עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH RO1-EY019951 (AAF), חברת אילינוי למניעת עיוורון (מרכז קהילתי יהודי, משרת בחיל אוויר), קרנות בלתי מוגבלות למחלקת עיניים ממחקר למניעת עיוורון (RPB), ניו יורק וRPB הרפואי הסטודנטים המלגה גרנט (JCC).

1. הכנת רשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate עין העכבר. שימוש ביד אחת, לפתוח את עפעפי העין, כך שהעין גלויה. ביד השנייה, תוך שימוש במלקחיים מעוקלים כלפי מעלה (מול מעוגל), להפעיל לחץ על היבטים עליונים ונחותים של המסלול עד שבולט הגלובוס. בעדינות לסגור מלקחיים בחלק האחורי של העין ולהרים בתנועה רציפה לenucleate העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העין עם 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין במשך לפחות 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיניו את המקום בפתרון PBS בצלחת פטרי קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רשתית בזהירות מתחת למיקרוסקופ, מקפידים להימנע מגרימת דמעות גדולות. הפוך את חתך ראשוני בקרנית עם מספריים לנתיחה. ואז, תוך כדי לחיצה על אזור החתך עם מלקחיים ישרים, השתמש במספריים כדי לגזור לאורך הגבול של הקרנית ולובן עין הסרת הקרנית. באמצעות מלקחיים מעוקלים וישרים עדינים, בזהירות לקלף את לובן העין ורחוקה מהרשתית אל עצב הראייה דמית העין. צעד זה דורש סבלנות כמולשחרר את הרשתית במהירות יכול לגרום לדמעות. הסר את העדשה וכל קשתית עודפת ופסולת מהרשתית 16. </li></ol> 2. מים שוטפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשתית מניחה בצלחת ומכסים במים (כ 500 μl, מסונן עם לפחות מסנן מיקרומטר 45) 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מים כל דקות-1 שעות 30, לפחות 4-5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר למשך לילה במים עם טלטול עדין בטמפרטורת חדר. </li></ol> הערה: שלבי הכביסה הם מאוד חשובים כפי שהוא לסייע להפריד בין שכבות רשתית עצביות מכלי הדם. 3. טריפסין דייג&#39;סט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים ואת רשתית דגירה בתמיסה של 3% טריפסין (Difco 1:250) ב0.1 מ &#39;טריס חיץ (pH 7.8) בשעה 37 ° C עם רעד עדין לא. טריפסין עיכול יושלם כאשר הרקמה מתחילה להראות סימני ההתפוררות (כ 1.5 שעות). שים לב: יש להימנע מטלטול מהירכמו זה יכול לגרום נזק לכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות, פיפטה טריפסין אל נפרד גם באמצעות מיקרוסקופ כדי להימנע מלגעת ברשתית. טריפסין עודף זה יכול לשמש מאוחר יותר, כאשר מניפולציה של כלי מתחת למיקרוסקופ, בשלב 4.3. </li></ol> 4. הפרדת כלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מים מסוננים לרשתית. לאחר מכן, אנסה לקלף את קרום הגבלה הפנימי עם מלקחיים, תוך שימוש במספריים במידת צורך. Shake עם תסיסה עדינה במשך 5 דקות. זהירות, פיפטה את המים מתחת למיקרוסקופ, כדי למנוע פגיעה ברשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שוטף למים (5 דקות כל אחד) כדי לסייע בחינם ברשת של כלי מרקמת הרשתית חסיד. שוטף מים הושלם כאשר יש לא מעט פסולת שנותרה במים לאחר שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניפולציות זהירות תחת מיקרוסקופ לנתיחה כעת זקוקה לחופשיים יותר את הרשת של כלי דם. להלן כמה טכניקות שימושיות, אשר עשוי לשמש ברצף או individually כדי להשיג את התוצאה הרצויה על בסיס העדפה טכנית: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה μl 200, פיפטה בזהירות מים למעלה ולמטה בסמוך לכלי שיט, שנושב בכלי מים, גורם לתסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה μl 200, פיפטה טריפסין למעלה ולמטה כדי לעזור קירות מעיל של פיפטה. ואז, בזהירות פיפטה רשת הכלי כולו למעלה ולמטה פעם אחת כדי לעזור לשבור את הרקמה ללא כלי דם. הערה: מרכוז קצה פיפטה בעצב הראייה ולא את הקצוות של רשת כלי הדם יכול גם למנוע מהם להידבק כלי דם ועד לקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בעדינות כלי דם עם מלקחיים עדינים מחוץ למים כדי לסלק רכיבים שאינם בכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצעדים הנ&quot;ל אינם עובדים, להוסיף טריפסין לרשתית כדי לעזור לשבור את הרקמה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות. לאחר מכן, להסיר טריפסין וחזור על שלבי 4.1-4.3. </li></ol></li></ol> &lt;חזקה&gt; הערה: הקפד מעיל כל המכשירים שבאים במגע עם הכלים בטריפסין (למשל פיפטה הקצה, מלקחיים). זה יעזור למנוע הדבקה של כלי דם לציוד. 5. לדמיין את כלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של מים לשקופית נקי. בעזרת פיפטה μl 200 או מלקחיים, להעביר את כלי מתעכלים אל תוך המים. ודא שטוח כלי דם ההר הוא פרש. מתח הפנים של המים מסייע לנפרש רשת כלי דם החברה שקופה. אם הרקמה לא להתפתח, להוסיף מים נוספים ובעדינות לנער את השקופית כדי להקל על התגלגלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את עודפי מים באיטיות רבה על ידי pipetting או בעזרת מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר שקופיות להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם שקופיות באמצעות פרוטוקול מתאים גם עם PAS / hematoxylin או H &amp; E כתם. הערה: PAS / hematoxylin שימושי לזיהוי קיר כלי וגרעיני הסלולר; H &amp; E היא שימושית עבור דemonstration של RBC גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים ולעלות (Permount הרכבה בינונית). </li></ol>

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model;+SHR/N:Mcc-cp+rat.">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li><li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution.">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li><li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models.">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li><li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db/db+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio.">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

טריפסין עיכול הוא שיטה סטנדרטית על מנת להעריך בכלי הדם של הרשתית. למרבה הצער, זה מאתגר מבחינה טכנית ויכול לגרום לשיעור גבוה של אובדן דגימה אם לא מבוצע כהלכה. יתר על כן, ההליך הוא קשה במיוחד בעכברים, מה שיכול להגביל את היישום של טכניקה זו במודלים של בעלי החיים הגנטיים הנ...

לדמיין את כלי הדם של הרשתית היא גישה מאוד חשוב לנתח את המנגנונים של מחלות עיניים שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית. זה מאפשר לאדם להעריך את ליקויים בכלי הדם המוקדמים, כולל microaneurysms, ניוון נימים, ואובדן pericyte 8,9. עד כה, היו מספר טכניקות שפותחו לניתוח בכלי הדם ברשתית. טפטוף של צבעים שונים נעשה שימוש כדי לסמן את הכלים, אבל כולם חלקו מגבלות דומות. לעתים רחוקות הזרקה מדגישה את כלי הדם ברשתית כולה, אלא אם כן ניתנו בלחץ גבוה, המסכן את פקיעת ופגיעה בכולים 1. Immunostaining של האנדותל של כלי דם שבכותרת fluorophore G isolectin B4 (אלקסה פלואוריד 594 מצומדות; I21413; Invitrogen; 1:100 דילול) וmounts שטוח רשתית יכול להדגיש את הארכיטקטורה הכוללת של כלי, אבל בלי הדמיה מפורטת של נימי דם, קרומי מרתף וpericytes . צוין על ידיפרידנוואלד שיכול להיות מודגש על ידי צביעת כלי שטוח mounts של רשתית עם תקופתי חומצה שיף (PAS) או hematoxylin ו eosin (H &amp; E) מכתים 10. עם זאת, הצביעה הייתה לא ספציפית לכלי, והדגישה את הרקמה ללא כלי הדם, כמו גם, ולכן קשה להבדיל בין הכלים. בשנתי ה -1960, קוגן וKuwabara פיתחה את הטכניקה לעכל טריפסין שעשה את זה קל יותר לדמיין את כלי הדם ברשתית על ידי לעכל את מרכיבי nonvascular של הרשתית 1. מאז אותו הזמן, לעכל טריפסין הפכה את שיטת תקן זהב בניתוח בכלי הדם של רשתית 2-5. עם זאת, חשוב לציין כי טכניקות חלופיות אחרות כדי לבודד את כלי הדם כבר תאר. השימוש בתמוגה האוסמוטי נעשתה שימוש כדי לבודד את כלי הדם ומאפשר מחקרים ביוכימיים של רקמת 11,12, אך ההליך לא נעשה שימוש כדרך עיקרי ללימוד אנטומי. שיטת הדפסת הרקמות כברמשמש לבודד חלקים גדולים של microvasculature ומאפשר את היכולת ללמוד ארכיטקטורת electrotonic של כלי הדם 13. בתאוריה, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את השינויים אנטומיים, כמו האיכות של כלי היא גבוהה. עם זאת, הוא רק הצליח לבודד מקטעים של רשת כלי הדם כולו. למרות ששיטות אלה לא יכולים להחליף טריפסין לעכל, חשוב לציין שיש להם יתרונות וחסרונות שונים ומשלימים בעניין זה. שיטת עיכול טריפסין היא מאתגרת מבחינה טכנית וקשה לביצוע באופן עקבי 6,7. יתר על כן, כבר ציין כי טריפסין לעכל קשה במיוחד במודל של עכברים, במיוחד אם אחד רצונות כדי לשמר את הארכיטקטורה הכללית של כלי הדם ברשתית 6,7. אתגרים כוללים (1) יתר מערכת העיכול של הרשתית שגורמת לאובדן של שניהם בכלי הדם, כמו גם רקמה ללא כלי דם, (2) מתחת לעיכול, הדורשיםנתיחה מכאנית נרחבת אשר עלולה להוביל לנזק של כלי המיטה, (3) הפרדה לקויה של הרקמות שאינן כלי דם מכלי הדם שמוביל לכתמים שאינם ספציפיים. כמה כתבי יד הדגישו האתגרים הללו, אבל אף סיפקו פרוטוקול מפורט ועקבי כדי להתגבר עליהם 14,15. כתב יד זה יציג מתודולוגיה צעד אחר צעד המפרטת את הטכניקה לביצוע לעכל טריפסין על רשתיות עכבר וחולדה עם עצות ספציפיות בטיפול בשלבים הקשים במיוחד. סקירה סכמטית מוצגת באיור 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

טריפסין עיכול הוא שיטת תקן זהב לניתוח בכלי הדם ברשתית 1-5. זה מאפשר הדמיה של כל הרשת מורכב של כלי תלת ממדים ברשתית ונימי דם על ידי יצירת שטוח הר דו ממדי של כלי הדם המחוברים בין הערוצים לאחר עיכול של המרכיבים שאינם בכלי הדם של הרשתית. זה מאפשר לאדם ללמוד שינויים פתולוגיים בכלי הדם שונים, כגון microaneurysms, ניוון נימים, והאנדותל נורמלי ליחסי pericyte. עם זאת, השיטה היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד בעכברים, שהפך למודל של בעלי החיים באופן נרחב ביותר שקיימים כדי ללמוד את הרשתית בגלל הקלות של מניפולציות גנטיות 6,7. בעיני העכבר, זה קשה במיוחד להסרה מלא של רכיבים שאינם כלי הדם, תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם ברשתית. נכון להיום, קיים מחסור בספרות המתארת ​​את הטכניקה לעכל טריפסין בפירוט אניn העכבר. כתב יד זה מספק מתודולוגיה צעד אחר צעד מפורט של לעכל טריפסין ברשתית עכבר, תוך מתן גם טיפים על שלבים לפתרון בעיה קשים.

התוצר הסופי של הליך מוצלח הוא בעלת הר בכל הרשת של כלי הדם ברשתית העכבר, עם שמרה על האדריכלות, מוכתם גם PAS / hematoxylin או H &amp; E, כפי שמוצג באיורים 2-4. הבחנה ברורה של תאי האנדותל וpericytes ניתן לראות, כפי שמוצגת באיור 3. ברשתית, הגרעינים של תאי האנדותל הם סגלגלים א...

Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

טריפסין עיכול הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר לניתוח כלי הדם ברשתית. כתב יד זה מתאר את השיטה בפירוט, כולל שינויים מרכזיים כדי לייעל את הטכניקה ולהסיר את הרקמה ללא כלי הדם תוך השמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם.

טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

trypsin-digest-protocol-to-analyze-retinal-vasculature-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K Views.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. טריפסין עיכול הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר לניתוח כלי הדם ברשתית. כתב יד זה מתאר את השיטה בפירוט, כולל שינויים מרכזיים כדי לייעל את הטכניקה ולהסיר את הרקמה ללא כלי הדם תוך השמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם.

Video: Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

עצב הראייה קראש פגיעה דגם Murine לחקר הישרדות רשתית תא גנגליון

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

ניתוח Morphometric סעיפים רשתית

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

תיאור חזותי של Dissection של מערכת כלי הדם המוחית ומשטח קרום המוח הקשורים ודמה עין המקלעת ממוח חולדה

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

הדמיה וידאו ומפות Spatiotemporal לנתח תנועתיות מערכת העיכול של עכברים

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and hypothalamus that supplies blood to the brain and surrounding structures. It has been implicated in several cerebrovascular disorders, including cerebral amyloid angiopathy (CAA)-associated vasculopathies, intracranial atherosclerosis and intracranial aneurysms. Studies of the molecular mechanisms underlying these diseases for the identification of novel drug targets for their prevention require animal models. Some of these models may be transgenic, whereas others will involve isolation of the cerebro-vasculature, including the CoW.The method described here is suitable for CoW isolation in any mouse lineage and has considerable potential for screening (expression of genes, protein production, posttranslational protein modifications, secretome analysis, etc.) studies on the large vessels of the mouse cerebro-vasculature. It can also be used for ex vivo studies, by adapting the organ bath system developed for isolated mouse olfactory arteries.

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a detailed method pointing out critical steps is provided with recommendations for optimization to achieve consistently successful occlusion rates across different genetically modified mouse strains. The RVO mouse model consists primarily of the intravenous administration of a photosensitizer dye followed by laser photocoagulation using a retinal imaging microscope attached to an ophthalmic guided laser. Three variables were identified as determinants of occlusion consistency. By adjusting the wait time after rose bengal administration and balancing the baseline and experimental laser output, the variability across experiments can be limited and a higher success rate of occlusions achieved. This method can be used to study retinal diseases that are characterized by retinal edema and hypoxic-ischemic injury. Additionally, as this model induces vascular injury, it can also be applied to study the neurovasculature, neuronal death, and inflammation.

Here, we describe an optimized protocol for retinal vein occlusion using rose bengal and a laser-guided retinal imaging microscope system with recommendations to maximize its reproducibility in genetically modified strains.

אופטימיזציה של מודל העכבר לחסימת ורידים ברשתית כדי להגביל את השונות

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...