות צלזיוס IP מלח כדי לשמור על בעלי החיים חמים ולמנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את בעל החיים בכלוב נקי והנח אותו על כרית חימום קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח את בעלי החיים בחזרה לחדר של חיה ברגע שהם יחזרו להכרה ונעים בתוך הכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לבעלי החיים מדי יום לסימנים בלתי צפויים של מחלה ודלקת בשלושת הימים הבאים. העכברים מנוטרים עם תצפית של פעילות בכלובים כוללים מזון ומים הניגשים יום 1 לאחר הניתוח. אם העכברים להציג פעילויות פחות, Ketoprofen הוא intraperitoneally מודעהכהן שוב פעם ביום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסיכות או תפרים עור 2 שבועות לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לקצור רקמות xenograft מוקדם ככל 8 שבועות לאחר ניתוח. ניתן הדמיה xenografts in vivo באמצעות אולטרסאונד של חיות קטנות (איור 2 א), ורקמות קבועות יכולות להיות מחולק ומוכתמות לחלבונים שונים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Taylor, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+human+prostate+tissue+from+embryonic+stem+cells.">Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).</li><li>Cunha, G. R., Chung, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+(Tfm/y)+mice.">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).</li><li>Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+morphogenesis+and+growth:+role+of+mesenchymal-epithelial+interactions.">Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions.</a> Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).</li><li>Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+urogenital+development:+a+practical+approach.">Mouse urogenital development: a practical approach.</a> Differentiation. 71, 402-413 (2003).</li><li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+abnormal+development+of+the+male+urogenital+tract.+Role+of+androgens,+mesenchymal-epithelial+interactions,+and+growth+factors.">Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors.</a> J. Androl. 13, 465-475 (1992).</li><li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+as+mediators+of+androgen+action+during+the+development+of+the+male+urogenital+tract.">Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract.</a> World J. Urol. 13, 264-276 (1995).</li><li>Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+reprogramming+of+adult+human+epithelial+differentiation.">Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation.</a> Differentiation. 65, 113-118 (1999).</li><li>Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal,+cellular,+and+molecular+control+of+prostatic+development.">Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development.</a> Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).</li><li>Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterospecific+induction+of+prostatic+development+in+tissue+recombinants+prepared+with+mouse,+rat,+rabbit+and+human+tissues.">Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues.</a> Differentiation. 24, 174-180 (1983).</li><li>Van der Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+CD133+in+Normal+Human+Prostate+Stem+Cells+and+Malignant+Cancer+Initiating+Cells.">The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells.</a> Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human,+rat,+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts.">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. , (2009).</li><li>Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human,+rat,+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts.">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. 69, 1557-1564 (2009).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).</li><li>Prokhorova, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells+is+site+dependent+and+enhanced+by+the+presence+of+Matrigel.">Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel.</a> Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).</li><li>Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+stains+for+p63+and+alpha-methylacyl-CoA+racemase,+versus+a+cocktail+comprising+both,+in+the+diagnosis+of+prostatic+carcinoma:+a+comparison+of+the+immunohistochemical+staining+of+430+foci+in+radical+prostatectomy+and+needle+biopsy+tissues.">Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues.</a> Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+prostatic+epithelial+model+of+hormonal+carcinogenesis.">A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis.</a> Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).</li><li>Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+expression+of+prostate-specific+membrane+antigen,+a+tissue+differentiation+antigen+and+folate+hydrolase,+facilitates+prostate+carcinogenesis.">Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis.</a> Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).</li><li>Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+stromal-epithelial+interactions+in+hormonal+responses.">Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).</li><li>Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+regeneration+of+murine+prostate+from+dissociated+cell+populations+of+postnatal+epithelia+and+urogenital+sinus+mesenchyme.">In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).</li><li>Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+normal+macrophages+from+human+embryonic+stem+(hES)+cells+for+applications+in+HIV+gene+therapy.">Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy.</a> Retrovirology. 3, 24 (2006).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).</li></ol>

יש החוקרים שאין ניגוד עניינים עם עבודתו הוצגה.

רקומבינציה רקמות באמצעות UGSM היא טכניקה שימושית להפליא כדי לחקור את התפתחותו של סרטן הערמונית ואת האירועים המולקולריים מובילים לייזום סרטן הערמונית. הפוטנציאל אינדוקטיבית של UGSM שימש במשך מספר רב של יישומים בערמונית מחקר, אלה כוללים גידול שיפור לקחת משורות תאי ערמונ...

יש צורך עצום במערכות מודל אנושיות טובות יותר של סרטן הערמונית. בפרט, מערכות מודל אדם רלוונטיות של רקמות ערמונית נורמליות, שאינם ממאירות אשר ניתן מניפולציות גנטית כדי להבחין את התפקיד של גנים ספציפיים באופן ישיר בייזום של סרטן הערמונית היינו להיות אינפורמטיבי מאוד. כניסתו של העידן הגנומי זיהתה מספר רב של גנים שעשויים להיות תפקיד בהיווצרות הסרטן. חוסר מערכות מודל ניסיוני אדם, לעומת זאת, קשה פוגע ביכולת שלנו כדי לבחון בחינה התפקודית ולאפיין גני רגישות לסרטן ערמונית מועמד. מערכת מודל אידיאלית תהיה להקל על הניתוח הפונקציונלי המהיר ומהיר יותר של גני רגישות לסרטן בשילוב עם מערכות מודל מכרסמים מהונדסים מתאימות. יתר על כן, מערכת מודל אנושית כזה תאפשר אפיון מולקולרי של מנגנוני האיתות של ערמונית היווצרות הסרטן לעבר הגילוי והאימות של טיפולים חדשניים ללמנוע היווצרות סרטן הערמונית. תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) מסוגלים להרכיב רקמות ערמונית אדם כxenografts. בשנת 2006 טיילור, et al. דיווח כי יכול להיגרם hESCs כדי ליצור epithelia ערמונית in vivo כשמחדש בשילוב עם מכרסמים ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) בתוך פרק זמן של 8-12 שבועות. 1 מחקרים אלה התבססו על עבודה קודמת של המעבדה Cunha מראה כי UGSM עוברי המכרסמים יכולה לקדם את הבידול של הערמונית של תאי גזע ואוכלוסיות תאי אפיתל עובריים in vivo. 2,3 הערמונית מתפתחת מanlagen עוברי נקרא סינוס ואברי המין (UGS), ולפני 17 יום העוברי (עכבר E17 ; יום E18 בחולדה) ניתן להסיר את UGS ומחולק פיזי לתוך האפיתל (UGSE) וmesenchyme (UGSM) 4 גישת רקומבינציה רקמה זו שיפרה את ההבנה של התפתחות סרטן הערמונית ו, בפרט שלנו באופן משמעותי.גורם ly צמיחה ומסלולי איתות הורמונליים ואת מערכות יחסים בין מולקולריים ערמונית סטרומה והאפיתל. 5-8 שיטה זו כרוכה בשילוב vivo לשעבר של UGSM עם גזע או תאי האפיתל מאותם מינים או מובחנים וrecombinants הסלולרי / רקמה אלה מושתלים וגדל וxenografts בתוך מארח עכבר. 4,9 לאחר תקופה של צמיחה בvivo, השתל מכיל מבני בלוטות אפיתל ערמונית משובצים ברקמת סטרומה. ניתן לבצע צביעה נוספת כדי לקבוע אם מבנים כאלה הם באמת של הערמונית והוא המעשה ידי האדם. 10,11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>14170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM/F12</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>11330</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>R1881</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>965-93-5</td>
 <td>Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEAA</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>11140</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen-Strep Solution</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15070</td>
 <td>100x stock</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KETASET (ketamine hydrochloride) </td>
 <td>Fort Dodge Animal Health</td>
 <td>NDC 0856-2013-01</td>
 <td>100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AnaSed (xylazine) </td>
 <td>VET-A-MIX, Inc.</td>
 <td>NADA 139-236</td>
 <td>20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>215240</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C2014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketoprofen </td>
 <td>Fort Dodge</td>
 <td>NDC 0856-4396-01</td>
 <td>100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Altalube eye ointment </td>
 <td>Altaire Pharmaceuticals, Inc.</td>
 <td>NLC 56641-19850</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leica MZ16 F Stereomicroscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td></td>
 <td>Any good dissecting scope can be used.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas spring scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15001-08</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>84855</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt)</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-02 </td>
 <td>Custom Needle </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol Prep Pads</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>06-669-62 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Gauze Pads</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-415-469 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2)</td>
 <td>MedVet International</td>
 <td>J392H </td>
 <td>Needle-in, dissolvable suture </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Autoclip 9 mm Wound Clips</td>
 <td>Becton Dickenson</td>
 <td>427631</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PVP Iodine Prep Pads</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>06-669-98 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissector scissor with blunt end</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14072-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont fine tip forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11252-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle holder with Scissor</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

formation of human prostate epithelium using tissue recombination of rodent urogenital sinus mesenchyme and human stem cells

התקדמות במחקר סרטן הערמונית היא מוגבלת מאוד על ידי הזמינות של מערכות מודל אדם נגזרות והורמונים נאיביים, המגבילות את היכולת שלנו להבין את האירועים גנטיים ומולקולריים העומדים בבסיס מחלה ייזום ערמונית. לקראת פיתוח מערכות מודל טוב יותר ללימוד ערמונית אנושית סרטן, אנחנו ואחרים ניצלו את פוטנציאל אינדוקטיבי פרו ערמונית הייחודי של המכרסם העוברי ערמונית stroma, כינה ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM). כאשר recombined עם אוכלוסיות תאי pluripotent מסוימות, כגון תאי גזע עובריים, UGSM גורם להיווצרותו של אדם נורמלי ערמונית epithelia באופן תלוי בטסטוסטרון. מערכת כזו מודל אנושית יכולה לשמש כדי לחקור באופן ניסיוני ולבחון את היכולת של גני רגישות לסרטן ערמונית מועמד בקצב מואץ בהשוואה למחקרים מהונדסים מכרסמים טיפוסיים. מאחר ותאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יכולים להיות מהונדסים גנטי בתרבות usinביטוי גנים מושרה G או siRNA עקום למטה וקטורים שקדמו לרקומבינציה רקמות, מודל כזה מאפשר בדיקת ההשלכות התפקודיות של גנים, או שילובים של גנים, אשר נחשבים כדי לקדם או למנוע היווצרות סרטן. הטכניקה של בידוד אוכלוסיות טהורות של תאי UGSM, לעומת זאת, הוא מאתגר ולמידה לעתים קרובות דורשת מישהו עם מומחיות קודמת ללמד באופן אישי. יתר על כן, חיסון של תערובות תאים תחת הקפסולה הכליות של מארח immunocompromised יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מתארים וממחישים בידוד נכון של UGSM מעוברי מכרסמים והשתלת הכליה כמוסה של תערובות רקמות כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי. גישה כזו, בשלב הנוכחי שלה, דורשת in vivo xenografting של תאי גזע עובריים, שעלולים להיות יישומים עתידיים יכולים לכלול בהיווצרות בלוטת מבחנה או את השימוש של אוכלוסיות תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs).

בונה על הדו&quot;ח המרגש על ידי טיילור, et al., המעבדה שלנו פיתחה פרוטוקול engrafting באמצעות H1 הנפוץ (NIH המיועד WA01, גנטי גברי) שורת תאי גזע עוברית אנושית. 1 קו זה נבדק בקפדנות על בקרת איכות ו הוא karyotypically רגיל 13 כאשר בתרבית כראוי, יכולים להישמר תאי הס, הרחיב, וcryopreserve...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells at JoVE.com

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המוקדם סרטן ערמונית ייזום, רומן ומערכות מודל אדם חדשניים וגישות הם זקוקים נואשים. הפוטנציאל של טרום ערמונית ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) כדי לגרום לאוכלוסיות תאי גזע pluripotent כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי הוא כלי רב עוצמה במחקר ניסיוני ערמונית.

היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

formation-human-prostate-epithelium-using-tissue-recombination-rodent

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K Views.  University of Chicago. כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המוקדם סרטן ערמונית ייזום, רומן ומערכות מודל אדם חדשניים וגישות הם זקוקים נואשים. הפוטנציאל של טרום ערמונית ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) כדי לגרום לאוכלוסיות תאי גזע pluripotent כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי הוא כלי רב עוצמה ב...

Video: Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

הערכה של מאפייני תא גזע בקרצינומה של תאי השחלות אדם באמצעות Multi ומבחני Spheres מבוסס תא בודדים

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

דגם Murine Orthotopic פרה-קליני של סרטן ערמונית האדם

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

הערכה של רקמת שומן אנושי הפונקציה Microvascular באמצעות Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...