א Ozcan תודה מכיר את התמיכה בפרס לנשיאות קריירה המוקדם עבור מדענים ומהנדסים (PECASE), של משרד לחקר צבא (נרו) בפרס חוקר צעיר, הקרן הלאומית למדע (NSF) פרס קריירה, משרד מחקר של צי (ONR) פרס חוקר צעיר ומכונים הלאומיים לבריאות (NIH) בפרס במאי החדש ממציא DP2OD006427 ממשרדו של המנהל, המכונים הלאומיים לבריאות.

בסעיף זה, אנחנו מציגים את פרוטוקולי הניסוי למיקרוסקופיה טלפון נייד המבוססת השדה רחב פלואורסצנטי 13 ופלטפורמת cytometry Opto-fluidic הדמית 14. אנו נשתמש בחרוזי ניאון ותאי דם לבן שכותרתו fluorescently לבחון פלטפורמות הדמיה אלה. הכנת א טלפון סלולרי מבוססת פלורסנט מיקרוסקופ שדה רחב וCytometer תזרים ההדמיה Opto-fluidic מיקרוסקופ הטלפון סלולרי המבוסס השדה רחב פלורסנט או cytometer זרימה מורכבת משני חלקים עיקריים: טלפון מצלמה וOpto-fluidic הקומפקטי תוספת על קובץ מצורף. 1. טלפון המצלמה בעוד שהטכניקות שהוצגו חלות על כמעט כל טלפון מצלמה, בחר סוני אריקסון Aino כבסיס למכשירים אלו. תא הטלפון הזה יש ~ חיישן 8 מגה פיקסל RGB CMOS ולהתקין עליו ומובנה בעדשה שיש אורך מוקד (ו 1) של ~ 4.65 מ&quot;מ. </p&gt; 2. קובץ מצורף Opto-fluidic למיקרוסקופיה פלורסנט שדה רחב הקובץ המצורף האופטי הוא תוכנן על ידי Autodesk ומודפס במדפסת עלית 3-D ממד באמצעות חומר תרמופלסטי ABSplus. בתהליך הדפסה זה, חומרי מודל ותמיכה מחוממים בראש חול בתוך המדפסת ומופקדים שכבה אחרת שכבה על בסיס דוגמנות. כאשר שלב זה הושלם, חומר העזר ניתן להמס, עוזב מודל 3D חזק של אב הטיפוס הרצוי העיצוב המצורף האופטי שלנו מורכב מנוריות (אורך גל במרכז ~ 470 ננומטר, Digikey), מסנן פלסטיק (# NT54-46, אדמונד אופטיקה), מגש מדגם, ועדשת f 2 Plano-קמורה מ&quot;מ = 15 (# NT45-302, אדמונד אופטיקה). כל הנוריות ומסנני פלסטיק ניתן לשנות בקלות על בסיס הספקטרום של fluorophores. הצעדים להרכבה מצורפת Opto-fluidic זה כוללים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את העדשה בקובץ המצורף בעמדת בעל העדשה הספציפית שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מסנן הפלסטיק על מגש המסנן וחלק אותו לקובץ המצורף, או קלטת מסנן הפלסטיק מול עדשת המצלמה בטלפון נייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מגש LED לקובץ המצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שקופיות זכוכית המדגם למגש המדגם. חלק את מגש המדגם לקובץ המצורף. להתמודד עם הנוריות כלפי המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ המצורף על הטלפון הסלולרי, כך שעדשה הנוספת היא ישירות במגע עם עדשת המצלמה בטלפון נייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתג על קובץ המצורף כדי להפעיל את הנוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת מדגם עניינים עם יחידת המצלמה בטלפון סלולרי באמצעות &quot;מצב הלילה&quot; שלה. </li></ol> 3. קובץ מצורף Opto-fluidic לCytometry ההדמיה פלורסנט כאשר יש צורך להקרין כמויות גדולות של דגימות נוזליות לצורך זיהוי של אירועים נדירים, מכשיר cytometry זרימת optofluidic יכול להיות עדיף. אנחנו יכולים לשנות את עיצוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי השדה הרחב שלנו ולהפוך אותו לcytometer זרימה, Wכאן ערוץ microfluidic מבוסס PDMS משמש כדי לספק דגימת נוזל הרף דרך נפח ההדמיה. קובץ המצורף האופטי גם הוא תוכנן על ידי Autodesk ומודפס על ידי מדפסת ממד 3 D-עלית. הוא גם מורכב מנוריות (אורך גל במרכז ~ 470 ננומטר, Digikey), מסנן פלסטיק (# NT54-46, אדמונד אופטיקה), מגש מדגם, וaspherical עדשה (F = 4.5 מ&quot;מ) (מוצר # C230TME-; Thorlab). הצעדים להרכבה מצורפת Opto-fluidic זה כוללים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח Aspherical העדשה לקובץ המצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מסנן הפלסטיק על מגש המסנן וחלק אותו לקובץ המצורף, או קלטת מסנן הפלסטיק בחזית עדשת המצלמה של הטלפון הסלולרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק את ערוץ microfluidic לאותו הקובץ מצורף Opto-fluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ המצורף על הטלפון הסלולרי, כך שהעדשה הנוספת היא ישירות במגע עם עדשת המצלמה בטלפון נייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתג על קובץ המצורף כדי להפעיל את הנוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר microfluidic ערוץ למשאבת המזרק ולספק דגימת הנוזל לתוך מכשיר microfluidic בקצב זרימה קבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם סרט של תאים / חלקיקים זורמים דרך ערוץ microfluidic שימוש במצב הווידאו של המצלמה בטלפון סלולארי הניאון. </li></ol> לדוגמא הכנת B. 4. הכנת דוגמאות פלורסנט מייקר חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזי ניאון עם קוטר 10 מיקרומטר (חרוזים אדומים: מוצר # F8834 עירור / פליטת 580nm/605nm; חרוזים ירוקים: מוצר # F8836: עירור / פליטת 505nm/515nm) נרכשים מInvitrogen (קרלסבד, קליפורניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב 10 μl של חרוזי ניאון ירוקים, 10 μl של חרוזי ניאון אדומים עם 40 μl מי DI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Place10 μl של תערובת חרוז זה בשקופית זכוכית באמצעות micropipette ולשים שקופית כוס נוספת בחלק העליון שלו כדי להפוך את מבנה כריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מבנה הכריך הזה למגש המדגם וחלק אותו לקובץ המצורף בטלפון נייד. </li&gt; </ol> 5. הכנה של תאי דם לבן שכותרתו fluorescently <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח חומצה SYTO16 תיוג ערכת גרעין ניאון (# S7578, טכנולוגית חיים) ונאגר מלוחים פוספט (PBS) יצא מהמקרר ולהביא אותם לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימת דם כל μl 200 מצינור איסוף דם EDTA לצינור פוליסטירן מ&quot;ל 1.5 (# 05-408-129, הפישר סיינטיפיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר חיץ תאי דם אדום lysing (# R7757, סיגמה אולדריץ) למדגם 200 μl כל הדם והמערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות, סרכזת דגימת דם lysed ולהסיר את פתרון supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי הדם הלבנה הגלולה לחיץ PBS 200 μl ועדינות לערבב אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף SYTO16 פתרון 5 μl 1 מ&quot;מ לדגימת תאי הדם הלבנה. עטוף את המדגם ברדיד אלומיניום ולדגור בסביבה חשוכה ל~ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם שוב. Supernatant מוסר ומתויג תא הכדורי דם הלבן מחדשמושעה לחיץ PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח μl 5-10 כותרת דגימת נוזל תא דם לבנה כדי להחליק כיסוי, והנח את תלוש עטיפה שנייה בחלק העליון של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את שקופית המדגם דחוק למגש המדגם ותדמיתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הטלפון סלולרי. </li></ol> לחלופין <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רף לספק את תאי דם הלבן שכותרתו fluorescently דרך ערוץ microfluidic באמצעות משאבת מזרק אוטומטית, גם בעת הקלטת סרט מיקרוסקופי ניאון של תאים זורמים באמצעות המצלמה בטלפון סלולרי במצב וידאו. אנחנו צריכים גם להדגיש כי משאבה ניידת מופעלת סוללת מזרק או אפילו כוח המשיכה יכולה להיות מנוצלת כדי להסיע את הזרימה דרך ערוץ microfluidic. </li></ol>

<ol>
	<li>Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry for BioTechnology. , (2005).</li><li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , (2001).</li><li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to optical microscopy. , (2010).</li><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+deeper+than+microscopy:+the+optical+imaging+frontier+in+biology.">Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.</a> Nature Methods. 7, 603-614 (2010).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+fluorescence+nanoscopy.">Toward fluorescence nanoscopy.</a> Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+structured-illumination+microscopy:+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution.">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM.</a> Nature Methods. 3, 793-796 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+near-field+microscopy+of+DNA+at+sub-10+nm+resolution.">Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution.</a> Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).</li><li>Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+standing+wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy:+superresolution+imaging+of+single+molecular+and+biological+specimens.">Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens.</a> Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).</li><li>Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -. W., G&#246;r&#246;cs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+without+lenses:+achievements+and+remaining+challenges+of+wide-field+on-chip+microscopy.">Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy.</a> Nature Methods. 9, 889-895 (2012).</li><li>Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -. W., Tseng, D., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+and+compact+wide-field+fluorescent+imaging+on+a+cell-phone.">Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).</li><li>Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optofluidic+fluorescent+imaging+cytometry+on+a+cell+phone.">Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone.</a> Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).</li><li>Suzuki, S., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+Visualand+Graphics.">Computer Visualand Graphics.</a> Image Processing. 30, 32-46 (1985).</li><li>Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+enabled+detection+of+Escherichia+coli+using+a+cell-phone.">Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone.</a> Analyst. 137, 2541-2544 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Rapid-Diagnostic-Test+Reader+Platform+on+a+Cellphone.">Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone.</a> Lab on a Chip. 12 (15), (2012).</li><li>Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+signal+recovery+from+incomplete+and+inaccurate+measurements.">Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements.</a> Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).</li></ol>

ד&quot;ר Ozcan הוא המייסד של חברת סטארט אפ שמטרה למסחר את ההדמיה ממוחשבת וכלים מיקרוסקופים.

יש לנו הצגנו התוצאות האחרונות שלנו בטלפון סלולרי המבוסס מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב וזרימת cytometry הדמית Opto-fluidic שימוש קל משקל וקומפקטיים לצרף קבצי Opto-fluidic למצלמות טלפונים סלולריים. שימוש בפלטפורמה טכנולוגית זו אנו צלמנו אובייקטי ניאון לרבות חלקיקי מייקרו ותאי דם ל?...

מיקרוסקופיה וזרימת cytometry נמצאים בשימוש נרחב בטכניקות 1-12 במחקר ביו ומדעי, כמו גם אבחון קליני לספירה ואפיון של סוגי תאים שונים. עם זאת, מיקרוסקופים קונבנציונליים ומכשירי הזרימה cytometry הם יחסית מורכבים ויקרים, אשר מגביל את השימוש בם למעבדות מרכזיות מבוססות היטב בעיקר. לאחרונה פתחנו cytometry קומפקטי וקל משקל ניאון הדמיה ומיקרוסקופיה מכשיר משולב בטלפון סלולרי, 13,14 אשר מראה הבטחה לחסכוני לתרגם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, זרימת cytometry וטכניקות הקשורות לניתוח מייקרו לסביבות משאבים מוגבלים עבור טלרפואה יישומים שונים המשפיעים על בריאות העולמית. בתצורת optofluidic הזרימה cytometry (ראה איור 1C למשל ו1D), polydimethysiloxane ערוץ אישית מעוצב-(PDMS) מבוסס microfluidic הוא positioneד בחזית תא טלפון מצלמת היחידה, בי-דיודות פולט אור (LEDs) הן הקת מצמידות לשולי הערוץ. שבב microfluidic זה, יחד עם הנוזל בתוך המדגם, מהווה מוליך גל מישורי Opto-fluidic (מורכב מלמשל PDMS הנוזלי-PDMS), כך שאור העירור מונחה אחיד לשאוב את הדגימות שכותרת הניאון בתוך ערוץ מייקרו. פליטת הקרינה מן האובייקטים שכותרתו אלו, תאים למשל, הוא צלם עוד יותר באמצעות עדשה נוספת הונחה מייד אחרי הטלפון סלולארי מצלמת היחידה והוא ממופה על תחמוצת מתכת-סמיקונדקטור חיישן משלימת הטלפון סלולרי (CMOS) תמונה. מאז פליטת הניאון נאספת בניצב לנתיב אור העירור, מסנן קליטת פלסטיק זול מספיק כדי להסיר את אור העירור המפוזר ויכול לספק רקע הגון כהה תחום נדרש הדמית ניאון. שימוש בעיצוב דומה Opto-fluidic, אנחנו יכולים גם תמונת אובייקטי הניאון בstatic מצב (ראה איור 1A ו-1B), שבו חלקיקי הניאון הם דחוקים בין 2 כוס מחליק במקום זורם בתעלת microfluidic ופליטת חלקיקי ניאון ניאון מאלה שנתפסו על ידי חיישן CMOS הטלפון סלולארי תמונה לספירת חלקיקים ו אפיון. בהתבסס על דרישות שונות של יישומים, cytometry זרימה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב ניתן לבחור. לדוגמה, מכשיר cytometry זרימת טלפון נייד יכול להיות שימושי במיוחד לסינון כמויות גדולות של דגימות נוזליות (למשל כמה מ&quot;ל) לזיהוי של תאים או פתוגנים נדירים. בכתב יד זה אנו סוקרים כמה מהתוצאות האחרונות שלנו על שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכלי cytometry זרימת הדמיה בטלפון סלולרי באמצעות קבצים קומפקטיים וחסכוניים Opto-fluidic. ניתוח מייקרו אלה טלפון סלולרי מבוסס, cytometry ההדמיה ופלטפורמות חישה יכולים לספק הזדמנויות שונותלטלרפואה ונקודה של טיפול אבחון, במיוחד משפיע מאבקנו נגד אתגרי בריאות העולמיות באזורים מוגבלים משאבים של העולם.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-phone</td>
			<td>Sony</td>
			<td>Sony Ericsson Aino</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plano-convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td># NT45-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspherical lens</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td># C230TME-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>#NT54-46</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>#365-1201-ND</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>#P032-ND</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-408-129</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysing buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red fluorescent beads (10 &mu;m)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#F8834</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent beads (10 &mu;m)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#F8836</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td># S7578</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field fluorescent microscopy and fluorescent imaging flow cytometry on a cell-phone

מיקרוסקופיה פלורסנט וcytometry זרימה משמשות כלים נרחבים במחקר ביו ואבחון קליני. עם זאת מכשירים אלה באופן כללי יחסית מסורבלים ויקרים, מה שהופך אותם פחות יעיל בהגדרות המשאבים המוגבלות. פוטנציאלי כדי לטפל במגבלות אלה, אנו הוכחנו לאחרונה את השילוב של מיקרוסקופ שדה רחב ניאון וכלי cytometry זרימת הדמיה בתא טלפוני שימוש קל משקל קומפקטי, וקבצים מצורפים חסכוניים Opto-fluidic. בעיצוב cytometry הזרימה שלנו, תאים שכותרתו fluorescently סמוקים דרך ערוץ microfluidic שממוקם מעל יחידת המצלמה הקיימת בטלפון סלולרי. דיודות מופעלות סוללה פולט אור (LEDs) הן קת מצמידה לצד זה שבב microfluidic, אשר למעשה מתפקד כמוליך גל מצב מרובה לוח, שבו אור העירור מונחה אחיד כדי להלהיב את מטרות ניאון. המצלמה בטלפון סלולרי מתעדת סרט זמן לשגות של תאי הניאון זורמים דרךערוץ microfluidic, שם את המסגרות הדיגיטליות של הסרט הזה מעובדים כדי לספור את מספר התאים שכותרתו בתוך יעד הפתרון של עניין. שימוש בעיצוב דומה Opto-fluidic, אנחנו יכולים גם תמונת תאים אלה שכותרתו fluorescently במצב סטטי על ידי רבדה למשל את חלקיקי הניאון בין שתי שקופיות זכוכית ולכידה התמונות שלהם הניאון באמצעות המצלמה בטלפון סלולרי, שיכול להשיג רזולוציה מרחבית של דוגמה ~ 10 מיקרומטר מעל שדה של נוף גדול מאוד של ~ 81 מ&quot;מ 2. טלפון נייד זה מבוסס cytometry זרימת הדמית ניאון ופלטפורמה מיקרוסקופית עשויה להיות שימושית במיוחד בהגדרות משאבים מוגבלות, למשל לספירה של CD4 + תאי T כלפי ניטור של HIV + חולים או לגילוי של טפילי מים שמקורן במי שתייה.

עם שאיבת Opto-fluidic / ערכה (1C 1D ותרשימים) עירור שלנו, תאים שכותרתו fluorescently יכולים להיות מועברים באופן רציף לערוץ microfluidic באמצעות משאבת מזרק בזמן שהמצלמה בטלפון סלולרי מתעדת סרט זמן לשגות ניאון מיקרוסקופי של התאים זורמים. סרטי ניאון אלה לאחר מכן ניתן לנתח במהירות ב...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone at JoVE.com

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

אנו בודקים את התוצאות האחרונות שלנו על שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכלי cytometry זרימת הדמיה בטלפון סלולרי באמצעות קבצים קומפקטיים וחסכוניים Opto-fluidic. מכשירים הבוסס טלפון הסלולרי אלה מייקרו ניתוח עשויים להיות שימושיים לניתוח cytometric, כגון ביצוע משימות ספירת תאים שונות, כמו גם לתפוקה גבוהה הקרנה של דוגמה, דגימות מים בגדרות משאבים מוגבלות.

מיקרוסקופי שדה רחב פלורסנט וזרימת cytometry הדמית פלורסנט בטלפון סלולרי

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

wide-field-fluorescent-microscopy-fluorescent-imaging-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.5K Views.  University of California, Los Angeles. אנו בודקים את התוצאות האחרונות שלנו על שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכלי cytometry זרימת הדמיה בטלפון סלולרי באמצעות קבצים קומפקטיים וחסכוניים Opto-fluidic. מכשירים הבוסס טלפון הסלולרי אלה מייקרו ניתוח עשויים להיות שימושיים לניתוח cytometric, כגון ביצוע משימות ספירת תאים ...

Video: Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

פלורסנט מיקרוסקופית עצמים ללא עדשה על שבב

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

לוקליזציה וכימות יחסית של פחמן בתאים עם Multispectral הדמיה תזרים cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

סרטן השחלות האיתור באמצעות פוטואקוסטי זרימה Cy, לנסות

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

הכנה, מתן והערכה של ספיגה תאית ספציפית לרקמת in vivo של ליפוזומים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...