저자는 기술의 CRYO-형광 샘플 단계, 중국 과학 기술 대학의 Changlu 어르신과 쳉 쑤의 건설 트래비스 휠러 및 세포 생물학의학과 기계 공장 및 생리학, 피츠버그 대학교에 감사드립니다 안내, 원고의 중요한 읽기 박사 테레사 Brosenitsch. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (GM082251 &amp; GM085043)에 의해 지원되었다.

1. 탄소 코팅에 헬라 세포 배양, 골드 EM 찾기 그리드 <ol><li> 글로우 방전 25 초 25mA 이하 200 메쉬 R2 / 2 Quantifoil 금 EM 찾기 그리드의 탄소 쪽. </li><li> 코트 50 ㎍ / ㎖의 fibronectin의 용액 40 μL 비말로, 아래로, 탄소 측을 떠하여 피브로넥틴과 EM 그리드, 다음, 조직 문화 후드에서 2 시간 동안 UV 빛의 밑에 그것을 소독. </li><li> 판 헬라 유리 바닥 문화 접시에 2 × 10 4 세포 / ㎖ (총 2 ㎖ 문화)의 밀도 그리드 위에 세포 DMEM에서 5 % CO 2, 37 ° C에서 세포 성장을 4.5로 보충 약 18 시간 동안 G / L L-글루타민과 포도당, 10 % 열 - 불 활성화 된 송아지 태아 혈청, 100 단위 / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신. 헬라 세포는 O / N 문화 이후에 감염됩니다. </li></ol> 2. HIV-1 감염과 라이브 셀 이미징 <ol><li> 유리 바닥 문화에 형광 세포 추적기 (레드 CMTPX, 1 μL / 2 ㎖)를 추가접시 (단계 1.3)와 형광 염료의 최대 걸릴 수 있도록, 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> PBS로 세포를 세척하고 50 μL 사전 예열 신선한 매체를 추가합니다. </li><li> 37 ° C, 스윕 필드 공 촛점 스캐너 현미경에서 라이브 셀 챔버에 접시를 놓습니다. 그들은 cryoEM 이후 대부분의 스프레드 아웃과 평면 (그림 2C와 2D 참조) 때 상대적으로 얇은 영역을 필요로 두 개의 유사 분열 단계 사이의 세포와 1-3 셀 / 사각형이 포함 된 여러 필드 (10-15 위치)을 선택 샘플. 미래 영상 (단계 2.5)에 대한이 위치를 저장합니다. </li><li> (우리는 P24의 40 NG / ML을 포함하는 시료 40 μl를 사용) GFP-VPR을 포함 VSV-G 의사 입력 된 HIV-1 입자로 세포를 감염. 영상의 위치가 이미 선택되어 저장 되었기 때문에 접시의 바닥에 바이러스 입자를 추가 할 때, EM 그리드를 방해하지 않도록주의해야합니다. </li><li> 바로 비리의 추가 후, TI 수집20 ~ 40 분 이전에 선택한 위치에서 고속 3D 공 촛점 이미지를 (단계 2.3) 나 경과. </li><li> 공 촛점 이미지는 MetaMorph를 사용하여 인수 Imaris 소프트웨어 (그림 1 참조)를 사용하여 단일 입자 역학에 대한 자동화 된 3D 입자 추적하여 분석 하였다. 우리는 회절의 동적 동작을 상호 연관되어 있기 때문에 HIV-1 세포의 미세 구조, 시간 경과 라이브 세포 이미징 및 3D 입자 추적을 가진 입자는 결과에 매우 중요합니다. 그러나 큰 정적 구조, 간단한 형광 이미지 (살아있는 세포없이) 상관 관계 분석에 충분할 것입니다. </li></ol> 3. 냉동 수화 EM 샘플 준비 마지막으로 공 촛점 이미지와 샘플 극저온 고정 모음 사이의 시간 지연을 최소화하기 위해, FEI Vitrobot (또는 다른 유리화 장치) 형광 공 촛점 라이브 셀 이미지를 수집하는 동안 시작과 플 런지 냉동 준비를해야합니다.<ol><li> 유리화 장치의 전원을 켜고 22의 기후 온도를 설정 ° C, 100 %로 목표 습도, 7 초에 더럽히는 시간 및 대기를하고 1 초 시간을 드레인. </li><li> 플런저 듀어에 그리드 스토리지 박스를 배치하고 차가운 액체 에탄을 준비합니다. 유리화 장치에 듀​​어를 탑재합니다. </li><li> 즉시 공 촛점 라이브 세포 이미징 (2 절) 후 얼음 냉각 구리 블록에 배양 접시를 놓고 cryoEM 샘플 준비 방에 전송할 수 있습니다. 전문 핀셋에 EM 그리드를로드하고 빠르게 그리드에서 모든 미디어를 멀리 얼룩. 모래 바닥은 0.2 μm의 형광등 마이크로 즉시 격자에 배치와 함께 15 나노 골드 비드 솔루션의 4 μL를 혼합 한 후, 여과지, 수동으로 이루어집니다. 골드 비즈는 단층 데이터 수집 및 정렬을 돕기 위해 기준점 마커로 사용됩니다. 형광 마이크로는 (그림 2C-2F 참조) 형광등 cryoEM 이미지 사이의 상관 관계를 원조하는 데 사용됩니다. </li><li> 유리화 장치에 핀셋을 넣고 액체 에탄 16 동결을 몰아 내고 빠지게 할 장치를 지시합니다. 최상의 결과를 달성하기 위해 최적화 된 더럽히는 매개 변수는 다음과 같습니다 오점 시간, 7 초, 오점 오프셋 0, 배출 시간, 1 초, 온도 22 ° C, 습도 100 %. </li><li> 나중에 사용하기 위해 즉시 cryoET 이미징을위한 cryoEM 홀더, 또는 액체 질소 저장 듀어에 냉동 수화 격자를 전송합니다. </li></ol> 4. CRYO-형광 광학 현미경 홈 내장, 극저온 형광 샘플 챔버 및 단계 시스템 (그림 3) 단계 4.1-4.10를 수행해야합니다. 단계의 자세한 사양과 설명은 6월 등. 15에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 적어도 2 시간내는 형광 빛 현미경 (그림 3A 참조) 시작하기 전에 액체 질소로 자기 가압 액체 질소 듀어를 입력합니다. </li><li> homebuilt CRYO-F를 탑재이러한 올림푸스 IX 71로 거꾸로 형광 광학 현미경, 위에 luorescence 샘플 스테이지 15 (그림 3). </li><li> 자기 가압 듀어에 극저온 샘플 단계의 액체 질소 주입구를 연결하고 적절한 용기에 액체 질소 오버 플로우 방지 콘센트를 배치합니다. 렌즈가 온난하고 서리 무료로 유지하는 대물 렌즈 위에 배치 슬리브 건조 질소 가스 라인을 연결합니다. </li><li> 냉동 수화 샘플 그리드를로드 CRYO 단계 챔버 구리 블록 플랫폼 (그림 3B에서 검은 색 화살표)를 놓습니다. 냉각 및 자기 가압 충전 듀어에서 유입 라인을 통해 액체 질소 극저온 단계의 구리 챔버를 입력합니다. </li><li> 극저온 단계는 액체 질소 온도 (~ 4-6 분)에 도달하면, 극저온 단계로 그리드 스토리지 상자 (단계 3.5에서) 전송합니다. </li><li> 구리 블록 EM 표본 카트리지에 냉동 수화 샘플 격자를 놓고 G 클립C-링을 사용하여 장소를 제거하거나 상단에 미리 냉각 구리 반지 (그림 3D 블랙 화살촉)를 배치 격자의 쉬운 검색을 위해 또한 장소에 그리드를 유지하기 위해 한 후 (Polara 현미경 카트리지를 사용하는 경우) CRYO-형광 이미징 (비 Polara cryo - 전자 현미경을위한 경우). </li><li> CRYO 단계 (그림 3B 흰색 화살촉)의 내부 챔버에서 카트리지를 (단계 4.6)에 놓습니다. </li><li> 검색하고 살아있는 세포 이미징 데이터에서 동일한 바이러스 입자를 찾을 수 있습니다. EM 격자 인덱스를 가지고 있기 때문에 살아있는 세포 이미지와 CRYO-형광 이미지를 모두 그리드에 동일한 입자를 지역화하는 간단합니다. </li><li> 긴 작동 (2.7-4 mm) 대물 렌즈와 광학 현미경을 사용하여 극저온 조건에서 식별 된 위치에 CRYO-DIC와 GFP 이미지를 획득. CRYO-형광 이미징 동안 주기적으로, 극저온 무대와 리필을에서 액체 질소 레벨을 점검 필요, -170 아래의 샘플 단계를 유지하기 위해° C. </li><li> CRYO-형광 이미징이 완료되면, 조심스럽게 구리 블록 플랫폼 표본 카트리지를 반환하고 Polara 시스템과 미래 cryoET 분석을 위해 액체 질소 듀어에 카트리지를 보관하십시오. 비 Polara cryo - 전자 현미경을 사용하는 경우, 구리 반지를 제거 샘플 격자를 검색, 그리드 스토리지 박스에 배치하고, 시편 cryoET에 의해 검사 될 때까지 액체 질소 듀어의 표본을 저장합니다. </li><li> 데이터 분석의 경우, 인수 CRYO-DIC와 GFP 이미지를 오버랩 (단계 4.9에서 그림 4b 참조) 라이브 세포 이미징 시리즈에서 얻은 사람들과 극저온 형광 이미지 GFP 신호의 위치를 연관. </li></ol> 5. cryo - 전자 단층 촬영 <ol><li> 이러한 Polara G2 현미경으로 전계 방출 총을 탑재 전자 현미경의 극저온 전송 스테이션에 샘플 카트리지를로드합니다. </li><li> 140X, IDE의 배율에 따라 저용량 - 검색 모드ntify 및 스테이지 파일에 연결된 그리드 사각형 (단계 4.11부터) 저장합니다. </li><li> 3,500 X의 배율 낮은 복용량 검색 모드에서, 100 μm의 목표 조리개 검색을 삽입하고 두 번째 단계의 파일에 GFP 신호와 상관 관계가있는 모든 위치를 저장합니다. </li><li> 중요하지 않은 탄소 영역에서 얼음을 떨어져 연소, 무대 Y 기능을 사용하여, / 2과 경사 축 수정 - 저용량 노출 모드에서, 1 또는 2 E의 복용량에 빔 강도를 조정하는 빈 영역을 찾아 여러 개의 금 구슬. </li><li> 저용량 초점 모드에서, 2 ~ 3 μm의 초점 거리를 조정하고 경사 축에 평행 초점의 방향을 정렬 각도를 조정합니다. </li><li> 저용량 - 검색 모드에서 (단계 5.3에서) 저장 위치를​​ 기억, 표본 eucentric 높이를 조정하고 관심 영역의 기울기 범위를 확인합니다. 박람회에 8 ~ 10 ㎛ defocus 조명에서 - 매우 낮은 전자 선량 (/ 2 ~ 1 E)와 투사 이미지를 획득cryo - 전자 단층 촬영을 위해 상호 바이러스 입자를 확인하기 위해 우레 모드. </li><li> 저용량 초점 모드로 전환합니다. TEM 자동 기능 메뉴에서 자동 eucentric 높이를 앞에하고 초점 영역에 기능을 집중한다. </li><li> 틸트 시리즈를 구입하는 매개 변수를 설정합니다. / 2 총 용량 - 본 논문에서는 그림 4, 틸트 각도는 각각 3 °, 2 ° 경사 단위에서, °, 아래 이상 45 ° ± 70 범위는 6 μM이 초점 흐림 약 70 E와 함께 사용되었다. </li><li> 모든 저장 위치에 대한 단계 5.7 및 5.8를 반복합니다. 배치 단층 촬영 소프트웨어는 처리량을 증가하기 위해 여러 위치에서 자동 데이터 수집에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 6. IMOD 17을 사용하여 입체적으로 재구성 <ol><li> 최소 및 최대 밀도 값을 조정하고 큰 이미지의 변화로 인해 제외 할 모든보기가 있는지 확인하기 위해 원시 경사 시리즈를 검사합니다. </li><li> eTomo 및 축 유형, 픽셀 크기, 기준점 직경 등을 사용하여 설치 단층 촬영 패널을 시작합니다. com을 스크립트를 만들 수 있습니다. </li><li> 단층 계산의 여러 단계를 조정 / 동시에 따라야 할 수 있도록 메인 화면을 구성합니다. 필요한 매개 변수를 수정하고 각 처리 단계 (eTomo 자습서를 참조하여 필요한 특정 프로그램을 실행 <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> 최종 단계에서 전체 정렬 된 스택을 만들 (0.6 미만의 평균 잔차)와 IMOD에서 가중 다시 프로젝션 알고리즘을 사용하여 tomograms을 재구성. </li><li> 명암과 선명도를 향상시키기 위해 적절한 매개 변수와 함께 IMOD에서 구현 된 3D 비선형 이방성 확산 가장자리 향상 프로그램을 사용하여 잠재적 인 이해의 영역을 워터 마크. </li></ol>

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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 cryoET 다음 시간 경과 공 촛점 라이브 세포 형광 이미징을 사용하여 동적 세포 이벤트를 분석하는 고급 상호 접근 방식을 제공하는 프로토콜의 간단한 세트를 발표했다. 고해상도 cryoET와 3D 라이브 세포 이미징의 상관 관계를하는 우리의 방법론 개발은 숙주 세포로 희귀, 동적 (앞에서 정적보고되지 않은) 및 회절 바이러스 입자와의 상호 작용을 시각화 많은 도전 생물학적 문제를 조사하는...

cryo - 전자 단층 촬영 (cryoET)는 세포와 조직의 3 차원 (3D) 시각화를 허용하고 근접에 생리 상태 1 분자 해상도에서 기본 세포 소기관 및 세포 구조의 조직에 대한 통찰력을 제공하는 강력한 이미징 기술입니다. 그러나, 그들의 방사선 민감도와 결합 흠 냉동 수화 시편의 본질적 낮은 콘트라스트가 어려운 세포 내부 관심 분야를 찾아 연속적으로 대상 영역을 손상시키지 않고 성공적으로 기울기 시리즈를 수행 할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 빛과 전자 현미경을 결합하여 상호 접근 방식이 필요합니다. 형광 라벨에 의해 강조 특정 기능을 식별 및 형광 광학 현미경에 의해 위치, 그리고 자신의 좌표는 고해상도 3D 구조의 데이터 수집을위한 전자 현미경으로 전송됩니다 수 있습니다. 이 상관 관계 방법은 대상의 위치를​​하는 데 도움이관심 REAS가 해결 될 수 있습니다. cryoEM (&lt;300 nm의)에 시료 두께 제한으로 인해, 현재 셀의 단지 주변 지역은 CryoET하여 3D 구조 분석에 적합합니다. 또한 밀링 9 유리체가 8 단면 또는 극저온 집중 이온빔 (FIB)에 의해 냉동 수화 시편의 두께를 줄이는 것은 상호 이미징의 기능을 확장 할 것이다. 이전에 상호 방법은 주로 대형 및 정적 구조 10-13 cryoET 데이터 수집을 용이하게하기 위해 사용되었다. 이 연구에서는 극저온 단계는 cryoEM 격자를 받아 직립 현미경 또는 거꾸로 현미경 10,11,14 중 하나에 맞게 구현되었습니다. 그리드를 전환하여 자신의 설계에 매우 간단 해 보이지만, EM 그리드에 대한 참여 단계를 전송하는 그리드, 변형 손상 및 오염 될 수있는 가능성을 증가 추가가 있습니다. 우리는 최근의 기술적 진보를 보여우리가 직접 감염 15 초기 단계에서 이러한 HIV-1과 숙주 세포의 상호 작용으로 촬영 자연 어려운 동적 인 이벤트를 시각화 할 수 있습니다 상호 현미경. 따라서 우리는 상관 관계를 촉진, 그리드 처리에 의한 시편의 손상을 최소화하기 위해 카트리지 시스템을 적응내는 빛 현미경 샘플 단계를 설계하고 구현하여이 작업을 수행. 우리의 디자인은 모두 극저온 빛과 cryo - 전자 현미경은 따라서 상호 프로세스를 능률화, 샘플 전송하지 않고 동일한 시편 홀더에 순차적으로 수행 할 수 있도록 통합 된 시편 카트리지 홀더가 포함되어 있습니다. 또한, 우리는 또한 기준점 표지로 형광 라텍스 구슬을 사용하여 정확하고 신뢰할 수있는 관계 절차를 구현했습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td><td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>F1141-1MG</td><td>HeLa cell culture on EM grids</td></tr><tr><td>Cell tracker</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>C34552</td><td>Red CMTPX</td></tr><tr><td>Protein A gold conjugates</td><td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td><td>15822-1</td><td>15 nm diameter</td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m fluorescent microspheres</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>F8811</td><td>Yellow-green fluorescent</td></tr><tr><td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottom culture dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gold quantifoil finder EM grids</td><td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td><td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Glow-discharge device 100X</td><td>EMS, Hatfield, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX 71 microscope</td><td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td><td></td><td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td></tr><tr><td>Nikon TiE microscope</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td></td><td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td></tr><tr><td>Sweptfield confocal microscope</td><td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit live cell chamber</td><td>Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-fluorescence sample stage</td><td>Home-made</td><td></td><td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td></tr></tbody></table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

cryo - 전자 단층 촬영 (cryoET은) 근접에 생리적 상태 1 분자 해상도의 세포 구조의 3D 시각화 할 수 있습니다. 그러나 cryoET와 숙주 세포 환경에서 각각의 바이러스 복합체의 직접 시각화는 특히 HIV-1의 경우, 바이러스 성 항목의 자주와 동적 인 특성으로 인해, 2 도전합니다. 시간 경과 라이브 세포 이미징 HIV-1 3-7 라이프 사이클의 여러 측면에 대한 정보의 큰 거래를 굴복 동안, 해상도는 살아있는 세포 현미경으로 여유가 (~ 200 nm의) 제한됩니다. 우리의 작품은 살아있는 세포 형광 현미경을 결합내는 형광 현미경 및 cryoET에 의해 HIV-1 감염의 초기 사건의 직접적인 시각화를 허용하는 상관 관계 방법을 개발을 목표로 하였다. 이러한 방식으로, 라이브 셀내는 형광 신호를 정확하게 cryoET에서 샘플링을 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 구조 정보는 cryoET 수 있습니다 B에서 얻은동적 기능을 데이터로 보완 전자 형광 표지 대상의 라이브 세포 이미징을 통해 얻은. 이 비디오 문서에서는, 우리는 구조 HIV-1의 조사 및 3D 상호 고속 라이브 세포 이미징 및 고해상도 cryoET 구조 분석을 사용하여 호스트 세포 상호 작용에 대한 자세한 방법과 프로토콜을 제공합니다. HIV-1 입자에 감염 헬라 세포는 공 촛점 살아있는 세포 현미경으로 첫 번째 특징하였고, 같은 바이러스 성 입자를 포함하는 영역은 다음 차원 구조 자세한 내용은 cryo - 전자 단층 촬영을 이용하여 분석 하였다. 영상 데이터, 광학 이미징 및 전자 이미지의 두 세트 사이의 상관 관계는 집에서 내장내는 형광 빛 현미경 스테이지를 사용하여 달성되었다. 여기에 설명 된 방법은 바이러스 숙주 세포의 상호 작용 연구,뿐 아니라 세포 신호 전달, 막 수용체 인신 매매와 같은 세포 생물학의 광범위한 응용 프로그램, 그리고 많은 다른 동적 셀 프로세스뿐만 아니라, 도움이 될 것입니다. &lt;/ P&gt;

바이러스 입자의 동적 거동을 특성화하기 위해, HIV-1에 감염된 헬라 세포는 고속 공 촛점 살아있는 세포 현미경으로 몇 군데 있었다 및 입자의 운동은 (그림 1) 자동화 된 3D 입자 추적하여 분석 하였다. 마지막으로 공 촛점 라이브 셀 이미지 수집 및 플 런지 냉동 (이는 충분히 상관 HIV-1 입자를 잃을 수 있습니다)내는 형광 빛 현미경 단계 (그림 3 사이에 발생할 수있는 몇 ?...

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K 조회수.  University of Pittsburgh School of Medicine. 우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

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Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

연구

신경과학

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

생화학

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

면역학 및 감염병학

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and regulated by different suites of binding proteins unique for each polymer. Many studies now demonstrate that the dynamics of both cytoskeletal polymers are intertwined and that this crosstalk is required for most cellular behaviors. A number of proteins involved in actin-microtubule interactions have already been identified (i.e., Tau, MACF, GAS, formins, and more) and are well characterized with regard to either actin or microtubules alone. However, relatively few studies showed assays of actin-microtubule coordination with dynamic versions of both polymers. This may occlude emergent linking mechanisms between actin and microtubules. Here, a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy-based in vitro reconstitution technique permits the visualization of both actin and microtubule dynamics from the one biochemical reaction. This technique preserves the polymerization dynamics of either actin filament or microtubules individually or in the presence of the other polymer. Commercially available Tau protein is used to demonstrate how actin-microtubule behaviors change in the presence of a classic cytoskeletal crosslinking protein. This method can provide reliable functional and mechanistic insights into how individual regulatory proteins coordinate actin-microtubule dynamics at a resolution of single filaments or higher-order complexes.

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol is a guide for visualizing dynamic actin and microtubules using an in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopy assay.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal biopolymers may lead to a host of active and adaptable materials. However, engineering such materials with precisely tuned properties requires measuring how the dynamics depend on the network composition and synthesis methods. Quantifying such dynamics is challenged by variations across the time, space, and formulation space of composite networks. The protocol here describes how the Fourier analysis technique, differential dynamic microscopy (DDM), can quantify the dynamics of biopolymer networks and is particularly well suited for studies of cytoskeleton networks. DDM works on time sequences of images acquired using a range of microscopy modalities, including laser-scanning confocal, widefield fluorescence, and brightfield imaging. From such image sequences, one can extract characteristic decorrelation times of density fluctuations across a span of wave vectors. A user-friendly, open-source Python package to perform DDM analysis is also developed. With this package, one can measure the dynamics of labeled cytoskeleton components or of embedded tracer particles, as demonstrated here with data of intermediate filament (vimentin) networks and active actin-microtubule networks. Users with no prior programming or image processing experience will be able to perform DDM using this software package and associated documentation.

Differential dynamic microscopy (DDM) combines features of dynamic light scattering and microscopy. Here, the process of using DDM to characterize reconstituted cytoskeleton networks by quantifying the subdiffusive and caged dynamics of particles in vimentin networks and the ballistic motion of active myosin-driven actin-microtubule composites is presented.

차등 동적 현미경을 사용하여 세포 골격 역학 정량화

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

생체공학

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to the maintenance of neuronal polarity by sorting somato-dendritic cargo. A membrane periodic skeleton (MPS) comprising periodic actin rings provides a scaffold for anchoring various AIS proteins, including structural proteins and different ion channels. Although recent proteomic approaches have identified a considerable number of novel AIS components, details of the structure of the MPS and the roles of its individual components are lacking. The distance between individual actin rings in the MPS (~190 nm) necessitates the employment of super-resolution microscopy techniques to resolve the structural details of the MPS. This protocol describes a method for using cultured rat hippocampal neurons to examine the precise localization of an AIS protein in the MPS relative to sub-membranous actin rings using 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM). In addition, an analytical approach to quantitively assess the periodicity of individual components and their position relative to actin rings is also described.

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy 3D-SIM

The present protocol describes a method to visualize and measure actin rings and other components of the membrane periodic skeleton of the axon initial segment using cultured rat hippocampal neurons and 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM).

3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

생물학

세포골격 네트워크를 시각화하기 위한 맞춤형 형광 현미경

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the dynamics of these 3D, dense networks calls for optical sectioning, which is often associated with fluorescence confocal microscopes. However, recent developments in light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) have established it as a cost-effective and, at times, superior alternative. To make LSFM accessible to cytoskeleton researchers less familiar with optics, we present a step-by-step beginner's guide to building a versatile light-sheet fluorescence microscope from off-the-shelf components. To enable sample mounting with traditional slide samples, this LSFM follows the single-objective light-sheet (SOLS) design, which utilizes a single objective for both the excitation and emission collection. We describe the function of each component of the SOLS in sufficient detail to allow readers to modify the instrumentation and design it to fit their specific needs. Finally, we demonstrate the use of this custom SOLS instrument by visualizing asters in kinesin-driven microtubule networks.

저자 스포트라이트: Advancing Knowledge in Far-From-Equilibrium Materials Through Light-Sheet Microscopy (광시트 현미경을 통한 평형에서 멀리 떨어진 재료에 대한 지식 발전)

This protocol describes in detail how to build a single-objective, light-sheet fluorescence microscope and its usage for visualizing cytoskeleton networks.

세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...