فإن الكتاب أود أن أشكر ترافيس يلر ورشة ميكانيكا في قسم بيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء في جامعة بيتسبرغ لبناء المرحلة عينة البرد مضان، تشانغ لو تاو وتشنغ شو في جامعة العلوم والتكنولوجيا في الصين لأسباب تقنية المساعدة، والدكتور تيريزا Brosenitsch لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM082251 وGM085043).

1. هيلا الثقافة خلية على الكربون المغلفة، الذهب EM شبكات الباحث <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفريغ توهج الجانب الكربون من 200 شبكة R2 / 2 Quantifoil الذهب EM مكتشف الشبكة تحت 25 مللي أمبير لمدة 25 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف الشبكة EM مع فبرونيكتين، التي تطفو عليه، من جانب الكربون أسفل، في الصعود إلى 40 قطرات ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين، ثم تعقيمها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة في نسيج الثقافة هود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة خلايا هيلا على الشبكة في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 4 خلية / مل (مجموع ثقافة مل 2) في طبق ثقافة زجاج القاع وتنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2، في DMEM تستكمل مع 4.5 ز / L L-الجلوتامين والجلوكوز، و 10٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين، 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، لحوالي 18 ساعة. يصاب خلايا هيلا بعد O / N الثقافة. </li></ol> 2. HIV-1 العدوى وتعيش خلية التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعقب خلية فلوري (CMTPX الأحمر، 1 ميكرولتر / 2 مل) في ثقافة زجاج القاعطبق (من الخطوة 1.3)، واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، للسماح تصل تتخذ من صبغة الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 50 ميكرولتر المتوسطة الطازجة قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق على الدائرة الخلية الحية، عند 37 درجة مئوية، حقل اجتاحت متحد البؤر المجهر الماسح الضوئي. تحديد حقول متعددة (10-15 المناصب) التي تحتوي على 1-3 خلايا / مربع، مع الخلايا بين مرحلتين الانقسام عندما هم الأكثر انتشار التدريجي وشقة (انظر الشكلين 2C و 2D)، منذ cryoEM يتطلب المناطق رقيقة نسبيا من عينة. تخزين هذه المواقف للتصوير المستقبل (الخطوة 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب الخلايا مع VSV-G الزائفة المكتوبة HIV-1 الجزيئات التي تحتوي على GFP-VPR (نستخدم 40 ميكرولتر من عينة تحتوي على 40 نانوغرام / مل من P24). عند إضافة جزيئات الفيروس في الجزء السفلي من الطبق، نكون حذرين حتى لا تعكر صفو شبكة EM، منذ تم بالفعل تحديد مواقع للتصوير وتخزينها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد إضافة virions، وجمع TIلي الفاصل عالية السرعة الصور مبائر 3D، في المواقف المحددة سابقا (من الخطوة 2.3) للدقيقة 20-40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم الحصول على الصور متحد البؤر باستخدام MetaMorph وتحليلها من خلال تتبع الجسيمات 3D الآلي لديناميات جسيم واحد باستخدام برنامج Imaris (انظر الشكل 1). وبما أننا ربط السلوك الديناميكي للحيود محدودة HIV-1 الجسيمات مع التركيب الدقيق الخلوية، والوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية وتتبع الجسيمات 3D حاسمة بالنسبة لنتائج. ومع ذلك، لبنية كبيرة وثابتة، فإن صورة مضان بسيط (بدون الخلية الحية) تكون كافية لتحليل مترابط. </li></ol> 3. المجمدة رطب EM تحضير العينة لتقليل زمن التأخير بين جمع من الصورة متحد البؤر مشاركة والبرد تثبيت للعينة، والاتحاد الدولي للفروسية Vitrobot (أو جهاز التزجيج أخرى) ينبغي الشروع وعلى استعداد ليغرق للتجميد خلال مجموعة من الصور مضان الخلية الحية متحد البؤر.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على جهاز التزجيج وضبط درجة حرارة مناخها إلى 22 درجة مئوية، والرطوبة الهدف إلى 100٪، في الوقت النشاف إلى 7 ثانية، والانتظار واستنزاف الوقت ل1 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع صندوق تخزين الشبكة في الغطاس ديوار وإعداد الإيثان السائل البارد. تحميل ديوار على الجهاز التزجيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد متحد البؤر التصوير الخلية الحية (القسم 2)، ضع صحن الثقافة على كتلة النحاس الجليد المبردة وتحويلها إلى غرفة تحضير العينات cryoEM. تحميل الشبكة EM على ملاقط المتخصصة وصمة عار بسرعة بعيدا أي وسيلة إعلامية على الشبكة. تتم النشاف يدويا، مع فلتر ورقة، وبعد ذلك 4 ميكرولتر من 15 نانومتر الذهب حل حبة مختلطة مع 0.2 ميكرون المجهرية الفلورسنت يوضع فورا على الشبكة. وتستخدم حبات الذهب وعلامات إيمانية لمساعدة جمع البيانات تصوير الشعاعي الطبقي والمحاذاة. يتم استخدام المجهرية الفلورسنت لمساعدة ارتباط بين الصور الفلورسنت وcryoEM (انظر الشكلين 2C-2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ملاقط على الجهاز التزجيج وترشد الجهاز صمة عار ويغرق في الإيثان السائل تجميد 16. المعلمات النشاف الأمثل لتحقيق أفضل نتيجة هي: الوقت وصمة عار، 7 ثانية؛ صمة عار أوفست، 0؛ وقت هجرة، 1 ثانية، درجة الحرارة، 22 درجة مئوية، والرطوبة، و 100٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكة المجمدة رطب لحامل cryoEM للتصوير cryoET فوري، أو لتخزين النيتروجين السائل ديوار لاستخدامها لاحقا. </li></ol> 4. البرد مضان المجهر الضوئي مطلوب نظام محلي الصنع، عينة البرد مضان غرفة والمرحلة (الشكل 3) لتنفيذ الخطوات 4،1-4،10. ويمكن الاطلاع على المواصفات التفصيلية ووصف المرحلة في يونيو وآخرون 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء النيتروجين السائل المضغوط النفس ديوار مع النيتروجين السائل على الأقل 2 ساعة قبل بدء المجهر الضوئي البرد مضان (انظر الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شن homebuilt البرد وluorescence عينة المرحلة 15 (الشكل 3) على مقلوب ضوء المجهر مضان، مثل أوليمبوس التاسع 71. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط مدخل النيتروجين السائل للمرحلة البرد العينة إلى ديوار مضغوطة الذاتي ووضع النيتروجين منفذ حماية تجاوز السائل في وعاء مناسب. ربط خط غاز النيتروجين الجاف لكم وتوضع على العدسة الشيئية للحفاظ على عدسة دافئة وخالية من الصقيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع منصة كتلة النحاس (السهم الأسود في الشكل 3B) في غرفة البرد مرحلة لتحميل الشبكة عينة مجمدة رطب. يبرد وملء غرفة النحاس للمرحلة البرد مع النيتروجين السائل من خلال خط مدخل من مضغوطة الذاتي ملء ديوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصل إلى مرحلة البرد درجة حرارة النيتروجين السائل (في ~ 4-6 دقيقة)، ونقل مربع تخزين الشبكة (من الخطوة 3.5) إلى مرحلة البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشبكة عينة مجمدة رطب في خرطوشة عينة EM على كتلة النحاس ومشبك زالتخلص في مكان باستخدام الدائري C (في حالة استخدام خرطوشة المجهر Polara)، أو وضع خاتم من النحاس قبل تبريده على رأس (رأس السهم الأسود في الشكل 3D)، للحفاظ على الشبكة في مكان وأيضا لسهولة استرجاعها من الشبكة بعد التصوير البرد مضان (إذا كان لغير Polara البرد الإلكترون المجهر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع خرطوشة (من الخطوة 4.6) في الدائرة الداخلية للالبرد مرحلة (أبيض رأس السهم في الشكل 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث والعثور على جزيئات الفيروس نفسه من البيانات التصوير الخلية الحية. منذ الشبكة EM يحتوي على فهرس، فإنه واضح ومباشر في توطين نفس الجسيمات على الشبكة في كل من الصور الخلية الحية والصور البرد الإزهار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتساب البرد مدينة دبي للإنترنت والصور GFP في المواقف المحددة في إطار البرد حالة باستخدام مجهر الضوء مع العمل الطويل (2،7-4 ملم) عدسة الهدف. خلال التصوير البرد مضان، دوريا فحص مستوى النيتروجين السائل في مرحلة البرد وإعادة ملء ذلك، حسب الحاجة، للحفاظ على مرحلة عينة أدناه -170° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من البرد مضان التصوير، والعودة بعناية خرطوشة العينة إلى منصة كتلة النحاس وتخزين خرطوشة في النيتروجين السائل ديوار لتحليل cryoET المستقبل مع نظام Polara. في حالة استخدام غير Polara البرد الإلكترون المجهر، وإزالة خاتم من النحاس، استرداد الشبكة عينة، ووضعه في صندوق التخزين الشبكة، وتخزين العينة في النيتروجين السائل ديوار حتى يتم فحص العينة بواسطة cryoET. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل البيانات، تتداخل المكتسبة البرد مدينة دبي للإنترنت وGFP الصور (من الخطوة 4.9، انظر الشكل 4B) وربط مواقف إشارات GFP في الصورة البرد مضان مع تلك التي حصلنا عليها في سلسلة التصوير الخلية الحية. </li></ol> 5. البرد الإلكترون التصوير المقطعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل خرطوشة عينة في محطة البرد نقل مجهر الكتروني مجهزة بمدفع انبعاث المجال، مثل Polara G2 المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوضع في ظل انخفاض بالجرعات البحث في التكبير من 140X، IDEntify وحفظ الساحات الشبكة المرتبطة بها (من الخطوة 4.11) في ملف المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت وضع بالجرعات المنخفضة البحث في التكبير من 3،500 X، اضافة الى وجود 100 ميكرون الهدف الفتحة، والبحث وحفظ جميع المواقف ترتبط مع إشارات GFP في ملف المرحلة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت وضع جرعة التعرض منخفض، والعثور على منطقة فارغة إلى ضبط شدة شعاع لجرعة من 1 أو 2 ه - / م 2 وصقل محور إمالة، وذلك باستخدام وظيفة Y المرحلة، عن طريق حرق بعيدا الجليد في المنطقة الكربون غير مهم مع عدة حبات الذهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت وضع جرعة منخفضة التركيز، وضبط مسافة التركيز إلى ~ 3 ميكرون وضبط زاوية لمحاذاة اتجاه التركيز لتكون موازية للمحور الميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت وضع بالجرعات بحث المنخفضة، وأذكر مواقف حفظها (من الخطوة 5.3)، وضبط ارتفاع eucentric العينات والتحقق من مدى الميل للمنطقة من الفائدة. الحصول على صورة الإسقاط مع منخفض جدا الإلكترون الجرعة (~ 1 ه - / أ 2) في 8-10 ميكرون يزيل التباؤر، في المعارضالوضع لدى عودتهم، للتأكد من جزيئات الفيروس المترابطة للالبرد الإلكترون التصوير المقطعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى وضع جرعة التركيز المنخفض. في TEM السيارات وظائف القائمة، تسبق ارتفاع eucentric الآلي والتركيز على وظائف في مجال التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معلمات للحصول على سلسلة الميل. الشكل 4 لفي هذه الورقة، زوايا الميل تتراوح ± 70 درجة، فوق وتحت 45 درجة مئوية، في 3 ° و 2 ° زيادات الميل، على التوالي، استخدمت، مع 6 ميكرون يزيل التباؤر وحوالي 70 ه - / م 2 الجرعة الإجمالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5.7 و 5.8 لجميع المواقف المحفوظة. دفعة البرمجيات التصوير المقطعي يمكن استخدامها لجمع البيانات الآلي في مواقع متعددة لزيادة الإنتاجية. </li></ol> 6. إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد باستخدام IMOD 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد سلسلة الخيمة الخام إلى ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم الكثافة وتحديد ما إذا كان هناك أي عرض سيتم استبعادها نظرا لتحول صورة كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء eTomo ولوحة مقطعية الإعداد باستخدام نوع المحور، حجم بكسل، وقطره إيمانية، الخ. ثم إنشاء البرامج النصية كوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكوين الإطار الرئيسي بحيث عدة مراحل حساب مقطعية يمكن تعديلها / يتبع في وقت واحد. تعديل المعلمات اللازمة وتنفيذ برامج محددة مطلوبة من قبل كل خطوة من خطوات التجهيز (انظر eTomo البرنامج التعليمي، <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المرحلة النهائية، وخلق كومة الانحياز الكامل (مع وجود خطأ المتبقية يعني أقل من 0.6) وإعادة بناء tomograms باستخدام خوارزمية المرجح عودة الإسقاط في IMOD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دينويسي المجالات المحتملة للاهتمام باستخدام 3D غير الخطية متباين الخواص نشر حافة تعزيز تنفيذ البرنامج في IMOD مع المعلمات المناسبة لتعزيز التباين والوضوح. </li></ol>

<ol>
	<li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cells+at+the+nanoscale.">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li><li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry.">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li><li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes.">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li><li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages.">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy.">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84 (2009).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li><li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li><li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells.">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li><li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

لقد قدمنا ​​مجموعة واضحة من البروتوكولات لتوفير نهج مترابط متقدمة لتحليل الأحداث الخلوية الديناميكية باستخدام الوقت الفاصل بين متحد البؤر، والتصوير مضان الخلية الحية تليها cryoET. لدينا التطوير المنهجي لربط 3D التصوير الخلية الحية مع عالية الدقة cryoET أمر بالغ الأهمية...

البرد الإلكترون التصوير المقطعي (cryoET) هي تقنية التصوير القوية التي تسمح ثلاثي الأبعاد (3D) التصور من الخلايا والأنسجة، ويقدم نظرة ثاقبة لتنظيم العضيات المحلية والهياكل الخلوية في القرار الجزيئية في وثيقة إلى الحالة الفسيولوجية 1. ومع ذلك، وعلى النقيض منخفضة بطبيعتها من غير ملوثين العينة المجمدة رطب، جنبا إلى جنب مع حساسية للإشعاع، ويجعل من الصعب تحديد المجالات ذات الاهتمام داخل الخلية وأداء لاحقا إلى سلسلة الميل بنجاح دون الإضرار المنطقة المستهدفة. من أجل التغلب على هذه المشاكل، واتباع نهج مترابط يجمع بين الضوء والمجهر الإلكتروني هو ضروري. ويتم تحديد السمات المحددة التي أبرزها وضع العلامات الفلورية وتقع بواسطة المجهر الضوئي مضان، وبعد ذلك يتم نقل الإحداثيات الخاصة بها إلى المجهر الإلكتروني لاقتناء القرار البيانات الهيكلية عالية 3D. هذا الأسلوب المتلازم يساعد تحديد مكان وجود الهدف كانREAS من الفائدة التي يتعين معالجتها. ونظرا لقيود على سماكة العينة مع cryoEM (&lt;300 نانومتر)، حاليا فقط المناطق الطرفية من الخلية هي مناسبة لتحليل الهيكلية 3D بواسطة CryoET. سوف يزيد من تقليل سماكة من العينات المجمدة رطب بواسطة زجاجي باجتزاء 8 أو البرد تركز أيون شعاع (FIB) صفائح 9 توسيع نطاق قدرات التصوير مترابط. سابقا، كانت تستخدم أساليب المتلازم في المقام الأول إلى تسهيل الحصول على البيانات cryoET لهياكل كبيرة وثابتة 10-13. في هذه الدراسات، تم تنفيذ البرد مراحل لقبول شبكات cryoEM وتناسب وضعها إما المجهر تستقيم أو مجهر مقلوب 10،11،14. على الرغم من التحول شبكات يبدو اضحة إلى حد ما في تصاميمهم، وهناك نقل إضافية الخطوات المتبعة للحصول على الشبكة EM، مما يزيد من فرصة أن الشبكة قد تكون مشوهة، وتلف والملوثة. ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت تقدما في التقنيةالمجهر المتلازم الذي يسمح لنا لتصور الأحداث مباشرة الديناميكية التي هي بطبيعتها صعبة لالتقاط الصور، مثل HIV-1 والتفاعلات الخلية المضيفة في المراحل المبكرة من العدوى 15. نحن إنجاز هذا من خلال تصميم وتنفيذ نموذج المجهري البرد على ضوء المرحلة التي تتكيف مع نظام خرطوشة لتقليل الضرر العينة بسبب طريقة تعامل الشبكة، مما يسهل الارتباط. لدينا تصميم متكامل يتضمن حامل خرطوشة العينة، السماح لكلا المجهري البرد الخفيفة والبرد الإلكترون التي يتعين القيام بها، بالتتابع، على نفس صاحب العينة، من دون نقل العينة، وبالتالي تبسيط عملية مترابط. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا تنفيذ إجراء دقيقة وموثوق بها علاقة باستخدام الخرز اللاتكس فلوري كعلامات إيمانية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

البرد الإلكترون التصوير المقطعي (cryoET) يسمح التصور 3D من الهياكل الخلوية الجزيئية في القرار في حالة إغلاق إلى الفسيولوجية 1. ومع ذلك، والتصور المباشر من المجمعات الفيروسية الفردية في بيئة المضيفة الخلوية مع cryoET يتحدى 2، نظرا لطبيعة نادرة وديناميكية من دخول الفيروس، وخاصة في حالة HIV-1. بينما الوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية قد حقق قدرا كبيرا من المعلومات حول العديد من جوانب دورة حياة HIV-1 3-7، القرار التي يوفرها المجهري الخلية الحية محدودة (~ 200 نانومتر). ويهدف عملنا في تطوير طريقة الارتباط الذي يسمح التصور مباشرة من الأحداث في وقت مبكر من HIV-1 العدوى عن طريق الجمع بين الخلية الحية المجهري ضوء الفلورسنت، المجهري البرد الفلورسنت، وcryoET. في هذه الطريقة، وإشارات الخلية الحية والبرد الفلورسنت يمكن استخدامها لتوجيه بدقة أخذ العينات في cryoET. وعلاوة على ذلك، تم الحصول عليها من المعلومات الهيكلية cryoET يمكن به تستكمل مع البيانات الديناميكية الوظيفية المكتسبة من خلال التصوير الخلية الحية من الفلورسنت الهدف المسمى. في هذه المقالة الفيديو، ونحن نقدم أساليب وبروتوكولات وإجراءات تفصيلية للتحقيق الهيكلية للHIV-1 والتفاعلات المضيف الخلية باستخدام 3D المتلازم عالية السرعة التصوير الخلية الحية وعالية الدقة cryoET التحليل البنيوي. وتميزت خلايا هيلا المصابين HIV-1 الجسيمات الأولى التي متحد البؤر المجهري الخلية الحية، والمنطقة التي تحتوي على نفس الجسيمات الفيروسية ثم تم تحليلها من قبل البرد الإلكترون التصوير المقطعي للحصول على التفاصيل الهيكلية 3D. وقد تحقق الارتباط بين مجموعتين من البيانات والتصوير، والتصوير الضوئي والتصوير الإلكترون، وذلك باستخدام البرد مضان ضوء المرحلة المجهري محلي الصنع. فإن نهج مفصل هنا تكون ذات قيمة، ليس فقط لدراسة التفاعلات الخلية المضيفة الفيروس، ولكن أيضا لتطبيقات أوسع في بيولوجيا الخلايا، مثل الخلايا مما يشير، والاتجار مستقبلات الغشاء، والعديد من العمليات الخلوية الحيوية الأخرى. &lt;/ P&gt;

لتوصيف السلوك الديناميكي للجزيئات الفيروس، تم تصوير خلايا هيلا المصابين HIV-1 بواسطة عالية السرعة متحد البؤر المجهري الخلية الحية وحللت تحركات الجسيمات من خلال تتبع الجسيمات الآلي 3D (الشكل 1). لتجنب مرور الوقت من عدة دقائق التي يمكن أن تحدث بين جمع من الماضي م?...

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions at JoVE.com

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

نحن تصف طريقة المجهر المتلازم الذي يجمع بين السرعة العالية 3D الخلية الحية المجهري ضوء الفلورسنت وعالية الدقة البرد الإلكترون التصوير المقطعي. علينا أن نظهر قدرة أسلوب مترابط عن طريق التصوير الديناميكي، صغيرة HIV-1 جزيئات التفاعل مع خلايا هيلا المضيف.

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. نحن تصف طريقة المجهر المتلازم الذي يجمع بين السرعة العالية 3D الخلية الحية المجهري ضوء الفلورسنت وعالية الدقة البرد الإلكترون التصوير المقطعي. علينا أن نظهر قدرة أسلوب مترابط عن طريق التصوير الديناميكي، صغيرة HIV-1 جزيئات التفاعل مع خلايا هيلا المضيف.

Video: Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

دراسة رياضيات الكيمياء من البشرة عامل نمو مستقبلات في الخلايا السليمة باستخدام الميكروسكوب المتلازم

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

المتلازم الخفيفة والمجهر الإلكتروني عن طريق الكم دوت النانوية

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

المجهر الإلكتروني الارتباطية الخفيفة (كليم) لتتبع وتصوير البروتينات الفيروسية المرتبطة الهياكل في الخلايا المعطل تداولها البرد

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

بناء ورقة الطبقات الوسيطة من الخلايا الجذعية مع نظام 3D دينامية الثقافة

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

تحليل الميكانيكية الحيوية البيئية للتنبؤ بسلوك تليين يزرع العصبية

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

محلل البنية الفرعية: سير عمل سهل الاستخدام للاستكشاف السريع والتحليل الدقيق للأجسام الخلوية في صور المجهر الفلوري

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

سلالة تسيطر عليها من هيدروجيلس 3D تحت التصوير المجهري لايف

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...