אנו אסירי תודה למיקלה דה מרטינו, וילפרד ר &#39;הייגן, וKourosh Honarmand אברהימי לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי הזנק מימון מאוניברסיטת דלפט לטכנולוגיה.

1. ביטוי וטיהור DPS קבלת חלבון של טוהר גבוה היא צעד ראשון חיוני לassay-DNA הגנה. טיהור של חלבון DPS יכולה להתבצע ב4 עד 5 ימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך זן פרוטאז לקוי של א &#39; coli (כגון BL21 (DE3) pLysS) עם וקטור PET (כגון pET17) שלתוכו רצף חלבון קידוד DPS כבר משובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס הפך את תאים לצלחות מרק לוריא (LB) אגר המכילות אנטיביוטיקה מתאימה (כמו אמפיצילין וchloramphenicol לדוגמות שסופקו ב1.1). דגירה צלחות הלילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת מהצלחת לתוך 30 מ&quot;ל של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד ב 200-250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 2 מדיום LB L 1 X המכיל אנטיביוטיקה מתאימה עם 10 כל אחד מתרבות לילה מ&quot;ל. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, ואילו רועד, לקוטר 600 </תת&gt; של כ 0.6. (גידול תאים לתשואת חלבון עליות OD גבוהה יותר, מבלי להתפשר באופן ניכר על טוהר של המוצר הסופי.) לגרום ביטוי של DPS על ידי הוספת IPTG לריכוז של 0.3 מ&quot;מ, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 3-4 בזמן רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 6000 במשך 15 דקות. Resuspend את כדורי התא ב7.5 מ&quot;ל של חיץ DEAE (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 100 מ&quot;מ NaCl, 0.1 מ&quot;מ EDTA) לכל ליטר של תרבית תאים מושרה. דוגמאות ניתן להקפיא בחנקן נוזלי ומאוחסנות ב -80 ° C, אם תרצה בכך. ההליך לאחר מכן ניתן להמשיך על ידי הפשרת הדגימות באמבט מים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תערובת של מעכבי פרוטאז (כגון מעכבי פרוטאז Calbiochem סט שלישי, ב0.167 μl לכל מ&quot;ל של השעיה תא) להשעית התא כדי למנוע השפלה של DPS overexpressed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמצית תא ללא שימוש בעיתונות צרפתית. ראש העיתונות הצרפתית עם 20 מ&quot;ל DEAE מאגר (אם משתמש במודל זרימה רציפה), ואז disrupלא מדגם פעמיים ב 20 KPSI. צנטריפוגה XG lysate ב30,000 עבור 35 דקות ב 4 ° C כדי להבהיר חלקיקים מסיסים, ולשמור את supernatant. Supernatant אז יכול להיות קפוא באמצעות חנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 ° C, אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עמודת 30 מיליליטר DEAE Sepharose CL-6B עם DEAE הצפת, באמצעות FPLC. הפעל חיץ דרך העמודה ב1-2 מ&quot;ל / דקה עם לחץ מקסימאלי של 0.2 מגפ&quot;ס על רקע. טען את תמצית תא ללא על הטור, ומתחיל לאסוף את הזרימה דרך פעם אחת את אות OD 280 מתחילה לעלות מעל קו בסיס. לשטוף את העמודה עם DEAE הצפת ערך OD עד 280 חוזר לנקודת התחלה, תוך איסוף הזרימה דרך ברציפות. זרימה דרך אמור להכיל את רוב חלבון DPS, ללא תשלום מ-DNA המאוגד. לשטוף את העמודה עם 100% הצפת B (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 1 M NaCl, 0.1 mM EDTA). eluate זה מכיל מתחמי DPS-DNA כמו גם חלבונים אחרים, ויכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המודעהditional מזהם חלבונים באמצעות ממטרים אמוניום סולפט. לקבוע את עוצמת הקול של נקווה זרימת הדרך. לאט לאט (על פני תקופה של 10-20 דקות) להוסיף אמוניום סולפט קטן תבואה היבשה לרוויה 62% (390 מ&quot;ג לכל מ&quot;ל של תמיסה) ב 4 ° C תוך ערבוב טוב. מערבבים את התערובת במשך 20-30 דקות נוספות לאחר הוספת החלק האחרון של אמוניום סולפט כדי להבטיח איזון מלא. DPS יישאר מסיס, ואילו חלבונים מזהמים יהיו לזרז את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלבונים זרזו ידי צנטריפוגה XG ב 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C ולשמור את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף אמוניום סולפט 227 מ&quot;ג נוסף לכל מ&quot;ל של supernatant להגיע 94% רוויה ומערבבים במשך 20-30 דקות על מנת להבטיח איזון מלא. DPS משקעים בריכוז מלח גבוה וזה יכול להיות שנאסף על ידי צנטריפוגה XG ב 20,000 עבור 30 דקות ב 4 ° C. DPS יהיה בגלולה; יכול להיות מושלך supernatant. ניתן לאחסן את גלולה ב -80 מעלות צלזיוס אם desired. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה המכילה-DPS במאגר resuspension (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl, 0.1 mM EDTA). התאם את נפח הדגימה של 2.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ חילופי להסיר אמוניום סולפט באמצעות עמודת סינון PD-10 ג&#39;ל. לאזן מיטת ג&#39;ל עם 25 הצפת resuspension מ&quot;ל. החל מ&quot;ל של 2.5 מדגם DPS לחלק העליון של PD-10 העמודה ולאפשר לו לספוג פנימה מחק את הזרימה דרכו. לאסוף DPS על ידי משחררי עם 3.5 הצפת resuspension מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם-החליף חיץ XG 16,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את כל רכיבים מסיסים, ולדלל אותו עם 6-10 חיץ דילול מ&quot;ל (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 0.1 mM EDTA) על מנת להבטיח כי ריכוז המלח הוא נמוך מספיק בשביל DPS להיקשר לעמודת Sepharose SP. דגימות במיוחד מרוכזות של DPS עשויות להיות פחות מסיסה על דילול לתוך מאגר התחתון מלח, כפי שמעיד עננות של הנוזל, אך ניתן resolubilized לחלוטין על ידי התוספת של amou קטןNT של פתרון 5 M NaCl (10-20 מ&quot;מ נוסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עמודת 30 מיליליטר SP Sepharose מהירה זרימה עם SP המאגר (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 מ&quot;מ NaCl, 0.1 mM EDTA). הפעל חיץ דרך העמודה ב1.5-2 מ&quot;ל / דקה עם מגבלת לחץ של 0.3 MPa על רקע. טען את המדגם על העמודה. לשטוף עם SP מאגר עד שחוזר קורט 280 OD לנקודת התחלה, וזורקים את הזרימה דרך. הפעל שיפוע ליניארית 150 מ&quot;ל מ -0 ל -100 ב &#39;הצפת%, תוך איסוף שברים 2 מ&quot;ל. DPS יהיה elute בשיא חד בסביבות 50% ב &#39;, אם כי ב -10% הווריאציה אפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את השברים elution על 15% ג&#39;ל-SDS, ולבדוק אם יש זיהום הדנ&quot;א על ידי מדידת יחס 280 260 / OD OD באמצעות ספקטרופוטומטר. ג&#39;ל רק צריך להראות להקה אחת סביב 19 kDa, ו260 / 280 קוטר חיצוני קוטר חיצוני הוא בדרך כלל סביב 0.7. הברכה שברי DPS הטהור ביותר. השתמש ביחידת מסנן צנטריפוגלי (כגון יחידת סינון Ultra Amicon) עם10K משקל מולקולרי החתך כדי לרכז את העקורים ולהחליף אותו למאגר אחסון (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 מ&quot;מ NaCl). Aliquot העקורים המטוהרים, ולהקפיא בחנקן נוזלי לאחסון ב -80 ° C. </li></ol> 2. Assay הגנת ה-DNA Assay כרוך שלבים רגישים לזמן מרובים וצריך להיות מתוזמן לשנייה כדי להשיג תוצאות לשחזור. מרכיבים רבים וצעדי pipetting מעורבים, ולכן שולחן pipetting (ראה טבלה 1) רצוי לעקוב אחר צעדים ואמצעי אחסון. הזמן הכולל הנדרשים עבור assay הוא לא יותר משעה 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 30 מ&quot;ל מים לתוך בקבוקון אטום; לשטוף את המים עם N 2 במשך 10 דקות (באמצעות מזרק שתי מחטים, אחד בנוזל, אחד מעליו) כדי להסיר את החמצן מפתרון. הוסף 0.0168 4 • 2 O 7H גרם FeSO למים כדי להשיג פתרון מניית 2 מ&quot;מ. לאטום את הבקבוקון ולשטוף עם חנקן במשך 5 דקות נוספות, ואז לערבב. הפתרון חייב להיותברור, אם כל רמז לצהוב הוא לגילוי, להכין פתרון ברזל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 100 מ&quot;מ פתרון H 2 O 2 (10.87 μl של 9.2MH 2 O 2 לתוך מים 1 מ&quot;ל); לשמור על קרח ומוגן מפני אור על ידי עטיפה בנייר אלומיניום. השתמש אך ורק לכ 1-2 שעות לאחר הכנה בשל דעיכה ספונטנית. מניית מי חמצן היא באופן דומה בכפוף להתמוטטות, שעשויים להשתפר באופן חלקי על ידי אחסון נאות (בחושך, על 4 מעלות צלזיוס). בדיקות תקופתיות של ריכוז המניות על ידי מדידת 240 OD מומלצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי aliquot של מטוהר DPS במהירות באמבט מים בטמפרטורת חדר, ולשמור על קרח. צנטריפוגה במשך 10 שניות ב 4000 XG בpicocentrifuge בראש טבלה למצרפי משקע. למדוד את הריכוז לאחר centrifuging באמצעות ספקטרופוטומטר (OD 280 = 1.547 מציין ריכוז של 100 DPS מונומר מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל DNA ליניארי מ- ריכוז גבוה מניות באמצעות מאגר התגובה 12x (1M-מגבים KOH pH 7.0, 1 M NaCl) בריכוז של 100 ng / μl. ה-DNA לינארי משמש כדי להפוך את הכימות קל יותר, אבל פלסמיד דנ&quot;א עשוי לשמש גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 1 של תערובת ה-DNA החיץ לתוך צינור ה-PCR. הוסף מספיק מים לתגובה, כך שנפח התגובה הסופי (מינוס SDS) יהיה 12 μl. סכום זה צריך להיות מחושב מראש באמצעות טבלת pipetting. הוסף DPS לריכוז dodecamer סופי של 3 מיקרומטר. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר, כדי לאפשר לעקורים להיקשר ל-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק פתרון 2 מ&quot;מ FeSO 4 כדי להגיע לריכוז הרצוי. ניסוי טיפוסי משתמש במגוון של ריכוזים מ -0 עד 1 מ&quot;מ FeSO 4. ריכוזים גבוהים יותר יגרמו לפירוק ה-DNA נרחב יותר, אלא גם עשויים להוביל להיווצרות של הברזל שוקע בתערובת התגובה. להוסיף במהירות של 1 μl פתרון 100 מ&quot;מ H 2 O 2 (לריכוז סופי 10 מ&quot;מ), ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות על מנת לאפשר לפנטוןתגובה בתיווך השפלה להתקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.8 μl של 20% SDS (נתרן גופרתי dodecyl). לערבב ולדגור על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לשבש את מתחמי DPS-DNA. SDS מערער מורכב DPS-DNA ומונע משמרות ג&#39;ל לא רצויות עבור ה-DNA, אשר משפרת את הקלות של כימות. צעד אופציונלי הוא לעצור את התגובה על ידי מי חמצן catalytically המשפיל למוצרים שאינם רעילים. לתנאים שתוארו בפרוטוקול זה, בשלב זה אין צורך להשיג מגוון רחב של השפלה ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על קרח במשך דקות 1, להוסיף טעינת צבע, ולטעון על ג&#39;ל agarose. הרץ את הג&#39;ל, וכתם לדנ&quot;א באמצעות ethidium ברומיד. ג&#39;ל צריך להיות לאחר אלקטרופורזה מוכתמת ולא לפני אלקטרופורזה, כדי למנוע SDS מלהתערב בחלוקת רומיד ethidium בג&#39;ל. </li></ol>

<ol>
	<li>Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli.">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li><li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions:+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding.">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li><li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid.">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).</li><li>Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+repression+by+Fis+and+H-NS+at+the+Escherichia+coli+dps+promoter.">Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter.</a> Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).</li><li>Martinez, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+DNA+during+oxidative+stress+by+the+nonspecific+DNA-binding+protein+Dps.">Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps.</a> J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).</li><li>Nair, S., Finkel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dps+protects+cells+against+multiple+stresses+during+stationary+phase.">Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase.</a> J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).</li><li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+Dps,+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA.">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).</li><li>Zhao, G., Ceci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+and+hydrogen+peroxide+detoxification+properties+of+DNA-binding+protein+from+starved+cells.+A+ferritin-like+DNA-binding+protein+of+Escherichia+coli.">Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).</li><li>Ceci, P., Cellai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+condensation+and+self-aggregation+of+Escherichia+coli+Dps+are+coupled+phenomena+related+to+the+properties+of+the+N-terminus.">DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus.</a> Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).</li><li>Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+incorporation+into+Escherichia+coli+Dps+gives+rise+to+a+ferritin-like+microcrystalline+core.">Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core.</a> J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).</li><li>Swift, J., Wehbi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+functional+ferritin-like+proteins+with+hydrophobic+cavities.">Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).</li><li>Ceci, P., Chiancone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+iron+oxide+nanoparticles+in+Listeria+innocua+Dps+(DNA-binding+protein+from+starved+cells):+a+study+with+the+wild-type+protein+and+a+catalytic+centre+mutant.">Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant.</a> Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).</li><li>Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dps+protein+of+Agrobacterium+tumefaciens+does+not+bind+to+DNA+but+protects+it+toward+oxidative+cleavage:+x-ray+crystal+structure,+iron+binding,+and+hydroxyl-radical+scavenging+properties.">The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).</li><li>Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+so-called+Listeria+innocua+ferritin+is+a+Dps+protein.+Iron+incorporation,+detoxification,+and+DNA+protection+properties.">The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties.</a> Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).</li><li>Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+Koelreuteria+paniculata+Laxm.+on+oxidative+stress+and+hydrogen+peroxide-induced+DNA+damage.">Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage.</a> Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).</li><li>Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radical+scavenging,+DNA+protection,+and+inhibition+of+lipid+peroxidation+mediated+by+uric+acid.">Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+role+of+Fur+proteins:+FurB+(All2473)+from+Anabaena+protects+DNA+and+increases+cell+survival+under+oxidative+stress.">New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress.</a> The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).</li><li>Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+and+stimulation+of+formation+of+the+ferroxidase+center+and+the+iron+core+in+Pyrococcus+furiosus+ferritin.">Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).</li><li>Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+iron+determination+using+ferene+triazine.">Serum iron determination using ferene triazine.</a> Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

תהליך הטיהור של העקורים כפי שתואר במאמר זה הוא מאוד חזק. טוהר היה גבוה באופן עקבי (&gt; 99%); אין חלבונים אחרים מופיעים בג&#39;לי-SDS כמו להקות נראות לעין. למרות זאת, נראות כמה קבוצות של DPS המטוהר יש פעילות nuclease, כפי שמעידים השפלה DNA חלקית כאשר טופחו עם ריכוזים גבוהים מאוד של DPS. ?...

יצורים אירוביים כל הזמן צריכים להתמודד עם מיני חמצן תגובתי שיכול לגרום נזק DNA שלהם, כמו גם מולקולות ביולוגיות חיוניות אחרות. כלי רב עוצמה אחד כדי לנטרל את ההשפעות הרעילות של נזק חמצוני הוא חלבון ה-DNA מחייב מהתאים מורעבים (DPS). מאז גילויו בשנת 1992 מא &#39;המורעבת coli תרבות 1, DPS זוהה יותר מ -300 מינים של חיידקים ו2 archaebacteria. upregulation המסיבי של DPS בשלב נייח הופך אותו לחלבון nucleoid הקשורים הגבוהה ביותר בא לידי ביטוי של א &#39; coli בתנאים רעב 3, 4. בנוסף, DPS הוכח גם לשמר יכולת קיום חיידקים ויושרה DNA במהלך רבים לחצים שונים, כולל הרעבה, ריכוז ברזל גבוה, חשיפה לאור UV, הלם חום, וסטרס חמצוני 5, 6. מבחינה מבנית, DPS עצמי מקורבים לקומפלקס הומו-oligomeric יציב של 12 מונומרים, Which להרכיב לתוך קליפה חלולה כדורית. החלל הפנימי ~ 4.5 ננומטר הרחב נגיש לחוץ הממס דרך נקבוביות המאפשרים מעבר של מולקולות קטנות 7, והוא יכול לעקל מתכות mineralized כגון ברזל 8. ההשפעה המגנה של DPS נובעת ממספר הפעילויות ביוכימיות, הכוללות לא ספציפי DNA 1 מחייב, פעילות ferroxidase, ואחסון ברזל 8. מחקר מפורט של פעילויות ביוכימיות המיטיבות של DPS דורש הטיהור הראשון שלה. טיהור DPS היא הליך מורכב, שיש להפריד DPS לא רק מחלבונים אחרים, אלא גם מכל ה-DNA מאוגד 7. תהליך הטיהור האופטימלי שלנו משתמש בטכניקות נפוצות רבות, בהיקף של שתי עמודות החלפת יונים וצעד ממטרים אמוניום סולפט. חילופי חיץ כמה יש צורך, כעקורים מרוכזים מאוד יכולים לזרז את הפתרון בתנאי מלח נמוך. ברגע שהחלבון DPS כבר מטוהר, זה עשוי להיות מיושם למבחנים שמודדים ישירות את פעילותה ferroxidase 8, stoichiometry-DNA מחייב 9, ומנגנונים של ברזל מחייב 10. DPS המטוהר יש גם יישומים פוטנציאליים אחרים. המבנה הכדורי החלול היציב של DPS שימש כפיגומים לאחסון חלקיקים הידרופובי בתוך חלל החלבון 11 ואפילו כתא תגובה לסנתז חלקיקים מגנטיים רומן 12. היכולת המגנה של DPS לתווך נזק עקב מיני חמצן תגובתי יכולה להיות ברורה וישירה הפגינה באמצעות assay-DNA הגנת 13, 14. בהליך זה במבחנה, מינים רדיקליים מיוצרים כאשר הברזל מזרז השפלה H 2 O 2 דרך הכימיה פנטון. רדיקלים אלו באופן ישיר לפגוע בהווה DNA בתגובה ויכולים להשפיל אותו לחלוטין בריכוזים גבוהים. שתי פעילויות מרכזיות עשויות DPS הן במישרין לנטרל את ההשפעות של Fentייצור רדיקלי בתיווך. DPS מוריד את ריכוז ברזל קטליטי באמצעות מינרליזציה, צורך את חמצן זמין בתהליך. בנוסף, ל-DNA מחייב DPS פוטנציאלי עלול להגן עליו מפני נזק פיזי קיצוני ומתעבה אותו לתוך נפח קטן יותר עם שטח פנים פחות תגובתי. שילוב של שני מאפיינים אלה הופך את הגנת ה-DNA assay גם מתאים לצורך מדידת פעילות DPS מגן. Assay הגנת ה-DNA הוא צדדי למדי ויכול לשמש למגוון רחב של יישומים מעבר לאפיון DPS. ניזק של רדיקלים הוא צורה נפוצה של מתח בתאים, וחלבונים רבים ושונים וכימיקלים המשמשים כדי לנטרל אותו. העיקרון הכללי של assay, תוך שימוש בשלמות הדנ&quot;א כסמן לנזק של רדיקלים, ניתן להשתמש בו בשילוב עם כמעט כל תגובה קיצונית לייצור או סוכן מנטרל. בין יתר, assay כבר השתמש בהצלחה כדי לקבוע תכונות אנטי חמצונישל ק תמצית paniculata לשימוש בתעשיית מזון 15, כדי לאפיין את ההשפעות של חומצת שתן בגישור נזק הידרוקסיל 16, ולהשיג תובנות חדשות על תפקודם של חלבוני רגולטור 17 תעתיק פרווה. למרות שימושים רבים של assay במסמכים שפורסמו, מצאנו כי אופטימיזציה רבות וצעדים לפתרון בעיות נדרשו, מה שהופך את הקמת assay בפעם הראשונה תהליך מייגע שלא לצורך לחוקרים רבים. הפרוטוקול אנו מציגים במאמר זה מטרתו להסיר את המכשול הזה לכניסה.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3)pLysS competent cells</td>
 <td>Promega</td>
 <td>L1195</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET-17b DNA</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>69663-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth powder</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L3022</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin sodium salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A0166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0378</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6758</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>BDH</td>
 <td>441476L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>Merck</td>
 <td>105033</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>VWR</td>
 <td>443824T</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E9884</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor Cocktail Set III</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>539134</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>DFF100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium sulphate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A4418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PD-10 Desalting Columns</td>
 <td>GE Healthcare LS</td>
 <td>17-0851-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SP-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S1799</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferrous Sulphate heptahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F8048</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>216763</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>475898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS solution</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>161-0418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethidium bromide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1510</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Static incubator</td>
 <td>Hettich</td>
 <td>INE500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Shaking Incubator </td>
 <td>New Brunswick Sc.</td>
 <td>Inova 44</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cooled centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5424</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell disrupter</td>
 <td>Constant Systems Ltd.</td>
 <td>TS2/40/AA/AA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FPLC Purifier</td>
 <td>General Electric</td>
 <td>AKTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airtight vials</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>EW-08918-85</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe needles</td>
 <td>BD</td>
 <td>305128</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipettes</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

application of an in vitro dna protection assay to visualize stress mediation properties of the dps protein

סטרס חמצונים הוא תוצר לוואי בלתי נמנע של חיים אירוביים. חמצן מולקולרי הוא חיוני לחילוף חומרים יבשתיים, אבל זה גם לוקח חלק במספר רב של תגובות מזיקות בתוך אורגניזמים חיים. שילוב של חילוף חומרים אירוביים וברזל, שהוא תרכובת חיונית אחרת לכל חיים, זה מספיק כדי לייצר רדיקלים דרך הכימיה פנטון ולבזות מרכיבים תאיים. השפלה ה-DNA היא לטעון את התהליך המזיק ביותר מעורב רדיקלים תאיים, כתיקון DNA הוא רחוק מלהיות טריוויאלי. Assay שהוצג במאמר זה מציע שיטה כמותית למדידה ולהמחיש את ההשפעה של מולקולות ואנזימים בניזק לדנ&quot;א רדיקלי בתיווך. Assay הגנת ה-DNA הוא כלי פשוט, מהיר, וחזק לאפיון במבחנה של מאפייני ההגנה של חלבונים או חומרים כימיים. זה כרוך בחשיפת DNA לתגובת חמצון מזיקה והוספת ריכוזים שונים של המתחם של עניין. הצמצום או הגדלה של נזק לדנ&quot;א כפונקציה של ריכוז תרכובת אז דמיין באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה. במאמר זה אנו מדגימים את הטכניקה של assay הגנת ה-DNA על ידי מדידת התכונות המגנות של חלבון ה-DNA המחייב מהתאים מורעבים (DPS). DPS הוא מיני פריטין כי הוא מנוצל על ידי יותר מ -300 מיני חיידקים כדי להילחם בעוצמה גורמי לחץ סביבתי. כאן אנו מציגים פרוטוקול טיהור DPS ואת התנאים האופטימליים להערכת assay הגנת ה-DNA על ידי DPS.

תהליך הטיהור לעקורים שתוארו כאן הוא מאוד לשחזור. DPS טיהור על פי הפרוטוקול המתואר, באמצעות 2 ליטר של א &#39; תרבות coli כנקודת התחלה, בדרך כלל תניב 2.5 מ&quot;ל של חלבון המכיל 12 DPS בריכוזים שבין 5 ו -12 מיקרומטר. זמני אינדוקציה ארוכים יותר (4 שעות) נראים להפחית השונות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein at JoVE.com

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

חלבון ה-DNA מחייב מהתאים מורעבים (DPS) ממלא תפקיד מכריע במאבק נגד לחץ חיידקים. מאמר זה עוסק בטיהור<em&gt; א coli</em&gt; DPS והפרוטוקול<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay מדגים הגנת DPS בתיווך של ה-DNA מפירוק על ידי מיני חמצן תגובתי.

יישום של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay הגנת ה-DNA כדי להמחיש את מאפייני גישור לחץ של חלבון DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

application-an-vitro-dna-protection-assay-to-visualize-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

11.1K Views.  Delft University of Technology. חלבון ה-DNA מחייב מהתאים מורעבים (DPS) ממלא תפקיד מכריע במאבק נגד לחץ חיידקים. מאמר זה עוסק בטיהור א coli DPS והפרוטוקול במבחנה Assay מדגים הגנת DPS בתיווך של ה-DNA מפירוק על ידי מיני חמצן תגובתי.

Video: Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

במבחנה Invasion FluoroBlok גידול Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic information including active site concentrations and intrinsic rate constants that govern macromolecular function. In case of enzymes, for example, transient or pre-steady state measurements identify and characterize individual events in the reaction pathway, whereas steady state measurements only yield overall catalytic efficiency and specificity. Individual events such as protein-protein or protein-ligand interactions and rate-limiting conformational changes often occur in the millisecond timescale, and can be measured directly by stopped-flow and chemical-quench flow methods. Given an optical signal such as fluorescence, stopped-flow serves as a powerful and accessible tool for monitoring reaction progress from substrate binding to product release and catalytic turnover1,2.
Here, we report application of stopped-flow kinetics to probe the mechanism of action of Msh2-Msh6, a eukaryotic DNA repair protein that recognizes base-pair mismatches and insertion/deletion loops in DNA and signals mismatch repair (MMR)3-5. In doing so, Msh2-Msh6 increases the accuracy of DNA replication by three orders of magnitude (error frequency decreases from ~10-6 to10-9 bases), and thus helps preserve genomic integrity. Not surprisingly, defective human Msh2-Msh6 function is associated with hereditary non-polyposis colon cancer and other sporadic cancers6-8. In order to understand the mechanism of action of this critical DNA metabolic protein, we are probing the dynamics of Msh2-Msh6 interaction with mismatched DNA as well as the ATPase activity that fuels its actions in MMR. DNA binding is measured by rapidly mixing Msh2-Msh6 with DNA containing a 2-aminopurine (2-Ap) fluorophore adjacent to a G:T mismatch and monitoring the resulting increase in 2-aminopurine fluorescence in real time. DNA dissociation is measured by mixing pre-formed Msh2-Msh6 G:T(2-Ap) mismatch complex with unlabeled trap DNA and monitoring decrease in fluorescence over time9. Pre-steady state ATPase kinetics are measured by the change in fluorescence of 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl)ethyl)amino)carbonyl) coumarin)-labeled Phosphate Binding Protein (MDCC-PBP) on binding phosphate (Pi) released by Msh2-Msh6 following ATP hydrolysis9,10.
The data reveal rapid binding of Msh2-Msh6 to a G:T mismatch and formation of a long-lived Msh2-Msh6 G:T complex, which in turn results in suppression of ATP hydrolysis and stabilization of the protein in an ATP-bound form. The reaction kinetics provide clear support for the hypothesis that ATP-bound Msh2-Msh6 signals DNA repair on binding a mismatched base pair in the double helix.
F. Noah Biro and Jie Zhai contributed to this paper equally.

Msh2-Msh6 is responsible for initiating repair of replication errors in DNA. Here we present a transient kinetics approach towards understanding how this critical protein works. The report illustrates stopped-flow experiments for measuring the coupled DNA binding and ATPase kinetics underlying Msh2-Msh6 mechanism of action in DNA repair.

יישום הופסק זרימה שיטות קינטיקס לחקור את מנגנון הפעולה של חלבון תיקון DNA

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

האסיפה והיישום של &#39;טבעות Shear&#39;: מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

תצפית כימות התנהגות החיזור של נמטודות פיינווד,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...