Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.

הערה: הנוהל אושר על ידי ועדת האתיקה דרווין מפירית ומארי קירי אוניברסיטה (Ce5 / 2009/048) 1. הכנת לטין פתרון, מכשירים, Vibratome, תרבות מדיה ותרבות צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון ג&#39;לטין 20% לפחות יום אחד לפני הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע, להוסיף 500 μl של gentamycin [10 מ&quot;ג / מיליליטר] לבקבוק 500 מיליליטר המכיל CO 2 בינוניים עצמאי (CO 2 -i). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכוס נפרדת, להוסיף 20 מיליליטר של CO2-I (מצעד 1.1.1) וחום על 95 מעלות צלזיוס בבלוק חימום עם ערבוב מתמיד במשך 15 דקות. תבחין בשינוי צבע לצהוב, מצביע על כך שהפתרון מוכן לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 4 גרם של ג&#39;לטין ועני בהדרגה לפתרון מוכן לעיל (שלב 1.1.2) עם ערבוב וחימום מוגבר על 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, כדי להשיג פתרון צבע צהוב. אפשר פתרון ג&#39;לטין כדי לקרר תחתלמכסה המנוע לכ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 4 מיליליטר של פתרון ג&#39;לטין לתרבות מנות קוטר 35 מ&quot;מ ללא החדרת בועות אוויר. שמור את הצלחת על 21 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מכסה את המנות עם סרט פלסטיק, ולהפוך את המנות. לחלופין, לאחסן את הכלים על 4 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון ג&#39;לטין 4%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע, להוסיף 25 מיליליטר של CO 2 בינוני -i במכל פלסטיק סטרילי, וחום על 42 מעלות צלזיוס בבלוק חימום. הוצא את המדיה מבלוק החימום ולהוסיף 1 גרם של ג&#39;לטין בהדרגה למדיום החם ומערבבים. במהירות להחזיר את המכל על בלוק החימום (42 מעלות צלזיוס) ולשמור אותו חם בתהליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמה של המנגנונים vibratome: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המנות המכילות 20% פתרון ג&#39;לטין מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס. חותך את הג&#39;לטין עם אזמל. הפוך את פרוסת ג&#39;לטין ולתקוע אותו על דיסק התמיכה השחור של vibratome באמצעות טיפה שלדבק uper. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור סכין גילוח לשני חצאים, והכנס את מחצית לשקע vibratome מחזיק. הכנס את דיסק תמיכה השחור על מנגנון vibratome. הפעל את הידית השחורה לצד ימין. תקן את הקיבול מחזיק על ראשו של vibratome. להוסיף כמות מספקת של CO 2 בינוני -i במכל vibratome כדי לכסות את גוש הג&#39;לטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את vibratome ולחתוך שלוש 100 מיקרומטר פרוסות של גוש ג&#39;לטין. שמור את גוש הג&#39;לטין לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מיליליטר של מדיום תרבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני השתנה Dulbecco נשר (DMEM) עם 10% של עגל בסרום עוברי (FCS) מתחת למכסת המנוע. הכן 1 מ&quot;ג מלח חיץ פוספט באמצעות מיליליטר Poly-D- ליזין pH / (PBS) 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת 96-היטב, להוסיף 2 מיקרוגרם / 2 סנטימטר של פולי-D-ליזין למעייל התחתון של הבארות. דגירה את הצלחת למשך 45 דקות ב 37 ° C בתוך 5% CO 2 באינקובטור. לאחר דגירה, להסיר את PBS ולהחליף עם 200 μl/ גם DMEM ומקום שוב על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור לפני השימוש. </li></ol></li></ol> 2. Dissection של רשתית שלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate העכבר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר על פי ההנחיה האירופית 2010/63: נקע בצוואר רחם. חותך את הראש עם מעוקלים-מספריים ולמקם אותו בצלחת פטרי בקוטר 100 מ&quot;מ לאחר שחטא את העין עם חומר חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העין לאחר שניתק את עצב הראייה על ידי חתך אותו באמצעות אחיזה מעוקלת מאוד בזהירות. אז למקם את שני העיניים בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ המכילה בינוני -i סטרילי CO 2 ב 21 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת הרשתית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חור ברמה של העין-האיבר בעזרת מחט 18 G כדי להיות מסוגל להציג את המספריים לגלובוס עין. להציג את המספריים ישר בתוך החור ולחתוך בזהירות בלובן העין מתחת לאיריס על כל המערכת של הגלובוס העיני כדי להסיר גוף הריסים. </li><li&gt; הסר את הקרנית והעדשה ולשמור על התא האחורי של העין עם רציף הרשתית ללובן העין. עם שתי נקודות אחיזה בסדר, להסיר את הזגוגית ממוקמת בתוך החדר האחורי ללא פגיעה ברשתית. לבצע ארבעה חתכים רדיאליים (רשתית / לובן העין) להתיר השטחה של הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עליית הגלובוס העיני ולקלף אותו כמו &quot;תפוז&quot;. לנתק את הרשתית מלובן העין ואפיתל רשתית פיגמנט (RPE). לנתק את הרשתית עדיין מחוברת ברמה של עצב הראייה בזהירות עם מעוקלים-מספריים עדינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הזגוגית שנותרה מהפריפריה לכיוון המרכז של הרשתית עם שתי נקודות אחיזה בסדר. ודא שכל הזגוגית נמחקה לחלוטין על מנת לאפשר להשטחה של הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקצה של פיפטה פלסטיק ולהעביר את הרשתית לצלחת פטרי בקוטר 35 מ&quot;מ המכילה CO 2 בינוני -i עם פיפטה הפלסטיק. </li></ol></li></ol> 3. איטום של שטוח mounteד רשתית על טין בלוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 20 - 30 מיליליטר של CO 2 בינוני -i מטנק vibratome (גוש ג&#39;לטין ללא תשלום), כדי לאפשר האיטום של רשתית רכוב שטוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרשתית לשקופיות זכוכית בעזרת פיפטה פלסטיק ולהוסיף טיפה של CO 2 בינוני -i לפני העברה לפרוסת ג&#39;לטין עם קולטי האור פונים כלפי מטה על פרוסת ג&#39;לטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הרשתית לבלוק ג&#39;לטין בעדינות על ידי הזרקת ג&#39;לטין 4% חימם בצד אחד של הבלוק בין הרשתית וגוש ג&#39;לטין ובו זמנית גירוש ג&#39;לטין החם בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;לטין 4% לשאוב עם פיפטה פסטר. חכה 10 דקות כדי לאפשר איטום מוחלט. להוסיף CO 2 בינוני -i לטבול את הגוש ואת הלהב לחלוטין. </li></ol> 4. חתך הרשתית הערה: שלב זה הוא קריטי להשגת שכבה של תאי קולטי אור ללא תאי רשתית אחרים (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהחלק העליון בשכונה ג &#39;לטין, לחתוך 100 מיקרומטר סעיפי סדרתי להגיע לרשתית. ואז לחתוך 100 - של השכבה הפנימית 120 מיקרומטר סעיפים. בהתאם ליישום, שכבה זו עשויה להיות מושלכת או מאוחסנת בחנקן נוזלי. ודא שהמהירות של vibratome היא מאוד איטית (1 או 2) בחתך של שכבות שכבה או קולטניות אור הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 15 מיקרומטר חלקי ביניים של הרשתית המתאימה לממשק שבין הפנימי והחיצונית של הרשתית. שים לב סעיף זה תחת מיקרוסקופ. היעדרם של כלי דם מצביע על כך שכבר הגיעה לרשתית החיצונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 200 מיקרומטר של הרשתית החיצונית (שכבת קולטי האור) עם ג&#39;לטין ולהעביר אותו לצלחת בקוטר 35 מ&quot;מ מלא 3 מיליליטר של CO 2 בינוני -i. שמור את זה על קרח עד שכל חלקי שכבת קולטי אור של כל הרשתית מתקבלים. </li></ol> 5. תאי קולטי אור מתנער <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת (es) המכיל את שכבת קולטי האור (ים) והכנסתי אותו (אותם) בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בעדינות להפריד את שכבת קולטי האור מג&#39;לטין ולהעביר אותו בצלחת חדשה מלאה עם 3 מיליליטר של תמיסת רינגר. חזור על שלב זה (5.2) עבור כל הכנת שכבת קולטי אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 2 יחידות של פפאין עם 25 μl של פתרון activator (1.1 mM EDTA; L-cystein 5.5 מ&quot;מ; β-mercaptoethanol 60 מיקרומטר) בצינור סטרילי פוליפרופילן 5 מיליליטר ו דגירה זה 30 דקות ב 37 ° C בתוך 5% CO 2 באינקובטור . ההפעלה של פפאין מושגת על 37 מעלות צלזיוס. במהלך דגירה זה, לחתוך את שכבת קולטי האור לתוך 2 מ&quot;מ 2 חתיכות (לא קטנות מדי) ולהעביר את החלקים הללו לתוך 5 מיליליטר צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרשתית פעמיים עם 1.5 מיליליטר של התמיסה של הפתרון Ringer אחרי שקיעה הכבידה. הסר את כל הפתרון של רינגר שנותר מהצינור עם הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 475 μl של הפתרון של רינגר לצינור המכיל פפאין ותמהיל הופעל. להוסיף את הפתרון הזה לצינור המכיל את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינור עם הרשתית במשך 20 דקות ב 37 ° C בתוך 5% CO 2 באינקובטור. לעצור את התגובה על ידי הוספת 1 מיליליטר של 10% FCS בDMEM. הוסף 25 U של deoxyribonuclease אני (DNAse I) ל- DNA מתעכל מתאי מוות. homogenize בזהירות את ההשעיה התא באמצעות 1 מ&quot;ל פיפטה. ספין ב 50 XG במשך 6 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant כדי להסיר עקבות של סרום ולהוסיף DMEM בינוני עם תוספים (ראה טבלה של reagents_equipment הספציפי) לתא-גלולה וresuspend בזהירות את ההשעיה התא עם טפטפת מיליליטר 1. ספין ב 50 XG במשך 6 דקות ב RT. חזור על שלב זה (5.7) פעם נוספת. </li></ol> 6 תאי קולטי אור Culturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת קולטי האור של עכבר בPN8 מכילה כ 1-1,500,000 תאים באמצעות טכניקה זו. זרעי תאי קולטי האור ליום 1 בx 10 5 תאים / 2 סנטימטר בצלחת תרבות עם מדיום תרבות ותרבות התאים במשך 5 ימים ב 37 ° C בתוך 5% CO 2 באינקובטור. ביום 5, המשך immunochemistry ושיטות מחקר הבא מערביות סופג מסופקות על ידי ספקי הנוגדן. הערה: צעדים כדי לעצור את התרבות ובדיקות ראשוניות מתוארות בהתייחסות 21. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System.">The Organization of the Retina and Visual System.</a> Webvision. , (2014).</li><li>Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).</li><li>Mohand-Said, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+transplants+increase+host+cone+survival+in+the+retinal+degeneration+(rd)+mouse.">Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse.</a> Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).</li><li>. RetNet, the Retinal Information Network Available from: <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet">https://sph.uth.edu/retnet</a> (2014)</li><li>Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+transplantation+of+rods+delays+cone+loss+in+a+retinitis+pigmentosa+model.">Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model.</a> Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).</li><li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors.">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+photoreceptor+and+total+neural+retina+preserves+cone+function+in+P23H+rhodopsin+transgenic+rat.">Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat.</a> PLoS One. 5 (10), (2010).</li><li>Mohand-Said, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+retina+releases+a+diffusible+factor+stimulating+cone+survival+in+the+retinal+degeneration+mouse.">Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).</li><li>Fintz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+retina-derived+cone+neuroprotection+in+two+culture+models+of+photoreceptor+degeneration.">Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).</li><li>Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degenerations:+from+cell+signaling+to+cell+therapy;+pre-clinical+and+clinical+issues.">Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues.</a> Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).</li><li>Wright, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+searchlight+through+the+fog.">A searchlight through the fog.</a> Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).</li><li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor.">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).</li><li>Lillig, C. H., Holmgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+and+related+molecules--from+biology+to+health+and+disease.">Thioredoxin and related molecules--from biology to health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).</li><li>Fridlich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thioredoxin-like+protein+rod-derived+cone+viability+factor+(RdCVFL)+interacts+with+TAU+and+inhibits+its+phosphorylation+in+the+retina.">The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cone+rescue+by+RdCVF+protein+in+a+dominant+model+of+retinitis+pigmentosa.">Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa.</a> Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).</li><li>Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+delivery+of+rod-derived+cone+viability+factor.">Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor.</a> Retina. 25 (8 Suppl), S47 (2005).</li><li>Komaromy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+photoreceptor+deconstruction+by+CNTF+enhances+rAAV-mediated+cone+functional+rescue+in+late+stage+CNGB3-achromatopsia.">Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia.</a> Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).</li><li>Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa.">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disruption+of+the+rod-derived+cone+viability+gene+leads+to+photoreceptor+dysfunction+and+susceptibility+to+oxidative+stress.">The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+ganglioside+composition+of+photoreceptors+during+postnatal+maturation+of+the+rat+retina.">Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina.</a> Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).</li><li>Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+purified+rat+photoreceptors+in+vitro+is+stimulated+directly+by+fibroblast+growth+factor-2.">Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2.</a> J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeobox+gene+CHX10/VSX2+regulates+RdCVF+promoter+activity+in+the+inner+retina.">The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina.</a> Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).</li><li>Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+photoreceptor+circadian+oscillator+strongly+relies+on+lighting+conditions.">Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions.</a> Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).</li><li>Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+the+developing+postnatal+mouse+retina.">Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).</li><li>Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+facilitates+quantitative+analysis+of+wild-type+and+Nrl(-/-)+retinal+transcriptomes.">Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes.</a> Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).</li><li>Delyfer, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+surgical+specimens+using+jouRNAI.">Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Ying, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CAT+reporter+construct+containing+277bp+GNAT2+promoter+and+214bp+IRBP+enhancer+is+specifically+expressed+by+cone+photoreceptor+cells+in+transgenic+mice.">A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice.</a> Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הרשתית היא איבר מודל בביולוגיה. מחקר של הרשתית הוביל ל6 תגליות גדולות בביולוגיה. זה במוצא של RB1 הגן מדכא הגידולים הראשונים. הוא מגלה את הקשר בין מולקולרי טירוזין קינאז קולט וקינאז MAP דרך האינטראקציה עם בן sevenless. זה היה מעורב בגילוי Pax6, גן הבקרה הראשית הראשון להמורפוגנזה איבר. זה במרכז הקשר הגנטי של גורם משלים H (דנ&quot;א) עם ניוון מקולרים הקשור לגיל (AMD), גן רגישות המחלה הראשון שזוהה על ידי מסך התאגדות רחבה הגנום (GWAS). לבסוף, היא הובילה לריפוי גן המוצלח הראשון לamaurosis המולדת לבר, משפט הריפוי גנטי המתקנת הראשון בבני של כל מחלה תורשתית. המבנה של איבר זה נשמר ברוב המינים של בעלי חוליות. נגישותו למניפולצית in vivo עודדה מוקדם על חקירות גנומיקה פונקציונליות בחלק נפרד של הסנטRAL מערכת עצבים. אנחנו מראים כאן איך להפריד את שכבת קולטי האור מהשכבה הפנימית של הרשתית על ידי חתך vibratome. שלב זה הוא קריטי להשגת תרבויות קולטי אור טהורות. הפרוטוקול לנתיחה שלנו הופך את הזיהום על ידי תאי RPE מאוד לא סביר. אחד האתגרים הגדולים הוא השטחה של הרשתית שיש צורך הסעיף כראוי הפנימי והחיצונית של הרשתית. חתך של הרשתית הוא הטוב ביותר ברשתית עם קוטר קטן כמו אלה ממכרסמים וקוטר זה הוא מגבלה של הטכניקה עם חומר זמין נוכחי. מומלץ לפני תחילת ניסוי משמעות ביולוגית, להתאמן על מדגם של הרשתית. אנו מדגימים את השיטה על ידי נציגי תוצאות המתקבלות מתאי קולטי אור בתרבית, באמצעות החומר לבצע מחקר ביטוי של שני mRNAs וחלבונים. ניתן גם לבצע מחקרי ביטוי לחלופין על sections מתקבל על ידי microdissection ללכוד לייזר, אבל התרבויות מבוצעות הטובות ביותר באמצעות חתך vibratome. היינו יכול להשתמש בטכניקה של לייזר microdissection עם אסטרטגיה שונה מלאה. אבל, כדי לאסוף את שכבת photoreceptor עם מנגנון microdissection לתרבות, זה יהיה נחוץ כדי למנוע מקבע וזה יסבך את המתודולוגיה הנוכחית באופן משמעותי. אנחנו מפתחים פרוטוקול שנועד לומד קינטיקה של גן וביטוי חלבון בסעיפי vibratome בניוון של קולטני אור במודלים של רטיניטיס פיגמנטוזה. אנו מאמינים כי התיאור מפורט של הפרוטוקול יהיה שימושי לחוקרים בתחום הביולוגיה ברשתית, ובעיקר ללימודים proteomic וmetabolomic.

הרשתית היא חלק בלתי נפרד ממערכת העצבים המרכזית שבו יש ארכיטקטורה משומרת בקרב בעלי חוליות. הנוירונים של הרשתית העצבית מאורגנים בשכבות, עם המרוחק ביותר לאור האירוע, שכבת קולטי האור בקשר הדוק עם אפיתל רשתית פיגמנט (RPE) בחלק האחורי של העין. photorecptors רוד והחרוט הם תאים רגישים לאור המסתמכים על מולקולות רגישות opsin עבור לכידת פוטון. מולקולות אלה סגורות על קרומי דיסק של מבנה תאי, הממוקמים בקטע החיצוני של קולטי האור המצביע בכיוון של הרשתית 1. מבנה זה, שלרוב מושפע בשלב מוקדם מאוד במקרים של מחלות קולטי אור, מתחדש בשיעור של 10% בכל יום. השכבה הפנימית שנקראו מכילה את רוב תאי העצב האחרים שלחשב את עוצמת האות הנקלטת מהקולטניים האור, דו-קוטבי, וamacrine תאים אופקיים, כמו גם את תאי גנגליון. אלה אחרון עם האקסונים שלהםיוצר קרן שהוא עצב הראייה. שכבות זה כל כך שמורה שהביולוגים השתמשו תאי amacrine הטווח נעקר כאשר התאים נמצאים מחוץ לשכבה הפנימית plexiform 2. שכבות של תאי עצב מופצות בתוך שריון של תאי גליה רדיאלי מולר. תאים דו קוטביים לקשר קולטניים אור לתאי גנגליון. הם נמצאים בין שכבת plexiform החיצונית והשכבה הפנימית plexiform. תאי הגנגליון יוצרים שכבת plexiform הפנימית בקשר עם התאים דו קוטביים. תאי amacrin נקראים כמו תאי עמותה ממוקמים בשכבת plexiform הפנימית בין התאים דו קוטביים ותאי הגנגליון. השכבה החיצונית plexiform מכילה תאים אופקיים. הסדר ייחודי זה של שכבות עצביות של מערכת העצבים המרכזית מאפשר הבידוד של שכבת קולטי האור משיכבת התאים הפנימית על ידי חיתוך הרשתית רכוב שטוחה באמצעות vibratome. במקור, טכניקה זו שימשה לבודד את קולטני האור לטראןsplantation בעיניים של עכבר RD1, מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה האנושי (RP) 3. עכבר RD1 נושא מוטציה רצסיבית בגן Pde6b אשר מקודד למקטע בטא phosphodiesterase המוט ספציפי. מוטציות רצסיבי של הגן הזה בתוצאת RP בבני האדם 4. לאחר קולטני אור מוט התנוונו, החולה מאבד את ראיית הלילה, וקולטני אור חרוט באופן מפתיע, שאינו מבטא את הגן שעבר מוטציה, מנוון כצעד שני. בגלל קונוסים נדרשים לראיית צבעים וחדות ראייה, החולים הופכים בהדרגה עיוורת וטיפול יעיל למחלה עדיין לא פיתח. על ידי השתלת שכבת קולטי אור מעכבר wild-type הניוון החרוט של עכבר המארח מתעכב 3.5. המוטות איבדו במודל ניוונית מוט חרוט לא יכולות להיות מוחלפות על ידי השתלה כי ניתן להשיג את הקשר הסינפטי בין מוטות ותאים דו קוטביים רק בשלב מסוים של rפיתוח etinal, שסומן על ידי ההופעה של ביטוי NRL 6. השכבה של קולטני אור מוצגת על ידי ניתוח בחלל תת-רשתית של רשתית RD1 המוט פחות, בין הרשתית והרשתית החיצונית המתאימה רק 3% מקולטניים האור שנותר, את הקונוסים. שבועיים לאחר הניתוח, 40% מהאצטרובלים מבעלי החיים מושתלים בשכבת photoreceptor נורמלית שרדו בהשוואה לבעלי החיים מושתלים בשכבה רגילה של תאים ברשתית פנימיים, או לבעלי חי הדמה המופעל. הטופוגרפיה של הישרדות קונוס, פרוש מעל פני השטח של רשתית מוטציה הממוקמת במיקום של הרקמה מורכב מציינת כי ההשפעה המגנה היא בשל מולקולת diffusible 7. בשלב הבא, היינו מערכת שיתוף תרבות, כמו גם תקשורת ותרבות המותנה כדי לאמת את העובדה שההשפעה המגנה מסתמכת על הפרשת חלבון על ידי מוטות 8,9. אנו משערים כי חלבון זה יהיה Expressed ברציפות ובאופן ספציפי על ידי מוטות ושמותם במהלך השלב הראשון של המחלה תפעיל ניוון חרוט משניים מאובדן אות מגן ממוטות באופן אוטונומי שאינו תא 10. בשל החשיבות של ראייה מרכזית חרוט בתיווך בפרימטים חלבון משוער זה יהיה כלי טיפולי רלוונטי ביותר עבור RP. שמירה על קונוסים בRP היה תיאורטית למנוע כוללת של 1.5 מיליון מטופלים ברחבי העולם על מנת להפוך לעיוור 11. יש לנו להשתמש בגישת תכולה גבוהה הקרנה ומודל תרבות מועשרת קונוס לזהות cDNA קידוד Cone נגזר רוד הכדאיות פקטור (RdCVF) מספריית cDNA רשתית 12. RdCVF הוא מוצר שחבור של גן NXNL1 ש, מעניין הוא הומולוגי לגן המקודד לחלבוני thioredoxin המעורב בהומאוסטזיס חיזור 13. מוצר שחבור השני של הגן, RdCVFL הוא אנזים המגן על היעד שלה, חלבון אוניברסיטת תל אביב נגד ד חמצוניamage 14. מנהל של RdCVF מונע ניוון המשני של קונוסים ואובדן תפקוד הראייה שלהם ברצסיבית, ומודל דומיננטי של RP 12,15. זה מדגים שני היבטים חשובים של אסטרטגיה טיפולית חדשנית זה 16. ראשית, זה יכול להיות מיושם ברוב המקרים RP באופן גן-עצמאי. שנית, הישרדות CNTF, RdCVF בניגוד לגורם המתחרה קשורה לשמירה על תפקוד הראייה 17. היעדר ההשפעה תפקודית עשוי להסביר את הסיבה של היעדר התועלת קלינית של המינהל בCNTF לחולי RP 18. RdCVF הוא הסיכוי הטוב ביותר אחד של אות ההישרדות החשובה בין מוטות קונוסים מאז ההצלה החרוט במבחנה היא מעוכבת על ידי immunodepletion RdCVF 12. בנוסף, השיבוש של גן הכדאיות חרוטה נגזר המוט מוביל לחוסר תפקוד וקולטי אור רגישות ללחץ חמצוני 19. השימוש בשכבת קולטי אור היא במקור של הזדהות של RdCVF ושל אות חיזור רומן מעורבת במחלות ניווניות 20. כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול המשמש לבודד תאים ותרבות משיכבת photoreceptor לאפיין את הפעילות של RdCVF. יכול להישמר הקולטניים האור בתרבות במשך 5 עד 7 ימים 21. גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הביטוי של גנים ספציפיים קולטי אור.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"><a name="RANGE!A1:D28">Name of Material / Equipment</a></td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:131px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:368px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5&#8242;-diphosphocholin*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0256</td>
			<td>4.7 &#181;M Cytidine 5&#8242;-diphosphocholin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5&#8242;-diphosphoethanolamine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0456</td>
			<td>2.7 &#181;M Cytidine 5&#8242;-diphosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linole&#239;c acid/ bovine serum albumin (BSA)*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8384</td>
			<td>100 &#181;g/ml linole&#239;c acid/ bovine serum albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-L-thyronine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td>0.03 &#181;M Triiodo-L-thyronine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-wells plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">CO2 independent (CO2-i)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18045054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps n&#176;5 Dumont</td>
			<td>Bionic</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin from porcin skin type A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneChip&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>U74v2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortison*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>0.55 &#181;M hydrocortison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin* (I)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.86 &#181;M insulin (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain</td>
			<td>Worthington-biochem</td>
			<td>WOLS03124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Progesterone*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7556&#160;</td>
			<td>2.0 &#181;M progesterone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5172</td>
			<td>0.28 &#181;M prostaglandin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Putrescine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td>&#160;182 &#181;M putrescine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Albion</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissor&#160;</td>
			<td>Moria</td>
			<td>15396-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Selenite* (S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.29 &#181;M Na2SeO3&#160;&#160; (S)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td>3 mM taurine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transferrin* (T)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.07 &#181;M transferrin (T)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome apparatus</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">* Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures

הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית שארגנה ארכיטקטורה, עם נוירונים בשכבות מקולטניות האור, שני מוטות קונוסים במגע עם האפיתל פיגמנט הרשתית בחלק המרוחק ביותר על הרשתית בהתחשב בכיוון של אור, ו תאי הגנגליון במרחק הפרוקסימלי ביותר. ארכיטקטורה זו מאפשרת הבידוד של שכבת קולטי האור על ידי חתך vibratome. הרשתית העצבית גזור של עכבר בגילים 8 ימים היא שטוח משובצת בג&#39;לטין 4% על גבי פרוסה של 20% שכבת photoreceptor ג&#39;לטין פונה כלפי מטה. באמצעות vibratome וסכין גילוח פיפיות, הרשתית הפנימית העבה 100 מיקרומטר מחולקת. חלק זה מכיל את תאי הגנגליון ושכבה הפנימית עם בעיקר תאים דו קוטביים. סעיף מתווך של 15 מיקרומטר הוא מושלך לפני 200 מיקרומטר של הרשתית החיצונית המכילה הקולטניות האור הוא התאושש. ג&#39;לטין הוסר על ידי חימום על 37 מעלות צלזיוס. חתיכות של שכבה חיצונית הן אינקובטוריםטד ב500 μl של הפתרון של רינגר עם 2 יחידות של פפאין הופעל במשך 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס. התגובה הוא נעצר על ידי הוספת 10% בסרום 500 μl עגל עוברי (FCS) בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM), ולאחר מכן 25 יחידות של DNAse אני מוסיפה לפני צנטריפוגה ב RT, שטף כמה פעמים כדי להסיר סרום והתאים resuspended ב 500 μl של DMEM וזורע ב1 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר. התאים גדלים עד 5 ימים במבחנה ויכולת הקיום שלהם הבקיע באמצעות assay חי / מת. טוהר התרבות נקבע תחילה על ידי תצפית מיקרוסקופית במהלך הניסוי. טוהר אומת לאחר מכן על ידי זריעה ותיקון תאים בשקופית היסטולוגית וניתוח באמצעות ארנב polyclonal אנטי-SAG, סמן קולטי אור וחד שבטי עכבר אנטי-RHO, סמן ספציפי קולטי אור מוט. לחלופין, שכבת קולטי האור (מוטות 97%) יכולה לשמש לניתוח ביטוי גנים או חלבונים ולהשתלה.

מלבד השתלה, שכבות קולטי האור גם נעשתה שימוש כדי ללמוד איתות תא על ידי זריעת תאי קולטי אור להכנת תרבויות 12,22. בנוסף, הם משמשים ללמוד ביטוי גנים ו23,24 קצב היממה. יש לנו להשתמש שכבת photoreceptor התא מעכבר wild-type ביום שלאחר הלידה 8 להכין תרבויות קולטי אור בהעדר FCS ומתוחזק התאים במשך 5 ימים ב 37 ° C באינקובטור עם 5% CO 2 (איור 1E ). התאים אז היו קבועים באמצעות paraformadehyde 4% ולאחר מכן המשיכו לניתוח immunocytochemical תוך שימוש בשיטות הניתנות על ידי ספקי הנוגדן חד שבטי או עם עכבר אנטי-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) או ארנב polyclonal אנטי-SAG (1: 200, נדיב מתנה של יגאל גרי ודוד היקס). אנחנו השתמשנו אנטי-RHO ואנטי-SAG (אם כי קונוסים אנטי-SAG תווית ומוטות) בשל העובדה שאנטי SAG הוא סמן מוקדם יותר, מאשר אנטי-RHO. חלקם של cells החיובי לנוגדנים נגד RHO הוא נמוך יותר מאלה חיוביים לנוגדנים אנטי-SAG (איור 2). זה יכול להיות מוסבר על ידי העובדה שSAG, arrestin המוט בא לידי ביטוי גם על ידי קונוסים ההופכים 3% מקולטניים אור בשכבה המבודדת, או לחלופין על ידי העובדה כי במהלך ההתבגרות שלאחר לידה של הרשתית, הביטוי של SAG הקודם ש של RHO 25,26. שכבת קולטי האור שימשה גם כדי לפקח על הביטוי הספציפי של גנים על ידי קולטני אור ברשתית wild-type והמוח של בעלי חיים בגילים 35 ימים RNA הוכן באמצעות ultracentrifugation CsCl 27 והכלאה למערך שבבי DNA עכבר. השליחים לרודופסין (Rho), S-arrestin (סאג) וקונוס-transducin (Gnat2) באים לידי ביטוי באופן ספציפי ברשתית בהשוואה למוח (איור 3 א). הביטוי בולט בשכבת קולטי האור (PR) מאשר בכל הרשתית הכוללתשכבת הרשתית הפנימית מראה כי גנים אלה באים לידי ביטוי על ידי קולטניים אור אכן. לGnat2, הביטוי היחסי בהשוואה לRho וסאג מראה שהוא בא לידי ביטוי על ידי קונוסים הכילו בתוך השכבה המבודדת קולטי האור. הביטוי של recoverin (Rcvrn) בשכבת קולטי האור בהשוואה לכל הרשתית הוא גדל (איור 3). שכבת קולטי האור שימשה גם כדי לפקח על הביטוי של RHO וGNAT2 באמצעות מערבי סופג הבאים שיטות הניתנות על ידי ספקי הנוגדן ולהשוות לשכבה הפנימית של הרשתית (איור 4). שים לב להעדרו של RHO וGNAT2 28, הסמנים של מוטות קונוסים בהתאמה בכל הרשתית וברשתית של עכבר RD1 ביום שלאחר הלידה 35. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig1highres.jpg" /> Fiתרשים 1. מבט סכמטי של חתך vibratome של רשתית עכבר. סעיף (א) התקנה של הרשתית רכוב שטוחה עם קולטי האור פונים כלפי מטה על פרוסת ג&#39;לטין. (B) של הרשתית הפנימית עם להב vibratome. סעיף (C) של הרשתית החיצונית נוסף של ג&#39;לטין. (ד) פיקוח על הנוכחות של קולטי אור בקצה הקטע של רשתית לאחר הבידוד של שכבת קולטי אור. בר סולם המשמש לקרינה ירוקה משמש של מיקרוסקופ אור לבנה. קולטני האור ממוקם בקצה של התמונה. (E) בתרבית תאי קולטי אור (לאחר חמישה ימים). הגדלה גבוהה של הפנל E. (F) <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" width="550" /> איור 2. ביטוי דיפרנציאלי של RHO וSAG בתרבות קולטי אור עכבר. (א) מכתים של גרעינים (כחול), (צביעת SAG (ירוק B)), (צביעת RHO (אדום C)). (ד) מוזגה תמונה. משום ההכתמה של SAG באה לידי ביטוי מוקדם יותר מהכתמת RHO, רק שני תאים כפולים שכותרתו SAG וRHO (ראה *). בר סולם:. 23 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig3highres.jpg" /> איור 3. השוואה של הביטוי של שלושה גנים במוח ורשתית כל וקולטני אור של החיות בר-הסוג בגילים שלושים וחמישה ימים. () Rhodopsin (Rho), S-arrestin (סאג) וקונוס-transducin (Gnat2). (ב) Calbindin (Calb1) וRecoverin (Rcvrn). הנתונים מוצגים כביטוי יחסי. הביטוי היחסי הוא ערך ביטויהמתקבל מנתוני microarray לאחר normaliszation עם התוכנה חזקה Multi-המערך הממוצע (RMA) זמין באתר הידע KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" width="400" /> איור 4. ביטוי של RHO וGNAT2 ברשתית חיצונית מרשתית wild-type ביום 35. היעדרות לאחר לידה הביטוי שלהם ברשתית הפנימית וברשתית של עכבר RD1 ביום שלאחר הלידה 35. ACTB, בטא -actin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <!-- Repeat of the materials table
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> שם חומר / ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td>תגובות / תיאור </td></tr><tr><td> Cytidine 5&#39;-diphosphocholin * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C0256 </td><td> 4.7 מיקרומטר Cytidine 5&#39;-diphosphocholin </td></tr><tr><td> Cytidine 5&#39;-diphosphoethanolamine * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C0456 </td><td> 2.7 מיקרומטר Cytidine 5&#39;-diphosphoethanolamine </td></tr><tr><td> אלבומין חומצה / סרום שור לינולאית (BSA) * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> L8384 </td><td> 100 מיקרוגרם / מיליליטר לינולאית אלבומין חומצה / סרום שור (BSA) </td></tr><tr><td> Triiodo-L-thyronine * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T6397 </td><td> 0.03 מיקרומטר Triiodo-L-thyronine </td></tr><tr><td> צלחת 96-בארות </td><td> גריינר ביו-אחד </td><td> 655-095 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ דו-עינית </td><td> לייקה </td><td> MZ-75 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 עצמאי (CO 2 i) </td><td> החיים Technologies </td><td> 18045054 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 41966029 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים n ° 5 דומון </td><td> בִּיוֹנִי </td><td> 11,254-20 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;לטין מסוג עור porcin </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G2500 </td><td></td></tr><tr><td> GeneChip </td><td> Affymetrix </td><td> U74v2 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון גנטמיצין </td><td> Life Technologies </td><td> 15710049 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrocortison * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> H0888 </td><td> 0.55 מיקרומטר hydrocortison </td></tr><tr><td> * אינסולין (I) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0.86 מיקרומטר אינסולין (I) </td></tr><tr><td> פפאין </td><td> וורטינגטון-Biochem </td><td> WOLS03124 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-D-ליזין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td>P-6407 </td><td></td></tr><tr><td> פרוגסטרון * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P7556 </td><td> 2.0 מיקרומטר פרוגסטרון </td></tr><tr><td> פרוסטגלנדין * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P5172 </td><td> 0.28 מיקרומטר פרוסטגלנדין </td></tr><tr><td> פוטרסין * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P5780 </td><td> פוטרסין 182 מיקרומטר </td></tr><tr><td> האזמל אלביון </td><td> EMS </td><td> 72000 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים </td><td> מוריה </td><td> 15,396-00 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן פירובט * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S8636 </td><td> פירובט נתרן 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> * סלניט נתרן (S) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0.29 מיקרומטר Na 2 SEO 3 (S) </td></tr><tr><td> טאורין * </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T8691 </td><td> 3 טאורין מ&quot;מ </td></tr><tr><td&gt; * Transferrin (T) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0.07 מיקרומטר transferrin (T) </td></tr><tr><td> מנגנון Vibratome </td><td> לייקה </td><td> VT1000-S </td><td></td></tr><tr><td> * תוספי </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1: חומר ספציפי וציוד של שימוש. -&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures at JoVE.com

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

רשתית עצבית של עכבר בגילים 8 ימים היא על גבי בלוק ג&#39;לטין 4%. לאחר הבידוד של שכבת קולטי האור (200 מיקרומטר) על ידי vibratome, הקולטניים האור הם זורעים לאחר ניתוק מכאני והאנזימטית לתרבות. שכבת קולטי האור יכולה לשמש ל, ניתוחים ביוכימיים מולקולריים או השתלה.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

vibratome-sectioning-mouse-retina-to-prepare-photoreceptor-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Views.  UMR_S 968, Institut de la Vision.  רשתית עצבית של עכבר בגילים 8 ימים היא על גבי בלוק ג'לטין 4%. לאחר הבידוד של שכבת קולטי האור (200 מיקרומטר) על ידי vibratome, הקולטניים האור הם זורעים לאחר ניתוק מכאני והאנזימטית לתרבות. שכבת קולטי האור יכולה לשמש ל, ניתוחים ביוכימיים מולקולריים או ...

Video: Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of this cellular mosaic often requires that the organ of Corti is cross-sectioned. In particular, the nonsensory pillar and Deiters' cells, whose nuclei are located basally with respect to the hair cells, cannot be visualized without cross-sectioning the organ of Corti. However, the delicate cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, including the fine cytoplasmic processes of the pillar and Deiters' cells, is difficult to preserve by routine histological procedures such as paraffin and cryo-sectioning, which are compatible with standard immunohistochemical staining techniques.
Here I describe a simple and robust procedure consisting of vibratome sectioning of the cochlea, immunohistochemical staining of these vibratome sections in whole mount, followed by confocal microscopy. This procedure has been used widely for immunhistochemical analysis of multiple organs, including the mouse limb bud, zebrafish gut, liver, pancreas, and heart (see 3-6 for selected examples). In addition, this procedure was sucessful for both imaging and quantitificaton of pillar cell number in mutant and control organs of Corti in both embryos and adult mice 7. This method, however, is currently not widely used to examine the mammalian organ of Corti. The potential for this procedure to both provide enhanced preservation of the fine cytoarchitecture of the adult organ of Corti and allow for quantification of various cell types is described.

A simple procedure of vibratome sectioning the organ of Corti, followed by immunohistochemistry and confocal microscopy is described. This procedure allows for improved preservation of the fine cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, and consequently allows for accurate quantification of cell types.

Vibratome חתך לשימור משופרת של Cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

תרבויות מועשרות חרוט מן הרשתית של עוברי עוף ללמוד מוט כדי חרוט אינטראקציות הסלולר

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are laterally packed in the outermost layer of the retina, the photoreceptor layer, resulting in alignment of analogous subcellular compartments. Traditionally, tangential sectioning of the frozen flat-mounted retina has been used to study the movement and localization of proteins within different rod compartments. However, the high curvature of the rod-dominant mouse retina makes tangential sectioning challenging. Motivated by the study of protein transport between compartments, we developed two peeling methods that reliably isolate the rod outer segment (ROS) and other subcellular compartments for western blots. Our relatively quick and simple techniques deliver enriched and subcellular-specific fractions to quantitatively measure the distribution and redistribution of important photoreceptor proteins in normal rods. Moreover, these isolation techniques can also be easily adapted to isolate and quantitatively investigate the protein composition of other cellular layers within both healthy and degenerating retinae.

This protocol presents two techniques to isolate the subcellular compartments of murine rod photoreceptors for protein analysis. The first method utilizes live retinae and cellulose filter paper to separate rod outer segments, while the second employs lyophilized retinae and adhesive tape to peel away rod inner and outer segment layers.

שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo קריאות פגיעה בכלי דם ברשתית העכבר כדי לקדם את יכולת השחזור

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Mouse Retina Isolation and Flattening

After fixing the enucleated eyeball of the euthanized mouse, transfer it to a glass slide and place it under a dissecting microscope. Using forceps, clamp the margin of the cornea to prevent eyeball movement. With the dissecting scissors, cut around the cornea at a depth of approximately one millimeter through the cornea scleral limbus, and then remove the lens and vitreous body.Holding the optic disc at the center, cut the retina radially along the four quadrants, reaching approximately 2/3 of the retina's radius. Clamp one of the scleral edges using toothed forceps. Hold the sclera edge with untoothed forceps and move from the toothed forceps toward the sclera base.Carefully peel the retina. Wet the retina with 200 microliters of PBS using a pipette. Remove excess PBS using absorbent paper, and flatten the retina with a small bristle brush if needed.Slowly add cold methanol drop-by-drop onto the retina's inner surface until it covers completely. Once the retina turns white and develops increased tenacity, gently flatten the retina and remove impurities, such as residual pigment membranes and the vitreous body, with a small bristle brush. After inverting the retina, treat it with methanol as previously demonstrated, and transfer it into a well of 24 well plate, Soak it in methanol and store it at 20 degrees Celsius for one to two hours for immediate immunostaining.Then rinse the retina with PBS after removing methanol from the plate. The retinol ganglion cells of the retinas before and after methanol treatment were visualized using confocal microscopy, which indicated that the 12 months of methanol preservation did not affect the RGC immunostaining.

בידוד ושיטוח רשתית עכבר

Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

Enucleate the eyes of a euthanized mouse, marking the temporal side for orientation purposes. Remove the anterior chamber. Then remove the lens and vitreous and place eye cups in paraformaldehyde for 30 minutes.Wash eye cups with PBS for 30 minutes. Replacing the solution three times. Then, wash with 0.5%Triton X-100 for 30 minutes.Incubate eye cups in the blocking buffer for two hours at room temperature. After immunostaining, isolate the retinas from the eye cups using a microscope. Divide the retinas into four leaves and flat mount them with the retinal ganglion cell layer facing up.Ensure the mark on the temporal side remains attached for orientation. Cover the retinas with mounting medium. Place cover slips.And seal the slides using nail polish. Turn on the confocal microscope and under Locate mode, find the area of interest using the eye piece. Switch to Acquisition mode and set up tiles to cover the entire retina, along with Z-Stack slices for all layers of information.Image at least 25 tiles across the whole retina to achieve a total volume. Project the Z-Stack slices to generate two-dimensional on-face confocal microscopy images. The composite vis-OCT fibergram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina immunostained with TuJ1 for RGC axons.Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM-2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.