저자는 기술의 CRYO-형광 샘플 단계, 중국 과학 기술 대학의 Changlu 어르신과 쳉 쑤의 건설 트래비스 휠러 및 세포 생물학의학과 기계 공장 및 생리학, 피츠버그 대학교에 감사드립니다 안내, 원고의 중요한 읽기 박사 테레사 Brosenitsch. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (GM082251 &amp; GM085043)에 의해 지원되었다.

1. 탄소 코팅에 헬라 세포 배양, 골드 EM 찾기 그리드 <ol><li> 글로우 방전 25 초 25mA 이하 200 메쉬 R2 / 2 Quantifoil 금 EM 찾기 그리드의 탄소 쪽. </li><li> 코트 50 ㎍ / ㎖의 fibronectin의 용액 40 μL 비말로, 아래로, 탄소 측을 떠하여 피브로넥틴과 EM 그리드, 다음, 조직 문화 후드에서 2 시간 동안 UV 빛의 밑에 그것을 소독. </li><li> 판 헬라 유리 바닥 문화 접시에 2 × 10 4 세포 / ㎖ (총 2 ㎖ 문화)의 밀도 그리드 위에 세포 DMEM에서 5 % CO 2, 37 ° C에서 세포 성장을 4.5로 보충 약 18 시간 동안 G / L L-글루타민과 포도당, 10 % 열 - 불 활성화 된 송아지 태아 혈청, 100 단위 / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신. 헬라 세포는 O / N 문화 이후에 감염됩니다. </li></ol> 2. HIV-1 감염과 라이브 셀 이미징 <ol><li> 유리 바닥 문화에 형광 세포 추적기 (레드 CMTPX, 1 μL / 2 ㎖)를 추가접시 (단계 1.3)와 형광 염료의 최대 걸릴 수 있도록, 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> PBS로 세포를 세척하고 50 μL 사전 예열 신선한 매체를 추가합니다. </li><li> 37 ° C, 스윕 필드 공 촛점 스캐너 현미경에서 라이브 셀 챔버에 접시를 놓습니다. 그들은 cryoEM 이후 대부분의 스프레드 아웃과 평면 (그림 2C와 2D 참조) 때 상대적으로 얇은 영역을 필요로 두 개의 유사 분열 단계 사이의 세포와 1-3 셀 / 사각형이 포함 된 여러 필드 (10-15 위치)을 선택 샘플. 미래 영상 (단계 2.5)에 대한이 위치를 저장합니다. </li><li> (우리는 P24의 40 NG / ML을 포함하는 시료 40 μl를 사용) GFP-VPR을 포함 VSV-G 의사 입력 된 HIV-1 입자로 세포를 감염. 영상의 위치가 이미 선택되어 저장 되었기 때문에 접시의 바닥에 바이러스 입자를 추가 할 때, EM 그리드를 방해하지 않도록주의해야합니다. </li><li> 바로 비리의 추가 후, TI 수집20 ~ 40 분 이전에 선택한 위치에서 고속 3D 공 촛점 이미지를 (단계 2.3) 나 경과. </li><li> 공 촛점 이미지는 MetaMorph를 사용하여 인수 Imaris 소프트웨어 (그림 1 참조)를 사용하여 단일 입자 역학에 대한 자동화 된 3D 입자 추적하여 분석 하였다. 우리는 회절의 동적 동작을 상호 연관되어 있기 때문에 HIV-1 세포의 미세 구조, 시간 경과 라이브 세포 이미징 및 3D 입자 추적을 가진 입자는 결과에 매우 중요합니다. 그러나 큰 정적 구조, 간단한 형광 이미지 (살아있는 세포없이) 상관 관계 분석에 충분할 것입니다. </li></ol> 3. 냉동 수화 EM 샘플 준비 마지막으로 공 촛점 이미지와 샘플 극저온 고정 모음 사이의 시간 지연을 최소화하기 위해, FEI Vitrobot (또는 다른 유리화 장치) 형광 공 촛점 라이브 셀 이미지를 수집하는 동안 시작과 플 런지 냉동 준비를해야합니다.<ol><li> 유리화 장치의 전원을 켜고 22의 기후 온도를 설정 ° C, 100 %로 목표 습도, 7 초에 더럽히는 시간 및 대기를하고 1 초 시간을 드레인. </li><li> 플런저 듀어에 그리드 스토리지 박스를 배치하고 차가운 액체 에탄을 준비합니다. 유리화 장치에 듀​​어를 탑재합니다. </li><li> 즉시 공 촛점 라이브 세포 이미징 (2 절) 후 얼음 냉각 구리 블록에 배양 접시를 놓고 cryoEM 샘플 준비 방에 전송할 수 있습니다. 전문 핀셋에 EM 그리드를로드하고 빠르게 그리드에서 모든 미디어를 멀리 얼룩. 모래 바닥은 0.2 μm의 형광등 마이크로 즉시 격자에 배치와 함께 15 나노 골드 비드 솔루션의 4 μL를 혼합 한 후, 여과지, 수동으로 이루어집니다. 골드 비즈는 단층 데이터 수집 및 정렬을 돕기 위해 기준점 마커로 사용됩니다. 형광 마이크로는 (그림 2C-2F 참조) 형광등 cryoEM 이미지 사이의 상관 관계를 원조하는 데 사용됩니다. </li><li> 유리화 장치에 핀셋을 넣고 액체 에탄 16 동결을 몰아 내고 빠지게 할 장치를 지시합니다. 최상의 결과를 달성하기 위해 최적화 된 더럽히는 매개 변수는 다음과 같습니다 오점 시간, 7 초, 오점 오프셋 0, 배출 시간, 1 초, 온도 22 ° C, 습도 100 %. </li><li> 나중에 사용하기 위해 즉시 cryoET 이미징을위한 cryoEM 홀더, 또는 액체 질소 저장 듀어에 냉동 수화 격자를 전송합니다. </li></ol> 4. CRYO-형광 광학 현미경 홈 내장, 극저온 형광 샘플 챔버 및 단계 시스템 (그림 3) 단계 4.1-4.10를 수행해야합니다. 단계의 자세한 사양과 설명은 6월 등. 15에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 적어도 2 시간내는 형광 빛 현미경 (그림 3A 참조) 시작하기 전에 액체 질소로 자기 가압 액체 질소 듀어를 입력합니다. </li><li> homebuilt CRYO-F를 탑재이러한 올림푸스 IX 71로 거꾸로 형광 광학 현미경, 위에 luorescence 샘플 스테이지 15 (그림 3). </li><li> 자기 가압 듀어에 극저온 샘플 단계의 액체 질소 주입구를 연결하고 적절한 용기에 액체 질소 오버 플로우 방지 콘센트를 배치합니다. 렌즈가 온난하고 서리 무료로 유지하는 대물 렌즈 위에 배치 슬리브 건조 질소 가스 라인을 연결합니다. </li><li> 냉동 수화 샘플 그리드를로드 CRYO 단계 챔버 구리 블록 플랫폼 (그림 3B에서 검은 색 화살표)를 놓습니다. 냉각 및 자기 가압 충전 듀어에서 유입 라인을 통해 액체 질소 극저온 단계의 구리 챔버를 입력합니다. </li><li> 극저온 단계는 액체 질소 온도 (~ 4-6 분)에 도달하면, 극저온 단계로 그리드 스토리지 상자 (단계 3.5에서) 전송합니다. </li><li> 구리 블록 EM 표본 카트리지에 냉동 수화 샘플 격자를 놓고 G 클립C-링을 사용하여 장소를 제거하거나 상단에 미리 냉각 구리 반지 (그림 3D 블랙 화살촉)를 배치 격자의 쉬운 검색을 위해 또한 장소에 그리드를 유지하기 위해 한 후 (Polara 현미경 카트리지를 사용하는 경우) CRYO-형광 이미징 (비 Polara cryo - 전자 현미경을위한 경우). </li><li> CRYO 단계 (그림 3B 흰색 화살촉)의 내부 챔버에서 카트리지를 (단계 4.6)에 놓습니다. </li><li> 검색하고 살아있는 세포 이미징 데이터에서 동일한 바이러스 입자를 찾을 수 있습니다. EM 격자 인덱스를 가지고 있기 때문에 살아있는 세포 이미지와 CRYO-형광 이미지를 모두 그리드에 동일한 입자를 지역화하는 간단합니다. </li><li> 긴 작동 (2.7-4 mm) 대물 렌즈와 광학 현미경을 사용하여 극저온 조건에서 식별 된 위치에 CRYO-DIC와 GFP 이미지를 획득. CRYO-형광 이미징 동안 주기적으로, 극저온 무대와 리필을에서 액체 질소 레벨을 점검 필요, -170 아래의 샘플 단계를 유지하기 위해° C. </li><li> CRYO-형광 이미징이 완료되면, 조심스럽게 구리 블록 플랫폼 표본 카트리지를 반환하고 Polara 시스템과 미래 cryoET 분석을 위해 액체 질소 듀어에 카트리지를 보관하십시오. 비 Polara cryo - 전자 현미경을 사용하는 경우, 구리 반지를 제거 샘플 격자를 검색, 그리드 스토리지 박스에 배치하고, 시편 cryoET에 의해 검사 될 때까지 액체 질소 듀어의 표본을 저장합니다. </li><li> 데이터 분석의 경우, 인수 CRYO-DIC와 GFP 이미지를 오버랩 (단계 4.9에서 그림 4b 참조) 라이브 세포 이미징 시리즈에서 얻은 사람들과 극저온 형광 이미지 GFP 신호의 위치를 연관. </li></ol> 5. cryo - 전자 단층 촬영 <ol><li> 이러한 Polara G2 현미경으로 전계 방출 총을 탑재 전자 현미경의 극저온 전송 스테이션에 샘플 카트리지를로드합니다. </li><li> 140X, IDE의 배율에 따라 저용량 - 검색 모드ntify 및 스테이지 파일에 연결된 그리드 사각형 (단계 4.11부터) 저장합니다. </li><li> 3,500 X의 배율 낮은 복용량 검색 모드에서, 100 μm의 목표 조리개 검색을 삽입하고 두 번째 단계의 파일에 GFP 신호와 상관 관계가있는 모든 위치를 저장합니다. </li><li> 중요하지 않은 탄소 영역에서 얼음을 떨어져 연소, 무대 Y 기능을 사용하여, / 2과 경사 축 수정 - 저용량 노출 모드에서, 1 또는 2 E의 복용량에 빔 강도를 조정하는 빈 영역을 찾아 여러 개의 금 구슬. </li><li> 저용량 초점 모드에서, 2 ~ 3 μm의 초점 거리를 조정하고 경사 축에 평행 초점의 방향을 정렬 각도를 조정합니다. </li><li> 저용량 - 검색 모드에서 (단계 5.3에서) 저장 위치를​​ 기억, 표본 eucentric 높이를 조정하고 관심 영역의 기울기 범위를 확인합니다. 박람회에 8 ~ 10 ㎛ defocus 조명에서 - 매우 낮은 전자 선량 (/ 2 ~ 1 E)와 투사 이미지를 획득cryo - 전자 단층 촬영을 위해 상호 바이러스 입자를 확인하기 위해 우레 모드. </li><li> 저용량 초점 모드로 전환합니다. TEM 자동 기능 메뉴에서 자동 eucentric 높이를 앞에하고 초점 영역에 기능을 집중한다. </li><li> 틸트 시리즈를 구입하는 매개 변수를 설정합니다. / 2 총 용량 - 본 논문에서는 그림 4, 틸트 각도는 각각 3 °, 2 ° 경사 단위에서, °, 아래 이상 45 ° ± 70 범위는 6 μM이 초점 흐림 약 70 E와 함께 사용되었다. </li><li> 모든 저장 위치에 대한 단계 5.7 및 5.8를 반복합니다. 배치 단층 촬영 소프트웨어는 처리량을 증가하기 위해 여러 위치에서 자동 데이터 수집에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 6. IMOD 17을 사용하여 입체적으로 재구성 <ol><li> 최소 및 최대 밀도 값을 조정하고 큰 이미지의 변화로 인해 제외 할 모든보기가 있는지 확인하기 위해 원시 경사 시리즈를 검사합니다. </li><li> eTomo 및 축 유형, 픽셀 크기, 기준점 직경 등을 사용하여 설치 단층 촬영 패널을 시작합니다. com을 스크립트를 만들 수 있습니다. </li><li> 단층 계산의 여러 단계를 조정 / 동시에 따라야 할 수 있도록 메인 화면을 구성합니다. 필요한 매개 변수를 수정하고 각 처리 단계 (eTomo 자습서를 참조하여 필요한 특정 프로그램을 실행 <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> 최종 단계에서 전체 정렬 된 스택을 만들 (0.6 미만의 평균 잔차)와 IMOD에서 가중 다시 프로젝션 알고리즘을 사용하여 tomograms을 재구성. </li><li> 명암과 선명도를 향상시키기 위해 적절한 매개 변수와 함께 IMOD에서 구현 된 3D 비선형 이방성 확산 가장자리 향상 프로그램을 사용하여 잠재적 인 이해의 영역을 워터 마크. </li></ol>

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	<li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cells+at+the+nanoscale.">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li><li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry.">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li><li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes.">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li><li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages.">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy.">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84 (2009).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li><li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li><li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells.">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li><li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 cryoET 다음 시간 경과 공 촛점 라이브 세포 형광 이미징을 사용하여 동적 세포 이벤트를 분석하는 고급 상호 접근 방식을 제공하는 프로토콜의 간단한 세트를 발표했다. 고해상도 cryoET와 3D 라이브 세포 이미징의 상관 관계를하는 우리의 방법론 개발은 숙주 세포로 희귀, 동적 (앞에서 정적보고되지 않은) 및 회절 바이러스 입자와의 상호 작용을 시각화 많은 도전 생물학적 문제를 조사하는...

cryo - 전자 단층 촬영 (cryoET)는 세포와 조직의 3 차원 (3D) 시각화를 허용하고 근접에 생리 상태 1 분자 해상도에서 기본 세포 소기관 및 세포 구조의 조직에 대한 통찰력을 제공하는 강력한 이미징 기술입니다. 그러나, 그들의 방사선 민감도와 결합 흠 냉동 수화 시편의 본질적 낮은 콘트라스트가 어려운 세포 내부 관심 분야를 찾아 연속적으로 대상 영역을 손상시키지 않고 성공적으로 기울기 시리즈를 수행 할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 빛과 전자 현미경을 결합하여 상호 접근 방식이 필요합니다. 형광 라벨에 의해 강조 특정 기능을 식별 및 형광 광학 현미경에 의해 위치, 그리고 자신의 좌표는 고해상도 3D 구조의 데이터 수집을위한 전자 현미경으로 전송됩니다 수 있습니다. 이 상관 관계 방법은 대상의 위치를​​하는 데 도움이관심 REAS가 해결 될 수 있습니다. cryoEM (&lt;300 nm의)에 시료 두께 제한으로 인해, 현재 셀의 단지 주변 지역은 CryoET하여 3D 구조 분석에 적합합니다. 또한 밀링 9 유리체가 8 단면 또는 극저온 집중 이온빔 (FIB)에 의해 냉동 수화 시편의 두께를 줄이는 것은 상호 이미징의 기능을 확장 할 것이다. 이전에 상호 방법은 주로 대형 및 정적 구조 10-13 cryoET 데이터 수집을 용이하게하기 위해 사용되었다. 이 연구에서는 극저온 단계는 cryoEM 격자를 받아 직립 현미경 또는 거꾸로 현미경 10,11,14 중 하나에 맞게 구현되었습니다. 그리드를 전환하여 자신의 설계에 매우 간단 해 보이지만, EM 그리드에 대한 참여 단계를 전송하는 그리드, 변형 손상 및 오염 될 수있는 가능성을 증가 추가가 있습니다. 우리는 최근의 기술적 진보를 보여우리가 직접 감염 15 초기 단계에서 이러한 HIV-1과 숙주 세포의 상호 작용으로 촬영 자연 어려운 동적 인 이벤트를 시각화 할 수 있습니다 상호 현미경. 따라서 우리는 상관 관계를 촉진, 그리드 처리에 의한 시편의 손상을 최소화하기 위해 카트리지 시스템을 적응내는 빛 현미경 샘플 단계를 설계하고 구현하여이 작업을 수행. 우리의 디자인은 모두 극저온 빛과 cryo - 전자 현미경은 따라서 상호 프로세스를 능률화, 샘플 전송하지 않고 동일한 시편 홀더에 순차적으로 수행 할 수 있도록 통합 된 시편 카트리지 홀더가 포함되어 있습니다. 또한, 우리는 또한 기준점 표지로 형광 라텍스 구슬을 사용하여 정확하고 신뢰할 수있는 관계 절차를 구현했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

cryo - 전자 단층 촬영 (cryoET은) 근접에 생리적 상태 1 분자 해상도의 세포 구조의 3D 시각화 할 수 있습니다. 그러나 cryoET와 숙주 세포 환경에서 각각의 바이러스 복합체의 직접 시각화는 특히 HIV-1의 경우, 바이러스 성 항목의 자주와 동적 인 특성으로 인해, 2 도전합니다. 시간 경과 라이브 세포 이미징 HIV-1 3-7 라이프 사이클의 여러 측면에 대한 정보의 큰 거래를 굴복 동안, 해상도는 살아있는 세포 현미경으로 여유가 (~ 200 nm의) 제한됩니다. 우리의 작품은 살아있는 세포 형광 현미경을 결합내는 형광 현미경 및 cryoET에 의해 HIV-1 감염의 초기 사건의 직접적인 시각화를 허용하는 상관 관계 방법을 개발을 목표로 하였다. 이러한 방식으로, 라이브 셀내는 형광 신호를 정확하게 cryoET에서 샘플링을 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 구조 정보는 cryoET 수 있습니다 B에서 얻은동적 기능을 데이터로 보완 전자 형광 표지 대상의 라이브 세포 이미징을 통해 얻은. 이 비디오 문서에서는, 우리는 구조 HIV-1의 조사 및 3D 상호 고속 라이브 세포 이미징 및 고해상도 cryoET 구조 분석을 사용하여 호스트 세포 상호 작용에 대한 자세한 방법과 프로토콜을 제공합니다. HIV-1 입자에 감염 헬라 세포는 공 촛점 살아있는 세포 현미경으로 첫 번째 특징하였고, 같은 바이러스 성 입자를 포함하는 영역은 다음 차원 구조 자세한 내용은 cryo - 전자 단층 촬영을 이용하여 분석 하였다. 영상 데이터, 광학 이미징 및 전자 이미지의 두 세트 사이의 상관 관계는 집에서 내장내는 형광 빛 현미경 스테이지를 사용하여 달성되었다. 여기에 설명 된 방법은 바이러스 숙주 세포의 상호 작용 연구,뿐 아니라 세포 신호 전달, 막 수용체 인신 매매와 같은 세포 생물학의 광범위한 응용 프로그램, 그리고 많은 다른 동적 셀 프로세스뿐만 아니라, 도움이 될 것입니다. &lt;/ P&gt;

바이러스 입자의 동적 거동을 특성화하기 위해, HIV-1에 감염된 헬라 세포는 고속 공 촛점 살아있는 세포 현미경으로 몇 군데 있었다 및 입자의 운동은 (그림 1) 자동화 된 3D 입자 추적하여 분석 하였다. 마지막으로 공 촛점 라이브 셀 이미지 수집 및 플 런지 냉동 (이는 충분히 상관 HIV-1 입자를 잃을 수 있습니다)내는 형광 빛 현미경 단계 (그림 3 사이에 발생할 수있는 몇 ?...

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K 조회수.  University of Pittsburgh School of Medicine. 우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

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Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

연구

생체공학

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

신경 임 플 란 트의 연 화 행동을 예측 하기 위해 환경 동적 기계적인 분석

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...