המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר דאגלס גץ (מחלקה להנדסת כימית Biomolecular, אוניברסיטת אוהיו) וד&quot;ר פביאן Benencia (מחלקה למדעים ביו, אוניברסיטת אוהיו) לדיונים מעמיקים וביקורת כתב יד. כמו כן אנו מודים לד&quot;ר כריסטופר Huppenbauer לדיונים מועילים טכניים (W. Nuhsbaum Inc). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (CBET-1,106,118) והמכונים הלאומיים לבריאות (1R15CA161830-01).

1. התקנת תוכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש StreamPix 5 תוכנת Multi-מצלמה עם מודול SimulPix או תוכנת הדמיה אחרת מסוגל איסוף ושילוב של תמונות שנתפסו על ידי מצלמות CCD מונוכרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דרישות מינימום עבור StreamPix 5 כוללות: מחשב מצויד בCore 2 Duo עם 2.4 GHz או יותר טוב עם GB זיכרון RAM 2 ומעלה. מצלמה נתמכת IEEE דיגיטלי או אנלוגית ולוכד תמונות תואמות. Windows XP/7/Vista 32 או 64 קצת. צג תומך ברזולוציה 1,024 x 768 ומעלה. מתאם גרפי עם ביצועים טובים 2D (יחידת פשע מאורגן להביע 16x או יותר מומלץ) וכונן דיסק קשיח 7,200 סל&quot;ד להקלטה בתצורת RAID-O. </li></ol> 2. התקנה של מערכת מצלמה כפולה מסוגלים שתי הדמיה בזמן אמת הצבע סימולטני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מפצל DC2 Photometrics פליטה, או התקן פיצול פליטת מצלמה כפולה דומה, למיקרוסקופ על ידי הזזה מתאם DC2 C-Mount ליציאת וידאו של MICRoscope כך שהדיור של dichroic במכשיר הוא נגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את שתי מצלמות CCD מונוכרום לתוך C-mount 1 נקבה והנקבה C-mount 2. מצלמות זהות עדיפות. ניתן להשתמש במצלמות דומות, אבל התאימות תלויה בחומרה פנימית, והכי חשוב חיישן CCD התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הדמיה כדי להציג תמונות משתי המצלמות. השלבים הבאים (2.3.1 - 2.3.4) יחולו על StreamPix 5 עם מודול SimulPix וצריכים להיות מותאמים לתוכנת הדמיה מרובה מצלמה אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> StreamPix פתוח 5 ובחר &quot;סביבת עבודה&quot; בסרט המשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;מנהל סביבת עבודה&quot; פתוח הממוקם בקצה הימני של המסך, ובחר באפשרות &quot;סביבת עבודה חדשה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתן שם מצלמה, בצע את התוכנה תבקש ממך לבחור חוטף מרשימה מולאה מראש. בחר את חוטף דגם המצלמה התאמה ולחזור לסביבת העבודה של המצלמה השנייה. לסביבת העבודה הממוזגת, חוזרים פעם נוספת, אבל &quot;כל המצלמות נמצאות בשימוש&quot; מ &#39;שגיאהessage יופיע. הודעה זו היא נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שסביבת העבודה הממוזגת נטענת, להקצות מצלמות מסביבת העבודה וסביבת העבודה של 1 2 לסביבת העבודה הממוזגת בפנל העגינה הממוקם בצד הימני של מסך הצפייה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר מצלמות במערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר מצלמות בשדה בהיר או ניגוד שלב עם רשת הכיול המסופקת על ידי היצרן באמצעות מטרת PlanApo 40X (או יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח אור לעיניות המיקרוסקופ, הנח את רשת הכיול מצופה המתכת שסופקה על ידי היצרן על הבמה מיקרוסקופ, ולרבע את הרשת על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את הרשת אל מוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקור, אבל לא להסיר, דיור dichroic ליישר מצלמה 1 (עוקפת מצלמה). להציג את הרשת ללא binning וללא autoscaling. למקד את התמונה באמצעות חיוג התאמת התמקדות ביציאת C-Mount 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את דיור dichroic לchanne הכפולמכשיר רכישת ליטר באופן מלא, כך שהתמונה מחולקת על ידי dichroic לשתי המצלמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את שלושה 5/64 &quot;להגדיר ברגים ולסובב את המצלמה השנייה על C-mount 2 הנקבה עד הנטייה של הרשת היא זהה בשתי התמונות. באמצעות חיוג התאמת דגש על C-mount נמל 2, להביא את התמונה ממצלמה 2 אל מוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את היישור באמצעות התמונה המשולבת בסביבת העבודה הממוזגת של תוכנת ההדמיה. זה מאפשר לראות שכבת pseudocolor זמן אמת של שתי התמונות של רשת הכיול. התאם את עמדות תמונה המשולבות רק באמצעות ידית R / L בצד ימין של DC2. התאם כפתור זה עד גבול אנכי ימין / שמאל של התמונות מיושרת במדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפתור U / D כדי להתאים את למעלה / למטה היישור של התמונה השנייה ועד לברי רשת אופקיים מיושרים כמו שצריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם במהלך למעלה / למטה יישור סיבוב מצלמה קל מתרחש בעיה, נכונה זו על ידי שחרור שלושה 5/64 scre אינץ &quot;ws למצלמה 2 ולסובב עד שהתמונה המוצגות מיושרת כהלכה. </li></ol></li></ol> 3. הכנת תאי הסרטן לפלייט במקביל תזרים לשכת הידבקות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20-BT תאי סרטן שד תרבות במדיום המינימום הכרחי (MEM) בתוספת להשלמת בינונית עם 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין על 37 מעלות צלזיוס ו.5.0% CO 2 תיארו 2 כמו בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים סרטניים קציר עם טיפול טריפסין לדלל ולספור תאים עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולהשעות את התאים ב10 7 תאים / מיליליטר באלבומין 0.1% מסרום שור (BSA) בDPBS עם סידן ומגנזיום (DPBS +). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים ראשוניים, CD24 אנטי אנושי בעכבר וחולדה מטוהר מטוהרת HECA-452 (אנטיגנים אנטי sialofucosylated), לריכוז אופטימלי שנקבע מראש ב0.1% DPBS + BSA. דגירה תאים למשך 30 דקות 9, 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 1,200 סל&quot;ד להשיג תא גלולה. ASPIלדרג נוגדן ראשוני, ולשטוף את התאים פעמיים עם 0.1% DBPS + BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים משני, עז אנטי העכבר IgG AlexaFluor 568 (פליטת מקסימום, 603 ננומטר), ועז אנטי עכברוש IgM AlexaFluor 488 (פליטת מקסימום, 519 ננומטר), לריכוז אופטימלי שנקבע מראש ב0.1% DPBS + BSA. דגירה תאים למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאי פעמיים ולהשעות ב0.1% DPBS + BSA ב10 6 תאים / מיליליטר ב0.1% DPBS + BSA. </li></ol> 4. הכנת התשתית לתגובתי פלייט במקביל תזרים לשכת הידבקות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את שני אורכים נפרדים של צינורות ליציאות הכניסה ויציאה של זרימת צלחת התא המקביל שמתאים בתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ. צינור אחד יתחבר למאגר של תאים שכותרתו תלויים ב0.1% DPBS + BSA והשני למשאבת המזרק, שייסוג נוזל בקצב זרימה שצוין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קו ואקום לתא הזרימה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את תא הזרימה מעל di תרבית רקמת 35 מ&quot;מsh מכיל monolayer של תאי השחלה אוגר הסיני מביע E-selectin (CHO-E). תאי CHO-E היו גדלו במדיום שלם MEM ב 37 ° C ו-CO 2 .5.0% 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את תא הזרימה ו / או אטם תא זרימה כדי להבטיח חותם ואקום נאות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת נוזל ממאגר, ניטור ההרכבה תא זרימה לחותם תקין ואין עדות חזותית של היווצרות בועת אוויר 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קאמרי הרכבה זרימה במיקרוסקופ (לייקה DMI 6000B) 1. </li></ol> 5. רכישת תמונה בשני צבעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח מקור לייקה EL-6000 אור הקומפקטי, או מכשיר דומה, כדי להפיק אור בעוצמה גבוה וזוג אותו לתוך ספר אור. שימוש במיקרוסקופ הפוכה כדי להעביר את האור הזה דרך קוביית מסנן שילוב, כלומר קוביית מסנן G / R (ירוק / אדום), כדי לעורר fluorophores של צבע / עוצמה רצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטחת דיור dichroic נמצא במצב הפעלה נכון (מדוכא) והוא לא במצב עוקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פועל מיקרוסקופ במצב הקרינה ובחר קובייה תקינה מסנן הקרינה (ירוק / אדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זמן החשיפה ולהשיג במצלמת 1 (אדום; 620 ± 60 ננומטר) ומצלמת 2 (ירוק; 535 ± 40 ננומטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדכא את dichroic כדי להשיג תמונות בשני ערוצי הפליטה האדומים וירוקים. השתמש assay תא זרימה עם תאים שכותרתו עם fluorophore האדום בלבד, ולקבל תמונה במסלול האדום על ידי התאמת זמן החשיפה של המצלמה 1 ב&quot; הגדרות חיות &quot;של תוכנת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את זמן החשיפה של מצלמה 2 לזמן החשיפה של המצלמה 1. אם תמונה שנצפתה בערוץ הירוק, חפצים לדמם דרכם בהווה ובזמן חשיפה בשתי המצלמות צריך להיות מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על זמן החשיפה מקביל במצלמה 1 ומצלמת 2, לצמצם את זמן החשיפה עד החפץ לדמם דרך הוא כבר לא נראה לעין במסלול הירוק. התאם את הרווח של המצלמה 1 כדי לשפר visibilit תמונהy במסלול האדום במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 5.4.1 - 5.4.3 עם תאים שכותרתו עם fluorophore הירוק בלבד, אך מגדיר את זמן חשיפה במצלמה 2 תאי תמונה במסלול הירוק בלי חפצים לדמם דרך במסלול האדום שנאסף על ידי מצלמה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדני Retitrate אם לא ניתן למנוע חפצים לדמם דרך 11, או אם זמני חשיפה של מצלמה 1 ומצלמת 2 שונים באופן מהותי כך שהתמזגו תמונות עשויות להיות temporally מתואמים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הדמיה כדי להציג תמונות שנתפסו בו זמנית משתי מצלמות CCD מונוכרום בניסוי תא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיזוג תמונות שנאספו משני המצלמות משתמשים במודול SimulPix של Streampix 5 או חבילת תוכנה חלופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהתאמות תיקון דיגיטליות בSimulPix או תוכנה חלופית כדי ליישר מרחבית תמונות הממוזגות, במידת צורך. ניתן לתקן תמונות עם מודול SimulPix לאופקי, אנכי, והתאמות סיבוב. </li></ol>

<ol>
	<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells.">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).</li><li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=carcinoma+cell+glycolipids,+integrins,+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow.">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li><li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions.">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li><li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands.">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li><li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion:+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces.">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li><li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow:+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion.">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li><li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions.">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li><li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells:+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways?.">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?.</a> Front. Oncol. 2, 103 (2012).</li><li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Importance+of+Titrating+Antibodies+for+Immunocytochemical+Methods.">The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2001).</li><li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells.">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li><li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules.">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li><li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development.">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li><li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system:+a+custom+technology+platform+for+high-speed,+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses.">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li><li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions.">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li><li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה יש הרזולוציה מרחבית, זמנית, ואופטית הדרושות כדי ללכוד תמונות באיכות גבוהות ביישומים שבם תא או תנועה מולקולרית הוא מהיר. ביצירת תוצאות הנציג, פרמטרים במערכת הכפולה פליטת המצלמה הפיצול, כולל הגדרות תוכנה והגדרות מצלמה, היו מותאמים כד?...

שיטות לניתוח של מולקולות על פני התא, כגון immunostaining, להעסיק בדיקות הכימיות מצומדת לfluorophores, המאפשרים זיהוי של מולקולות מטרה. הדמיה תא חי ומבחני הידבקות תא המבוסס על זרימה הידרודינמית נרשמים בדרך כלל עם מצלמות CCD מונוכרום נועדו ללכוד תהליכים פיסיולוגיים ברמה התאית ו / או מולקולרית 1, 2. מצלמות אלה הן מאוד רגישות, לספק שיעורים מהר מסגרת (יותר מ 30 פריימים לשניה), ולספק פתרון זמני חריג (עקב שיעורים מהר מסגרת וזמני חשיפה קצרה). עם זאת, מצלמות מונוכרום יכולות רק ללכוד ערוץ פליטה בודד (גילוי fluorophore יחיד) כדי לאסוף את התמונות. ניתן לשלב מערכות פיצול פליטת מצלמה אחת כדי ללכוד ערוצי פליטה מרובים, אך לעתים קרובות לצמצם את שדה הראייה ודורשות באותו זמן חשיפה להדמיה את כל הערוצים. כדי ללכוד את קשת צבעים מלאים מהתאים שכותרתו עם multiple fluorophores, מצלמה צבע יכולה לשמש כחלופה. עם זאת, מצלמות צבע הם בדרך כלל לא מסוגלים לספק הרזולוציה של הזמן רצוי להדמית תא חי ביישומים מסוימים. מכשיר הדמיה נוסף נחוץ ליישומים בהם יש יתרון לתאי חי תמונה באורכי גל מרובה תוך שמירה על רזולוציה גבוהה זמנית. יישום ניסיוני ראש הוא assay המקביל תזרים צלחת קאמרי ההידבקות, שבו תאים הם perfused בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית על מצע פוטנציאלי תגובתי 1, 3. תאים בזרימה המבטאים את המולקולות בתא שטח ספציפיות עשויים לדבוק ומתגלגלים על המצע, כגון monolayer תא לבטא מולקולות הדבקות או חלבונים adsorbed משטח תאיים מטריקס 4, 5. תאים מתגלגלים עשויים לעבור תנועה סיבובית וtranslational בחלקיקים שניים. תכונות מולקולריות במתגלגלים ותאים חסיד, כגון צבירים של מולקולות בתא שטח, יש גם potentiאל לעבור ארגון מחדש פעיל על פני התא. לכן, מערכות הדמיה חייבות לספק פתרון זמני חריג (30 פריימים לשניה ומעלה ו&quot; קרובים לאפס &quot;זמני חשיפה) כדי ליצור רצף תמונה הממחיש את התקדמות צעד אחר צעד של התא מתגלגל 6, 7. מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה הן מסוגלים לעמוד בדרישות אלה לתאי הדמיה שכותרתו עם fluorophores מרובה. מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה לפצל וערוצי הקרינה מסנן לשתי מצלמות דומות כדי ללכוד בו זמנית שתי תמונות מרחבית זהות אבל fluorophore הספציפי תוך שמירה על השדה המלא של תצוגה. טכנולוגיה זו מאפשרת השוואה ישירה של התמונה שצולמה בזמן אמת בכל ערוץ ומאפשרת למשתמש לעבור במהירות בין דגמי מצלמות עם יכולות הדמיה שונות. תכונה זו שימושית לביצוע התאמות להגדרות לכידת תמונה במצלמה אחת שטוב יותר לאפשר למערכת כדי ללכודfluorophores עם עוצמות שונות, תקופות חיים, ומקדמי הכחדה 8. יחד עם תוכנת הדמיה, מערכות פיצול כפולה מצלמה פליטה מאפשרות הקלטה של מבחני הדמיה תא חיים באורכי גל מרובים בזמן אמת ועשויות לשפר את מבחני במבחנה המשתמשים בקרינה כדי ללמוד על התנהגות תא.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

מיקרוסקופיה immunofluorescence צבע רב כדי לזהות מולקולות ספציפיות בקרום התא יכולה להיות בשילוב עם מבחני זרימת צלחת קאמריים במקביל לחקור את המנגנונים המסדירים את הידבקות תא בתנאי זרימה דינמיות. לדוגמא, ניתן perfused תאים הסרטניים שכותרתו עם fluorophores מרובה על פני מצע שעלול להיות תגובתי למודל מנגנונים של גרורות סרטניות. עם זאת, מערכות מצלמה אחת מרובה ערוצים ומצלמות צבע חסרונות תערוכה ברכישת תמונה לניתוח תא חי בזמן אמת. כדי להתגבר על המגבלות האלה, השתמשנו מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה כדי ללכוד בו זמנית רצפי תמונה בזמן אמת של תאים שכותרתו fluorescently בתא הזרימה. אורך גל מסנן מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה מוגדר נע לשתי מצלמות CCD בצבע אחד, ובכך בו זמנית ללכוד שתי תמונות מרחבית זהות אבל fluorophore הספציפי. בהמשך לכך, תמונות אחד ערוצי psuedocolored משולבות לתוך אחדזמן אמת התמזג רצף שיכול לחשוף מולקולות מטרה מרובות בתאים עוברים במהירות על פני אזור של עניין.

Assay הידבקות זרימת צלחת קאמרית במקביל היה בשימוש כדי להדגים מערכת כפולה פליטת המצלמה פיצול שבו זמנית נתפסה רצפי תמונה בזמן אמת בשני ערוצי פליטה (איור 1). מערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה זוהתה 20-BT תאים שכותרתו fluorescently עם CD24 אנטי אנושי וHECA-452 (גילוי אנטיגנים sialof...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion at JoVE.com

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה למיקרוסקופ פלואורסצנטי שני צבעים ליצור רצפי תמונה בזמן אמת עם רזולוציה אופטית ובזמן חריג, דרישה של מבחני תא חי מסוימים, לרבות מבחני זרימת צלחת קאמרית הידבקות מקבילות. כאשר תוכנה היא מועסק למזג תמונות מערוצי פליטה רכשו בו זמנית, רצפי תמונת pseudocolored מיוצרים.

במקביל לכידת תמונות בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה: יישומים לסלולריים הידבקות

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Views.  Ohio University.  מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה למיקרוסקופ פלואורסצנטי שני צבעים ליצור רצפי תמונה בזמן אמת עם רזולוציה אופטית ובזמן חריג, דרישה של מבחני תא חי מסוימים, לרבות מבחני זרימת צלחת קאמרית הידבקות מקבילות. כאשר תוכנה היא מועסק למזג תמונות מערוצי ?...

Video: Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

כף יד Photoacoustic קליניים מערכת הדמיה עבור בזמן אמת לא פולשנית הדמיה בעלי חיים קטנים

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

באתרו מיקרוסקופיה לקביעת בזמן אמת של מורפולוגיה תא חד בBioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

ייצור מצופים Nafion, מופחתת גראפן תחמוצת/Polyaniline Chemiresistive חיישן על צג ה-pH בזמן אמת במהלך התסיסה מיקרוביאלי

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...