תמיכה כספית מMinistero dell&#39;Istruzione, dell&#39;Universitá דל Ricerca (prin-2009K3RH7N_002) ומלגת מארי קירי תוך אירופית (CYCLOGUO-298555), כמו גם את עלות החסות של פעולת CM0603 ב &#39;רדיקלים חופשיים בביולוגית כימיה ופעולת עלות CM1201 על &quot;כימיה רדיקלית biomimetic&quot; הם יתקבלו בברכה.

<ol>
	<li>Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipidomics+and+the+geometry+of+unsaturated+fatty+acids:+from+biomimetic+models+to+biological+consequences.">Membrane lipidomics and the geometry of unsaturated fatty acids: from biomimetic models to biological consequences.</a> Methods Molecular Biology. 579, 391-412 (2009).</li><li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., Terzidis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+5',8-cyclonucleoside+lesions:+chemistry+and+biology.">Purine 5',8-cyclonucleoside lesions: chemistry and biology.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1368-1382 (2011).</li><li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+reductive+modifications+of+sulfur-containing+amino+acids+within+peptides+and+proteins.">Radiation-induced reductive modifications of sulfur-containing amino acids within peptides and proteins.</a> Journal of Proteomics. 74 (11), 2264-2273 (2011).</li><li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans+lipids:+the+free+radical+path.">Trans lipids: the free radical path.</a> Accounts Chemical Research. 38 (6), 441-448 (2005).</li><li>Melchiorre, M., Torreggiani, A., Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+markers+of+geometrical+radical+stress:+synthesis+of+mono-trans+cholesteryl+esters+isomers+and+detection+in+human+plasma.">Lipid markers of geometrical radical stress: synthesis of mono-trans cholesteryl esters isomers and detection in human plasma.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (38), 15184-15190 (2011).</li><li>Wang, J., Yuan, B., Guerrero, C., Bahde, R., Gupta, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxidative+DNA+Lesions+in+Tissues+of+Long-Evans+Cinnamon+Rats+by+Capillary+High-Performance+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+Stable+Isotope-Dilution+Method.">Quantification of Oxidative DNA Lesions in Tissues of Long-Evans Cinnamon Rats by Capillary High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with Stable Isotope-Dilution Method.</a> Analytical Chemistry. 83 (6), 2201-2209 (2011).</li><li>Boussicault, F., Kaloudis, P., Caminal, C., Mulazzani, Q. G., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+C5'+radicals+of+purine+nucleosides+under+oxidative+conditions.">The fate of C5' radicals of purine nucleosides under oxidative conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (26), 8377-8385 (2008).</li><li>Ferreri, C., Kratzsch, S., Brede, O., Marciniak, B., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans+lipids+formation+induced+by+thiols+in+human+monocytic+leukemia+cells.">Trans lipids formation induced by thiols in human monocytic leukemia cells.</a> Free Radicals Biology &amp; Medicine. 38 (9), 1180-1187 (2005).</li><li>Zambonin, L., Ferreri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+trans+fatty+acids+in+rats+fed+a+trans-free+diet:+a+free+radical-mediated+formation.">Occurrence of trans fatty acids in rats fed a trans-free diet: a free radical-mediated formation.</a> Free Radicals Biology &amp; Medicine. 40 (9), 1549-1556 (2006).</li><li>Puca, A. A., Andrew, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+profile+of+erythrocyte+membranes+as+possible+biomarker+of+longevity.">Fatty acids profile of erythrocyte membranes as possible biomarker of longevity.</a> Rejuvenation Research. 11 (1), 63-72 (2008).</li><li>Belmadoui, N., Boussicault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+formation+of+purine+5',8-cyclonucleosides+in+isolated+and+cellular+DNA:+high+stereospecificity+and+modulating+effect+of+oxygen.">Radiation-induced formation of purine 5',8-cyclonucleosides in isolated and cellular DNA: high stereospecificity and modulating effect of oxygen.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 8 (14), 3211-3219 (2010).</li><li>Chatgilialoglu, C., Bazzanini, R., Jimenez, L. B., Miranda, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(5'S)-+and+(5'R)-5',8-cyclo-2'-deoxyguanosine:+mechanistic+insights+on+the+2'-deoxyguanosin-5'-yl+radical+cyclization.">(5'S)- and (5'R)-5',8-cyclo-2'-deoxyguanosine: mechanistic insights on the 2'-deoxyguanosin-5'-yl radical cyclization.</a> Chemical Research in Toxicology. 20 (12), 1820-1824 (2007).</li><li>Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxidative+DNA+lesions+8,5'-cyclopurines+accumulate+with+aging+in+a+tissue-specific+manner.">The oxidative DNA lesions 8,5'-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner.</a> Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).</li><li>Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fatty+acid-based+functional+lipidomics+in+the+development+of+molecular+diagnostic+tools.">The role of fatty acid-based functional lipidomics in the development of molecular diagnostic tools.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 12 (7), 767-780 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

המרה מתרחשת באופן טבעי חומצות שומן בלתי רוויות גיאומטריים ציס לטראנס איזומרים היא שינוי הקשור בייצור של לחץ קיצוני בסביבה הביולוגית. שומני קרום תא, המכילים חומצות שומן, הם מטרה ביולוגית רלוונטית ללחץ קיצוני ואנחנו הראשונים למדנו isomerization פוספוליפידים ציס טרנס אנדוגני בתרביות תאים, בעלי חיים ובני אדם המעריכים פרוטוקולים אנליטיים בכל מקרה ומקרה. 8-10 הוכחנו כי השינוי הזה יכול להתרחש על ידי מגוון רחב של תרכובות המכילות S, כולל thiols, thioethers וdisulfides, שתחת תנאי לחץ קיצוניים שונים מסוגלים לייצר רדיקלים thiyl, כלומר סוכן isomerizing (איור 3). הדוגמא שהוצגה במאמר זה מתמקד בכיתה של אסטרים cholesteryl, אשר מייצגים חלק ידוע של שומנים בפלזמה, מעורבים לחלוטין במטבוליזם שומנים בדם. הצמדת אסתר בין חומצות שומן וcholesterol הוא biosynthesized ידי ההעברה של חומצות שומן מהעמדה 2 למחצית גליצרול של phosphatidylcholine לכולסטרול, צעד מזורז על ידי אנזים acyl ציטין כולסטרול transferase (LCAT). לכן, אסטרים פלזמת cholesteryl מחוברים לחלוטין עם מחזור שומני קרום, ומכילים פרופורציות גבוהות יחסית של חומצות השומן הרבות בלתי רוויות (PUFA) בדרך כלל בהווה בphosphatidylcholines, כלומר לינולאית והחומצות הארכידונית. היווצרות ליפופרוטאין מעורבת במחל לב וכלי דם וחילוף חומרים. תגובתיות של אסטרים cholesteryl הטבעיים עם רדיקלים חופשיים יכולה להתרחש בקשרים הכפולים של linoleate ושאריות arachidonate, שיכול להיות באיזומרים הגיאומטריים טרנס המקבילים (ראה איור 1 עבור מבנים). אפיון תוכן אסתר cholesteryl טרנס בדגימות ביולוגיות מעניין לפיתוח סמן ביולוגי. המתודולוגיה עקיפה כוללת את הפיכתו של cholesteryאסטרים l מבודד מפלזמה לאסטרים המתאימים חומצות השומן מהתיל (FAME) והפרדה על ידי פרוטוקולי chromatographic גז. במקרה זה, הכיול של את ההפניות הסטנדרטיות של ציס ואסטרים מתיל טרנס חומצת שומן מתבצע, על מנת לאפשר לכמת את תוכן טרנס בדגימות. בהתבסס על המחקרים אנליטיים שבוצעו בספריית אסתר cholesteryl, אנחנו מוצעים להחיל שיטה המבוססת על ספקטרוסקופיית ראמאן, שיכול להתבצע ישירות על שבריר אסתר cholesteryl המבודד מהפלזמה גם ללא derivatization נוסף לתהילה המקבילה (ראה איורים 2 ו 9). ראוי לציין כי עד עכשיו אף אחת משיטות מוצלחות תארה לציס הנפרד ואיזומרים של חומצות שומן טרנס המכילים שומנים על ידי HPLC, כפי שתואר על ידי hydroperoxides במקום אסתר cholesteryl. עד כה, שיטת הכרומטוגרפיה הגז העקיפה היא עדיין השיטה הטובה ביותר הזמינה עד כה. לפי שיטה זו הראשון כמותית evaluation של התוכן מונה טרנס נגזר מאסטרים cholesteryl בודדו מפלזמה של נבדקים בריאים נמסר. באמצעות גלאי יינון להבה (FID) מגבלת קליטה, הן משביעת רצון (ppb) וכמויות nanomolar של התרכובות שזוהו. 5. עם מערכות גילוי שונות ממגבלה זו ניתן אפילו הורידה. ההשפעה של קרינה מייננת על אסטרים cholesteryl היא עניין של מחקרים נוספים, בין אם בתגובה ליניארי מתקבלת ביחס למינון המוחל. כדוגמה שנייה, בחר נוקלאוזידים שונה אשר יכול להיות מיוצר על ידי ניזק של רדיקלים חופשי של DNA. רדיקלים הידרוקסיל (• HO) ידועים כמזיקים ביותר למיני Reactive Oxygen (ROS) ליכולתם לגרום לשינויים כימיים ל-DNA. נגעים בודדים או מרובים עלולים להתרחש על ה-DNA, כי בתאים האיקריוטים ממוקם בגרעין ומיטוכונדריה. זיהוי ומדידה של הסוגים העיקריים של ניזקים שנוצרו חמצונים ל DNA דורשים appropriate ספריות מולקולריות על מנת להגדיר את הפרוטוקולים אנליטיים. אנחנו ממוקדים האינטרס שלנו על הנגעים הקטנים טנדם, שהם purine של 5 ,8-סקל-2-deoxyribonucleosides &#39;, שיש קשר קוולנטי נוסף בין הבסיס ואת moieties הסוכר שנוצר על ידי התקפה של רדיקלים החופשית. התרכובות הן 5 &#39;,8-סקל-2&#39;-deoxyadenosine ו5 &#39;,8-סקל-2&#39;-deoxyguanosine הקיים ב5&#39;R ו5&#39;S צורות diastereomeric (איור 5). הפוטנציאל שלהם להפוך לסמן לחץ רדיקלים חופשי הוא עניין של מחקר בסיסי. 2 ואכן, כאשר ה-DNA חשופה למימן HO • הפשטה קיצונית מעמדת &#39;C5 של הסוכר היא האחד האירועים האפשריים שיגרום להיווצרות נגעי טנדם אלה. Purine 5 &#39;,8-cyclonucleosides ניתן למדוד כסכום של diastereomers ידי HPLC-MS/MS בדגימות γ-DNA מוקרנות מתעכלות enzymatically המשתנה 1-12 נגעים / 10 6 / נוקלאוזידים GY הולך צורת היעדר החמצן לרמה פיזיולוגית של חמצן אנירקמות n, יחס diastereomeric 5&#39;R / 5 של יצור ~ 4 ו ~ 3 עבור 5 &#39;,8-cdAdo ו5&#39; ,8-cdGuo, בהתאמה (איור 11). 11 ראוי לציין כי הקשר בין מינון קרינה ו 5 &#39;,8-cdAdo ו5&#39; נגעים ,8-cdAdo זוהו ב-DNA התאי הם רחוק מלהיות מובן. הניסוי היחיד המבוסס על קרינת 2kGy דיווח בניסוי אינו יכולים להיחשב חד משמעי. ניסויים נוספים מסוג זה 11 ולכמת אנליטי של הארבעה הנגעים הם הכרחיים להגדרת מערכת יחסים כזו. הגילוי של נגעים אלה ואת תמורות חמצונים הפופולריות יותר (כגון 8-אוקסו-2&#39;-deoxyguanosine, 8-oxodGuo) הוא עניין של חקירות אינטנסיביות, המעיד על החשיבות של שני הנגעים במטבוליזם חמצונים. 6,13 שימוש HPLC -MS/MS (המשולש quadrupole) יש מגבלה קרובה ל30fmol זיהוי לכל ארבעת הנגעים. השיפורים אחרונים הם טענו שיגיעו מגבלות זיהוי של רמות attomol ידי produ המכשירcers. על סמך הספרות האחרונה מאוד, 6 נהלים אנליטיים יש לכלול ניקוי הנכון של המדגם וההעשרה על מנת לעמוד במגבלות זיהוי של MS / MS / MS (מלכודת יונים) או של MS / MS (המשולש quadrupole) משמש במקרה שלנו. נהלים סינטטיים ביו השראה של תרכובות 1-4 פותחו החל מנגזרי 8-bromopurine מתחת או photolysis. 7,12 הליכים אלה כרוכים בתגובה קיצונית מפל המחקה את מנגנון הניזק לדנ&quot;א של היווצרות של 5 &#39;,8-cdAdo ו5&#39; נגעים ,8-cdGuo. מנקודת מבט ביולוגי, נמצאו כי נגעים אלו מצטברים עם ההזדקנות באופן ספציפי לרקמות (כבד&gt; כליה&gt; מוח), המספקים ראיות לכך שמנגנוני תיקון DNA אינם מספיקים כדי לשמור על החומר גנטי מנגעים אלה. 13 ואכן, תיקון הכריתה נוקלאוטיד (נר) הוא המסלול רק זיהה כרגע לתיקון של נגעים אלה. 2 2 הכיתהes של תרכובות מוצג באיורי 1 ו 5 אינם זמין מסחרי באותו הרגע, אך על ידי האסטרטגיות הסינתטיות שתוארו בספרות זה לא יהיה קשה להכין תרכובות אלה לשימוש מסחרי. הגישה הרבה התחומית הניתנת על ידי מחקרים בביולוגיה כימית יש לא רק ערך עצום בזיהוי מנגנוני רומן המתרחשים בסביבה הביולוגית, אלא גם נותנת תרומה מהותית לגילוי סמן ביולוגי אבחון וסופו של דבר להביא חידוש בתחום בריאות ואסטרטגיות מניעה 14. תרומה כימית נחוצה לפיתוח מוצלח של רפואה המולקולרית, יצירת פלטפורמות משולבות ופנלים ליצירת פרופילים מטבולים, שצפוי לאפשר לרציונליזציה אופטימלית של עיצוב התערבות, או טיפולית ותזונתית, הקטנה אי ודאות וכישלונות כאשר הם יכולים להיות צפויים.

תגובתיות של רדיקלים חופשיים גילתה החשיבות העצומה שלה לאירועים ביולוגיים רבים, כולל הזדקנות ודלקת. כיום, יותר ויותר ברורים שהבירור של כל שלב כימי המעורבים בתגובתיות זו נדרשת, כדי להבין את המנגנונים ואסטרטגיות לדמיין יעילות לשליטתם של רדיקלים ותיקון של הניזק חינם. התרומה ממחקרים כימיים היא בסיסית, אבל המחקר הישיר בסביבה הביולוגית יכול להיות קשה, שכן החפיפה של תהליכים שונים ומסבכת perturbs בחינת התוצאות והמסקנות בנושא. לכן, האסטרטגיה של דוגמנות תגובות רדיקלים חופשיות הקשורים בתנאים ביולוגיים הפכה צעד מהותי במחקר של מנגנונים כימיים בביולוגיה. בעשור האחרון הקבוצה שלנו פתחה מודלים של תהליכי רדיקלים חופשיים בתנאי biomimetic. בפרט אנו envisaged תמורות ביולוגיות רלוונטיות של חומצות שומן בלתי רוויות, נוקלאוזידים, וחומצות אמינו המכיל גופרית ולשים אותם במסלול כדי להיות מוערך ומאומתים כסמנים ביולוגיים של מצב בריאות. 1-4 הגישה הכללית שלנו מורכבת משלושה מודולים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזה אורגנית, המספקת גישה לביומולקולות שונתה בהתאם. התכנית הסינטתית ניתן גם נועדה על מנת לדמות את התהליכים המתרחשים רדיקלים החופשיים בסביבה הביולוגית, ובכך להחיל תנאים מסוגלים לדמות את התהליך הביולוגי של עניין, שהיא יסוד לכימיה רדיקלית biomimetic. בדגמי biomimetic הבינונית התגובה הוא מים או בינוני הטרוגנית בשל הקיום של תאים הידרופילי והידרופובי. היתרון לעבודה עם מודלי biomimetic הוא שיש סביבה פשוטה עם שותפי תגובה ידועה, שבו ניתן לבחון תגובתיות ומוצרים בפרטים נוספים, אולי גילוימסלולים כימיים חדשניים. משלב זה מידע מכניסטי והקינטית יכול להיות שנאסף; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור, ניתוח ואפיון של מוצרים, ומספק מידע מבני וכימי של ביומולקולות שונתה על מנת לארגן ספריות מולקולריות ולהקל recognition.in הסביבה הביולוגית המורכבת יותר. פרוטוקולים מבוססים גם על רקע פתרון תערובות מורכבות של תרכובות כגון אלה נגזרים מדגימות ביולוגיות; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח סמן ביולוגי באמצעות דגימות ביולוגיות, שנגזרו גם על ידי בניסויים במבחנה באמצעות תרביות תאים, במחקרי vivo מחיות ובני אדם. הפרוטוקולים שפותחו במודלי biomimetic מוחלים על הניתוח המורכב של דגימות, לדמיין את התמורות הרדיקליות החופשיות בתנאים שונים. ספריות מולקולריות פותחו על ידי סינתזה הן לעזר עצום לתגליות בתחום מדעי חיים. המידע שנאסף על תמורות גבעת רדיקלים החופשיותדואר ההזדמנות לגלות את אסטרטגיות תיקון ומניעה. מאגרי מידע של התוצאות יכולים לשמש להערכה זהירה על ידי ניתוח רב משתנה של משמעות הסמן הביולוגי, כמו גם גורמים הקשורים אפשרי. </li></ul> אנחנו בחרנו בשני סוגים של סמנים ביולוגיים רלוונטיים להסמכת גישה זו: אסתרים purine 5 &#39;,8-סקל-2-deoxyribonucleosides cholesteryl&#39;.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>MATERIALS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl linoleate &ge;98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0289-100 mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl arachidonate&ge;95% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C8753-25mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-mercaptoethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M6250-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-propanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34965-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Methanol 215 SpS </td>
 <td>Romil</td>
 <td> H409-2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>02860-2.5L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Chloroform SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H135 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> n-Hexane 95% SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td> H389 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetonitrile 230 SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H047 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Dichloromethane SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H2022,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Carbon tetrachloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>107344-1L </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Diethyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td> 309966-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S7653-5KG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaOH solid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221465-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NH4OH sol. 28%-30%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221228-1L-A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320099-500ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221759-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Molybdate tetrahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A7302-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sulfuric Acid 95%-98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320501-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Silver Nitrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>209139-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium sulfate anhydrous</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>238597-500G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nuclease P-I from penicillium citrinum</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N8630-1VL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase II type I-sa </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P9041-10UN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E114-25MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphatase alkaline type VII-t from*bov</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P6774-1KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase I type VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P3134-100MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonuclease II type IV from*porcin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D4138-20KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Trizma(r) base, biotechnology performanc ce</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T6066-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1644-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Succinic acid bioxtra</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3674-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Calcium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5670-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Formic acid, 98 %</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>06440-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC500324</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyguanosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3290-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyadenosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3300-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3899-CA-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3895-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nitrous oxide (N2O) </td>
 <td>Air Liquide </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonucleic acid from calf thymus</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D4522-5MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60Co-Gammacell</td>
 <td>AECL- Canada </td>
 <td>220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immersion well reaction medium pressure 125 watts </td>
 <td>Photochemical reactors ltd</td>
 <td>Model 3010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Evaporating flask 250 ml</td>
 <td>Heidolph</td>
 <td>P/N NS 29/32 514-72000-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luna 5 &mu;m C18(2) 100 &Aring;, LC Column 250 x 4.6 mm </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>00A-4252-E0 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 &mu;m</td>
 <td>Grace</td>
 <td>88081</td>
 <td>Semipreparative</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SecurityGuard Kit</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>KJ0-4282</td>
 <td>Analytical holder kit and accessories</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Holder for 10.0 mm ID cartridges</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7220</td>
 <td>Semipreparative holder </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10.0 mm ID cartridges </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7221 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-performance liquid chromatography (HPLC) </td>
 <td>Agilent</td>
 <td>1100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LC/MS/MS </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4000QTRAP System</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tandem mass ESI spectrometer </td>
 <td>(Bruker Daltonics) </td>
 <td>Esquire 3000 plus </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 2-4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27517</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
</table>

free radicals in chemical biology: from chemical behavior to biomarker development

מעורבותם של רדיקלים חופשיים בתחום מדעי החיים גדלה באופן קבוע עם זמן וכבר מחוברת למספר תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים. נושא זה חובק תחומים מדעיים מגוונים, המשתרע מכימיה פיסיקלית, ביולוגית וביו לביולוגיה ורפואה, עם יישומים לשיפור של איכות חיים, בריאות והזדקנות. מיומנויות רבות תחומיות הנדרשות לחקירה המלאה של היבטים הרבים של תהליכים קיצוניים בסביבה הכימית והביולוגית ידע ממלא תפקיד מכריע בחשיפת תהליכים ומנגנונים בסיסיים. פתחנו גישת ביולוגיה כימית מסוגלת להתחבר תגובה הכימית של רדיקלים חופשיה בתהליכים ביולוגיים, המספק מידע על המסלולים ומוצרים מכניסטית. הליבה של גישה זו היא העיצוב של דגמי biomimetic כדי ללמוד את התנהגות biomolecule (שומנים, חומצות גרעין וחלבונים) במערכות מימיות, קבלת תובנה של התגובה, כמו גם מסלוליםשל בניית ספריות מולקולריות של תוצרי התגובה של רדיקלים החופשיים. קשר זה יכול לשמש בהצלחה לגילוי סמן ביולוגי ודוגמאות מסופקות עם שני סוגים של תרכובות: איזומרים מונה טרנס של אסטרים cholesteryl, המסונתזים ומשמשים כהפניות לגילוי בפלזמה אנושית, וpurine 5 &#39;,8-סקל-2 &#39;-Deoxyribonucleosides, הכין ומשמש כהתייחסות בפרוטוקול לגילוי של נגעים כאלה בדגימות DNA, לאחר קרינה מייננת או מתקבלים ממצבים בריאותיים שונים.

תהליך isomerization תואר במיוחד עבור אסטרים cholesteryl העניקו לאיזומרים מונה טרנס של ינולאית והחומצות הארכידונית שמוצגים באיור 1 כמוצרים הראשונים של התקפה זו, שיכולה להתרחש בתנאים של לחץ של רדיקלים חופשיים בסביבה הביולוגית. 5 באיור 3 המנגנון הכימי המעורבים בisomerization הקשר הכפול ציס טרנס מוצג. המקור הקיצוני מצוין בדרך הגנרית להרשות רדיקלים S ממוקדים. בפרוטוקולים שתוארו המקור הקיצוני הוא אור UV כי הוא מסוגל לשבור את הקשר הנוכחי SH בRSH המולקולה thiol homolitically. איור 4 מסכם 3 פרוטוקול צעדים לסינתזה של המעמד השונים שומנים וזיהוי שלהם בפלזמה אנושית: הסינתזה מייצגת תהליך של רדיקלים חופשי biomimetic וגם מספקת כניסה נוחה אחד בסיר לgeometאיזומרים rical, ללא כל זיהום על ידי איזומרים positional אחרי פרוטוקולי טיהור ובידוד. מתודולוגיות אנליטיות כמה ניתן ליישם לגילוי רגישות גבוה של תוכן טרנס האיזומר והאפיון של ספריית אסתר cholesteryl מונה טראנס. בפרט, ספקטרוסקופיית ראמאן יכולה להתבצע ישירות על שבריר אסתר cholesteryl ללא derivatization (ראה איור 2 ואיור 9). Purine 2 דוגמא החששות 5 &#39;,8-סקל-2-deoxyribonucleosides&#39;, אשר הם נגעי DNA שנוצרו על ידי ההתקפה של רדיקלים חופשיים לעמדת C5 &#39;של מחצית הסוכר וההיווצרות הבאה של קשר קוולנטי בין הסוכר והבסיס moieties. ארבעה מבנים יכולים להיות מיוצר, כלומר, 5 &#39;,8-סקל-2&#39;-deoxyadenosine ו5 &#39;,8-סקל-2&#39;-deoxyguanosine, שניהם קיימים ב5&#39;R ו5&#39;S צורות diastereomeric (איור 5). באיור 6 tהוא מנגנון תגובה מוצג שכרוך photolysis של נגזרים 8-bromopurine 5 לתת לC8 המקביל 6 רדיקליים, הintramolecularly תקצירי אטום מימן מהעמדה &#39;C5 סלקטיבי ונותן 7 הרדיקליים 2&#39;-deoxyadenosin-5&#39;-י.ל.. 7 רדיקליים עובר cyclization עם קצב קבוע בטווח 10 5 -10 6 של -1, 2 ואחרי החמצון של 8 הרדיקליים heteroaromatic לתת את המוצרים הסופיים 9. התגובה של רדיקלים הידרוקסיל, שנוצרה על ידי radiolysis של מים, עם 2&#39;-deoxyadenosine ו2&#39;-deoxyguanosine (10) נמצאה להתרחש CA. 10% על ידי הפשטת מימן מעמדת C5. 7 הגישה שלנו לביולוגיה הכימית הספריות של purine 5 &#39;,8-סקל-2-deoxyribonucleosides&#39; (כולל תרכובות כותרת) מודגמת באיור 7, עם זיהוי של נגעים אלה בoligonucleotides כמו גם בדגימות DNA שהתקבלו מva<html> מקורות rious כמו, למשל, טופלו בתנאי קרינה מייננת, כמו לחקות מצבי לחץ קיצוניים. באיור 8 ציוד photoreactor טיפוסי מוצג. המכשיר מאפשר להקרנה של תרכובות המומסות בממס מתאים. הוא מורכב מ: i) תגובת החדר מצויד בכניסה לגז אינרטי (בתחתית) ושני פתחי כניסה ליציאת גז ובנוסף ריאגנטים; השני) תא פנימי המכיל את מנורת הכספית המתאימה מחובר למערכת קירור וחשמל, אשר מוכנס לתוך תגובת החדר באמצעות משותף זכוכית. <img alt="איור 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1.jpg" /> איור 1. איזומרים מונה טרנס של linoleate וarachidonate cholesteryl. r.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2.jpg" /> איור 2. אסטרים cholesteryl בניתוח סרום והישיר של אדם לאיזומרים טראנס מונה על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3.jpg" /> איור 3. התהליך בנוסף, החיסול שמוביל לisomerization ציס טרנס של קשרים כפולים על ידי רדיקלים thiyl. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. שלושה שלבים לפיתוח פרוטוקול של אסטרים מונה טרנס cholesteryl כסמן ללחץ של רדיקלים חופשיים. <img alt="איור 5" fo:content-width="6.5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5.jpg&quot; /&gt; איור 5. 4 purine 5 &#39;,8-סקל-2&#39; diastereoisomers-deoxyribonucleoside. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6.jpg" /> איור 6. דור של C5 &#39;רדיקלים, או על ידי photolysis של 5 או מתגובה של 10 עם HO רדיקלים •, והמנגנון של purine 5&#39; ,8-סקל-2 &#39;היווצרות deoxyribonucleoside. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig6large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig7.jpg" alt="איור 7" /> איור 7. פרוטוקול ואו זיהוי של כמה נגעי DNA הרדיקליים מבוססים; mtDNA: הדנ&quot;א המיטוכונדרי, nDNA: DNA הגרעיני. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig8.jpg" alt="איור 8" /> איור 8. כור פוטו. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig9.jpg" alt="איור 9" /> איור 9. ספקטרום ראמאן נציג של פלזמת cholesteryl אסתר. בהבלעת ההשוואה של אזור מסוים עם cholesteryl linoleate וcholesteryl איזומרים חומצה לינולאית מונה טרנס. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig10.jpg" alt="איור 10" /> איור 10. ניתוח נציג GC תהילה מתקבל מאסטרים פלזמת cholesteryl. <img alt="איור 11" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11.jpg" /> &lt;חזק&gt; איור 11. הנציג HPLC להפעיל מכיל 2&#39;-deoxyadenosine ו2&#39;deoxyguanosine יחד עם החמצונים וpurine 5 &#39;,8-סקל-2&#39; נוקלאוזידים-deoxyribo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig11large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development at JoVE.com

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

כימית biomimetic הרדיקלי מבוססת הוחלה ספריות בניין עד נחוצות לפיתוח סמן ביולוגי.

רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

free-radicals-chemical-biology-from-chemical-behavior-to-biomarker

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Organic Chemistry

Unit 1

Radical Chemistry

Alkene Structure and Reactivity

SCIENTISTS IN ACTION

20.1K Views.  Consiglio Nazionale delle Ricerche. כימית biomimetic הרדיקלי מבוססת הוחלה ספריות בניין עד נחוצות לפיתוח סמן ביולוגי.

Video: Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high surface area microporous materials, such as metal-organic frameworks (MOFs), unique challenges present themselves for PECVD treatments. Herein the protocol for development of a MOF that was previously unstable to humid conditions is presented. The protocol describes the synthesis of Cu-BTC (also known as HKUST-1), the treatment of Cu-BTC with PECVD of perfluoroalkanes, the aging of materials under humid conditions, and the subsequent ammonia microbreakthrough experiments on milligram quantities of microporous materials. Cu-BTC has an extremely high surface area (~1,800 m2/g) when compared to most materials or surfaces that have been previously treated by PECVD methods. Parameters such as chamber pressure and treatment time are extremely important to ensure the perfluoroalkane plasma penetrates to and reacts with the inner MOF surfaces. Furthermore, the protocol for ammonia microbreakthrough experiments set forth here can be utilized for a variety of test gases and microporous materials.

Herein the procedures for plasma enhanced chemical vapor deposition of perfluoroalkanes on microporous materials such as metal-organic frameworks to enhance their stability and hydrophobicity are described. Furthermore, breakthrough testing of milligram quantities of samples is described in detail.

הכנת מסגרות מתכת אורגנית הידרופובי באמצעות פלזמה משופרת שיקוע הכימי של Perfluoroalkanes להסרת אמוניה

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

גישה הפוכה ניתוח לאפיון כימי תחבורה בצבעים

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is a major effort to target PPIs in basic research and in the pharmaceutical industry. Protein-protein interfaces are usually large, flat, and often lack pockets, complicating the discovery of small molecules that target such sites. Alternative targeting approaches using antibodies have limitations due to poor oral bioavailability, low cell-permeability, and production inefficiency.
Using peptides to target PPI interfaces has several advantages. Peptides have higher conformational flexibility, increased selectivity, and are generally inexpensive. However, peptides have their own limitations including poor stability and inefficiency crossing cell membranes. To overcome such limitations, peptide cyclization can be performed. Cyclization has been demonstrated to improve peptide selectivity, metabolic stability, and bioavailability. However, predicting the bioactive conformation of a cyclic peptide is not trivial. To overcome this challenge, one attractive approach it to screen a focused library to screen in which all backbone cyclic peptides have the same primary sequence, but differ in parameters that influence their conformation, such as ring size and position.
We describe a detailed protocol for synthesizing a library of backbone cyclic peptides targeting specific parasite PPIs. Using a rational design approach, we developed peptides derived from the scaffold protein Leishmania receptor for activated C-kinase (LACK). We hypothesized that sequences in LACK that are conserved in parasites, but not in the mammalian host homolog, may represent interaction sites for proteins that are critical for the parasites&#39; viability. The cyclic peptides were synthesized using microwave irradiation to reduce reaction times and increase efficiency. Developing a library of backbone cyclic peptides with different ring sizes facilitates a systematic screen for the most biological active conformation. This method provides a general, fast, and facile way to synthesize cyclic peptides.

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid crystals (ILCs). Taking advantages of the high specificity of XB for haloperfluorocarbons and the ability of anions to act as XB-acceptors, we obtained supramolecular complexes based on 1-alkyl-3-methylimidazolium iodides and iodoperfluorocarbons, overcoming the well-known immiscibility between hydrocarbons (HCs) and perfluorocarbons (PFCs). The high directionality of the XB combined with the fluorophobic effect, allowed us to obtain enantiotropic liquid crystals where a rigid, non-aromatic, XB supramolecular anion acts as mesogenic core.
X-ray structure analysis of the complex between 1-ethyl-3-methylimidazolium iodide and iodoperfluorooctane showed the presence of a layered structure, which is a manifestation of the well-known tendency to segregation of perfluoroalkyl chains. This is consistent with the observation of smectic mesophases. Moreover, all the reported complexes melt below 100 &#176;C, and most are mesomorphic even at room temperature, despite that the starting materials were non-mesomorphic in nature.
The supramolecular strategy reported here provides new design principles for mesogen design allowing a totally new class of functional materials.

A protocol for the synthesis of a new type of mesogens, based on the halogen-bonded supramolecular anion [CnF2n+1-I&#183;&#183;&#183;I&#183;&#183;&#183;I-CnF2n+1]&#8722;, is reported.

ממולקולות חומרים: הנדסה בגבישים נוזליים יוניים חדש דרך הלוגן מליטה

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is prepared by mixing solutions of glycol chitosan with a synthesized benzaldehyde terminated polymer gelator, and hydrogels are efficiently obtained in several minutes at room temperature. By varying ratios between glycol chitosan, polymer gelator, and water contents, versatile hydrogels with different gelation times and stiffness are obtained. When damaged, the hydrogel can recover its appearances and modulus, due to the reversibility of the dynamic imine bonds as crosslinkages. This self-healable property enables the hydrogel to be injectable since it can be self-healed from squeezed pieces to an integral bulk hydrogel after the injection process. The hydrogel is also multi-responsive to many bio-active stimuli due to different equilibration statuses of the dynamic imine bonds. This hydrogel was confirmed as bio-compatible, and L929 mouse fibroblast cells were embedded following standard procedures and the cell proliferation was easily assessed by a 3D cell cultivation process. The hydrogel can offer an adjustable platform for different research where a physiological mimic of a 3D environment for cells is profited. Along with its multi-responsive, self-healable, and injectable properties, the hydrogels can potentially be applied as multiple carriers for drugs and cells in future bio-medical applications.

Here we describe a facile preparation of chitosan-based injectable hydrogels using dynamic imine chemistry. Methods to adjust the hydrogel&#8217;s mechanical strength and its application in 3D cell culture are presented.

הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

One-pot Microwave-assisted Conversion of Anomeric Nitrate-esters to Trichloroacetimidates

The goal of the following procedure is to provide a demonstration of the one-pot conversion of a 2-azido-1-nitrate-ester to a trichloroacetimidate glycosyl donor. Following azido-nitration of a glycal, the product 2-azido-1-nitrate ester can be hydrolyzed under microwave-assisted irradiation. This transformation is usually achieved using strongly nucleophilic reagents and extended reaction times. Microwave irradiation induces hydrolysis, in the absence of reagents, with short reaction times. Following denitration, the intermediate anomeric alcohol is converted, in the same pot, to the corresponding 2-azido-1-trichloroacetimidate.

A 2-azido-1-nitrate-ester can be converted to the corresponding 2-azido-1-trichloroacetimidate in a one-pot procedure. The goal of the manuscript is to demonstrate utility of the microwave reactor in carbohydrate synthesis.

סיר אחד בסיוע מיקרוגל ההמרה של חנקת Anomeric-אסטרים Trichloroacetimidates

The goal of the following procedure is to provide a demonstration of the one-pot conversion of a 2-azido-1-nitrate-ester to a trichloroacetimidate ...

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

בניית Thioether/ויניל גופרתי-קשורה Hydrothiolation תיול-ene/yne הנוצרות על-ידי פפטידים הסליל באמצעות צילום

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-המבוסס על סינתזת החלבון ללא תא: פרוטוקולים עבור טכנולוגיית פלטפורמה חזקים, גמישים ונגישים

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...