פרוטוקול זה מספק שיטה אימונוהיסטוכימית מפורטת לזיהוי, אימות ומיקוד של קספאזות רלוונטיות מבחינה תפקודית ברקמות מורכבות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחקור תפקודים ספציפיים של קספאז-9 אפופטוטיים ולא-אפופטוטיים מסוג התא, וניתן ליישם אותה על רקמות מורכבות אחרות ועל קספאזות מעניינות. הבנת הפונקציות של קספאזות יכולה לסייע בהרחבת הידע הקיים בביולוגיה של התא ויכולה גם להיות יתרון בזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות בשל מעורבותן במחלות.
התחילו לכמת את רמות הקספאזה באמצעות תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של מקטעי רשתית מוכתמים. לשם כך, גרור את קבצי התמונה של 405, 470, 555 ו- 640 ערוצים לקונסולה של פיג'י. לחצו על כרטיסיות תמונה, צבע ומיזוג ערוצים כדי להקצות צבעים לקבצים.
לאחר מכן דחוס את אוסף Z על ידי לחיצה על אוסף התמונות ועל פרויקט Z. בחר את סוג ההקרנה כעוצמה מרבית. פתח את ממשק הערוץ בלחיצה על התמונה ואחריה על הכלי ערוץ צבע.
לאחר מכן, פתח את ממשק הבהירות והניגודיות. כדי לבחור את הפרמטרים לכל ערוץ, עבור אל כרטיסיית הערוץ ובחר ערוץ אחד. מקם את הסמן על גבי הרקע והוסף ביאורים לערך הפיקסלים.
לאחר מכן שים את הסמן על התא המבוטא caspase והוסף ביאורים לערך הפיקסלים. כדי לבדוק את הפרמטרים, עבור אל ממשק הבהירות והניגודיות ולחץ על בחר. חבר את הערך המינימלי המוצג או את ערך הפיקסלים של התא המבוטא caspase.
לאחר מכן חבר את הערך המרבי המוצג או את ערך הפיקסלים ברקע לפני שתלחץ על אישור. בחרו את התמונות האקראיות מרקמה עיוורת וחזרו על בחירת הפרמטרים בכל ערוץ כדי לבדוק את הפרמטרים של כל הערוצים. לאחר הגדרת הפרמטרים, פתח את קובצי התמונה ודחוס את אוסף Z.
הוסף את פרמטרי הבהירות והניגודיות עבור ערוץ caspase ואת האיזולקטין עבור ערוץ סמן כלי הדם. השתמש בכלי הנקודה וכמת את מספר אזורי כלי הדם החיוביים באמצעות קולוקליזציה של סמן כלי הדם עם ביטוי קספאז כקריאה של אזורים חיוביים. לאחר מכן באמצעות ווים כסמן של אזורים עצביים חיוביים, לכמת את מספר אזורי כלי הדם החיוביים.
הוסף ביאורים לערכים בגיליון אלקטרוני לכל תמונה וממוצע הערכים לפי מקטע. ממוצע ערכי המקטע, שיהיו הקריאה לכל עין. הפרוטוקול זיהה את הלוקליזציה התאית של הקספאזות ואת שכבות הרשתית העצביות שבהן מתבטאות הקספאזות.
חתך הרשתית איפשר הדמיה של גרעיני הרשתית בשכבת הגנגליון הרשתית או RGL, שכבה בין-גרעינית או INL, והשכבה הגרעינית החיצונית או ONL כאשר הם מוכתמים בווים. בחתך הרוחב, כלי הדם ברשתית נראו מנותקים ונפרדים ומספקים את שכבות הפרספקס בין ה-RGL ל-INL ובין ה-INL ל-ONL. חתכי הרשתית זיהו גם את ה- caspase-9 המווסת מאוד, יום אחד לאחר חסימת ורידים ברשתית.
עיכוב ה-caspase-9 היה יעיל יותר בהפחתת ביטוי ה-caspase-7 העצבי בעכברי נוקאאוט של תאי אנדותל, מה שאימת את הרלוונטיות התפקודית של האנדותל caspase-9. הניתוח המייצג הראה כי עיכוב פעילות caspase-9 חסם פרמקולוגית את הביטוי caspase-7 לאחר חסימת ורידים ברשתית. הצלחת הטכניקה מסתמכת על הכנה קפדנית של רקמות, כמו גם IHC והדמיה מיקרוסקופית כדי להבטיח עקביות, תוקף ואמינות של הנתונים.
ניתן לשלב שיטה זו עם ניתוח כתמים מערביים להשוואה כמותית למחצה של איתות קספאז. הטכניקה סיפקה את השלבים לחקר היעילות של גישה טיפולית המכוונת נגד caspase-9 פעיל ב- RVO. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על רקמות אחרות, כולל המוח.
