אנו מודים Sankalpi Warnasooriya ואיימי הומבולדט לקריאה ולעריכה ביקורתיות של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד אנרגיה (DE-SC0008769) והקרן הלאומית למדע (IOS-1,127,017).

1. צמיחתו של ס &#39; viridis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התנאי בתא גידול ליום 31 ° C/22 ° C (יום / הלילה), חשוך שעות light/12 שעות 12, 50% לחות יחסית עם טיפול לפני עלות השחר של 15 ° C 8:30-9:00 PM. (איור 1). בתנאים אלה, ש &#39; A10.1 viridis לוקח בערך 21-22 ימים מזריעת הזרעים לanthesis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא דירות (4 x 9 תאים) עם מטרו מיקס 360 ולהסיר תא אחד להשקיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים בקלילות ערפל על פני קרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרוע זרעים על פני השטח של קרקע, זרע אחד לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את הזרעים בשכבת האדמה (כ 0.5 סנטימטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערפל על פני השטח של קרקע ומים דירות מלמטה. שמור השקיה מלמטה לאחר זריעת הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל צלב שיבוצע לפחות שלושה צמחים ישמש כהורים נשיים ותשעה צמחים ישמש כהורים ממין זכר. זריעת זרעים צריכה להיות מעד כמו כל הצמחים לא יפרחו באותו היום. sowi זרעng מומלץ בכל יום על פני תקופה של שלושה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשקות את צמחי 1-2 פעמים ביום, שהיא תלויה בגודל של הצמחים ומצב קרקע. עודף מים בקרקע אינם נוחים לצמיחה אופטימלית של הצמחים, ועלולים להוביל לצמיחת פטרייה בקרקע ונזק של רקמת עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדשן את הצמחים פעמיים בשבוע, באמצעות ג&#39;ק 15-16-17 בריכוז של 100 עמודים לדקה. </li></ol> 2. זמירה וסימון של מכבד לפני הסירוס - יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעתי אחר הצהריים או בשעתי הערב לפני ההאבקה, להעביר צמחים מחדר הצמיחה למעבדה (טמפרטורה (T): 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית (RH) 21.79% ± 1.15%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר panicles העיקרי שיש פרח 1 עד 1/3 של פרחים על המכבד שכבר פרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחקר זה ארבעה תחומים בתוך המכבד מוגדרים כדלקמן (איור 2 א; קצה, באמצע דיסטלי, אמצע ובסיס פרוקסימלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אידיאלי, choosמכבד ea עם 1-5 פרחים שפרחו, לנתק את קצה המכבד (קצה הדיסטלי), ולהסיר את כל הפרחים בסעיפי האמצע והבסיס הפרוקסימלי באמצעות מספריים באביב או במלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מכבד יש כ 1/10 עד 1/5 של פרחים שפרחו, לחתוך את הקצה ולקצץ פרחים מבסיס המכבד, רק לשמור על חלקו התחתון של אמצע דיסטלי והחלק העליון של אמצע הפרוקסימלי גיזום נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מכבד יש כ 1/4 עד 1/2 של פרחים שפרחו, לנתק את החלק האמצעי דיסטלי ורק לשמר את החלק האמצעי הפרוקסימלי לזמירה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כירורגית לקצץ בקלילות את הזיפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הפרחים שפרחו וכל הפרחים לא בוגרים עוזבים כ 20-30 פרחים / מכבדים שמופצים באופן שווה באזור (איור 3). לתרגל טיפול כדי לשמר את הזיפים באזור שיהיה האבקה על מנת להגן על פרחים מפני נזקי חום אפשריים.עבור כל spikelet, לשמור פלוראט העליון הבשל ביותר. רוב פלוראט העליון יהיה הסתברות גבוהה יותר של anthesis בזמן ההאבקה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן צד אחד של כל פרח עם סמן קבע אדום ולרשום את מספר הפרחים על המכבד (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגל המכבד עם הפרטים הבאים: התאריך של סירוס, המשך הזמן והטמפרטורה שבה הסירוס מתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמכבד חיתוך, להסיר את כל tillers של כל צמח כדי להבטיח הקצאה מחדש של משאבים רבים יותר לפיתוח של מכבד הראשי. </li></ol> 3. סירוס עם מים טבילה חמה - יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את אמבט מים ל48 C ° ± 0.1 מעלות צלזיוס במשך הטיפול בחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לכופף את panicles הגזוז וטובל אותם במים חמים ב48 מעלות צלזיוס למשך 3-6 דקות. השתמש בזהירות שלא לשבור את הגזע של מכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול להיות טבול כ 3-4 panicles togeיס בפעם אחת, תוך שמירה על המרחב מספיק בין panicles להתפלגות אחידה של חום. זה חיוני כדי להטביע את כולו מכבד במים חמים במהלך טיפול בחום. עלה הדגל (עלה subtending המכבד המספק חומרים מזינים למכבדים) לא צריך לבוא במגע עם מים חמים כדי למנוע נזקי חום לרקמת עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהסירוס מתבצע למשך תקופת הרצויה, להסיר panicles מאמבט המים ובעדינות לנער את המים ממכבדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקית לחם מחורר מיקרו אישית כדי לכסות באופן מלא את המכבדת המסורס ולאבטח אותו עם טוויסט עניבה. יכולות להיות מותאמים אישית שקיות לחם מחוררות מיקרו בהתאם לגודל של מכבד (כולל וידאו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם צמחים חזרה בחדר הצמיחה עד ליום הבא. </li></ol> 4. מעבר / האבקה אחרי הסירוס - יום 2 ויום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 9:00 בבוקר ביום 2 ויום 3, להעביר את הנקבה (מסורס) וmalדואר הורים מחדר הצמיחה למעבדה (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%) כדי לבצע צלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתבונן ולהוסיף עוד נקודה אדומה לפרחים שפרחו או פורחים באמצעות סמן קבע אדום. רשום את המספר הכולל של פרחים פרחו למכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התאריך של האבקה ואת שמו של הורה הזכר על התג כדי לעקוב אחר מה צלבים מבוצעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לזמן השיא של anthesis בהורים ממין זכר. בתנאי החדר שלנו (איור 1) פרחים על panicles של הורה הזכר מתחילים פתיחת סינכרוני סביב 10:10. מרגע פתיחה של פרחים, exsertion של מאבקים ושחרורו של אבקה המלאה יתרחש לאחר 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב האידיאלי להאבקה הוא השלב שבו האבקה של הורה הזכר הוא שוחרר. הפרחים ייסגרו לאחר 20 דקות משחרור אבקה. לפיכך, את משך הזמן לanthesis הוא כ 40 דקות מרגע פתיחה של זרימהERS. הצבע של שינויי אבקה מלבנים צהבהבה עד חום על פני תקופה של כ -30 דקות לאחר הפרח נסגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל האבקה מייד לאחר מאבקים לבנים צהבהבים גלויים על פרחיו של ההורה ממין הזכר. Pollinations מבוצע ביום 2 ויום 3 באמצעות אחת משלוש השיטות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האבקה מכבדת למכבדת: באמצעות מכבד מנותק אחד כזכר, לשפשף בעדינות המכבדת יחד עם מכבד המסורס כדי להקל על האבקה וזורקים המכבדים הגברי, כדי למנוע זיהום. חזור על התהליך עד שכל ההאבקה מכבדת מסורס כבר האבקה על ידי 2-3 panicles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאבק להסטיגמה האבקה: באמצעות מלקחיים להרים פרח שפורח עם מאבקים לבנים צהבהבים או להרים מאבקים ופיזי לגעת בסטיגמה של הפרח על ההורה הנקבי. השתמש פרח אחד מהורה הזכר להאביק פרח אחד על מכבד המסורס. חזור על p ההאבקהrocess עד שכל סטיגמה על מכבד המסורס כבר האבקה על ידי כמה (כ 2-3) פרחים / מאבקים. לובש מגן מגדלת יעבד הראות טובה יותר כדי לבצע את ההאבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין pollinations של הורים גבריים שונים, לטבול את המלקחיים ב95% אתנול ואחריו מנגב עם Kimwipes כדי למנוע זיהום עקב לשאת מעל האבקה בין צלבים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכבד מחייב: לאחר סירוס, בחר 3-4 panicles על הורה הזכר שיפרח ביום המחרת. לאגד אותם יחד עם מכבד המסורס של ההורה הנקבי באמצעות טוויסט עניבה. מקם את מכבד המסורס מעט מתחת המכבד של ההורה ממין הזכר. הנח שקית נייר שקופה מעל panicles ולאבטח את התיק בבסיס עם אטב נייר. זה עשוי להסתיים ביום 2 ברגע שpanicles של הורה הזכר להתחיל anthesis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן הפריחה בבוקרו של יום 2 ויום 3, קפיצי או לנער את שקית נייר השקופה לfacilהאבקת itate. תמשיך קפיצי או לנער panicles כל 15 דקות לאורך כל תקופת anthesis בבוקר (בין 9:00 AM-11: 00:00). הסר panicles של הורה הזכר לאחר האבקה ולתייג את הצד הנגדי של הפרחים פרחו על מכבד המסורס. רשום את מספר הפרחים פרחו על המכבד של כל הורה נקבי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההאבקה שבוצעה, במקום שקית לחם מחורר מיקרו אישית כדי לכסות את מכבדת של ההורה הנקבי ומאובטח בבסיס באמצעות טוויסט עניבה לאחר ההאבקה עד קצירת זרע. </li></ol> 5. קצירת זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי קציר לאחר 2 שבועות (14-16 ימים) מיום ההאבקה. מקם את התג באותה השקית של הזרעים. זרעים שיש סימנים אדומים בשני הצדדים מייצגים את הזרעים שהביאו מהצלב הגנטי המבוקר. אלה צפויים להיות צאצאי outcross. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבטל את כל זרעים בלי סימונים אדומים כפי שהם מייצגיםהזרעים הנובעים מפרחים חדשים שפותחו לאחר סירוס. זרעים עם סימנים אדומים רק בצד אחד צפוי לייצג את הזרעים כתוצאה מהאבקה עצמית כפי שהם לא היו פורחים בזמן שבו הצלבים מבוקרים בוצעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים יבשים ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים במייבש זרע. זרעי חנות מיובשות במעבדה (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%) או בתא זרע (T: 4.0 ° C ± 1.0 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 20% ± 1%). </li></ol>

<ol>
	<li>Bennetzen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genome+sequence+of+the+model+plant+Setaria.">Reference genome sequence of the model plant Setaria.</a> Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+foxtail+millet+(Setaria+italica)+provides+insights+into+grass+evolution+and+biofuel+potential.">Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential.</a> Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).</li><li>Li, P., Brutnell, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setaria+viridis+and+Setaria+italica,+model+genetic+systems+for+the+Panicoid+grasses.">Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses.</a> J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).</li><li>Brutnell, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setaria+viridis:+a+model+for+C4+photosynthesis.">Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis.</a> Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).</li><li>Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxtail+millet:+a+sequence-driven+grass+model+system.">Foxtail millet: a sequence-driven grass model system.</a> Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).</li><li>Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+artificial+hybridization+of+foxtail+millet+[Setaria+italica+(L.)+Beauv.].">Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.].</a> Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).</li><li>Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+in+the+Breeding+of+Millet+(Setaria+Italica+(L.)+Beauv.).">Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.).</a> Agron. J. 27, 963-970 (1935).</li><li>Willweber-Kishimoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+relationships+in+the+genus+setaria.">Interspecific relationships in the genus setaria.</a> Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).</li><li>Chang, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+flowering+and+hybridization+technique+in+Setaria.">Studies on flowering and hybridization technique in Setaria.</a> Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).</li><li>Darmency, H., Pernes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+wild+Setaria+viridis+(L.)+Beauv.+to+improve+triazine+resistance+in+cultivated+S.+italica+(L.)+by+hybridization.">Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization.</a> Weed Research. 25, 175-179 (1985).</li><li>Sakai, S., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+hybridization+of+Setaria+italica+by+hot+water+treatment.">Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment.</a> Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).</li><li>Malm, N. R., Rachie, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Setaria millets: A review of the world literature S.B. , 513-529 (1971).</li><li>Miyaji, Y., Samura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+atmospheric+humidity+on+flowering+and+pollination+in+Setaria+italica.">The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica.</a> Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).</li><li>Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+RFLP-based+maps+of+foxtail+millet,+Setaria+italica+(L.).">Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.).</a> P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).</li><li>RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+in+Setaria+italica+(Beauv.),+the+Italian+millet.+Part+I.">Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I.</a> Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).</li><li>Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthesis+of+Millet,+Setaria+Italica+(L.)+Beauv.">Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv.</a> Agron. J. 29, 845-853 (1937).</li><li>Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+for+inflorescence+variation+between+foxtail+and+green+millet+(poaceae).">The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae).</a> Genetics. 169, 1659-1672 (2005).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

חשיבות של טיפול לפני עלות השחר כדי להשיג תדירות גבוהה של צאצאי outcross זה חיוני שיהיה לי anthesis סינכרוני מאוד של הורי זכר ונקבה. בתחילה, אנו רכב על אופניו משטרי טמפרטורה והאור (31 ב° C/22 ° C, יום / לילה) ומשמשים ס A10.1 הצטרפות viridis לכל pollinations. בתנאים אלה, רוב הפרחים לפתוח מוקדם בבוקר לפני שהטמפרטורה עולה ליום 31 ° C, אם כי כמה פרחים פתוחים באופן אקראי בין 8:00 8: 12:00. מחקרים קודמים בס italica מצביע על הזמן של יום, מיקום והעונה תורמים לשונות בanthesis 7,15,16. סילס et al. 6 ציינו כי anthesis היה קשור עם שינויים מהירים בטמפרטורה ולחות, אבל לא עם טמפרטורה נמוכה ולחות גבוהה, כשלעצמה, כפי שסוכם במחקרים קודמים 7,15. לכן, אנו מועסקים טיפול קר לפני עלות השחר של 15 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות (מ 8:30 AM-9: 12:00) לחקותהמצב טרום זריחה הטבעית. טיפול קר לפני עלות השחר זה סייע בסנכרון anthesis בהורים. הבחנו כי למרות הגדרת התא לרמות לחות היחסית של 50%, הלחות היחסית בתוך החדר עלתה לרמה מעל 70% ככל שהטמפרטורה ירדה מ 22 ° C עד 15 מעלות צלזיוס והמשיכה להישאר מעל 70% עד לטמפרטורה עלה בהדרגה ל 31 ב° C לאחר 9:30 בבוקר. בשעת 9:00 בבוקר, מסורס הורים נשיים וצמחים של הורה זכר מובאים למעבדה (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%). פרחים של הורי גברים מתחילים פתיחה סביב 10:10, והאבקה יכולה להתבצע בשעה 10:30 AM-11: 12:00. רשימה מפורטת של כל חומרים כימיים והציוד מסופקת בטבלה 2. חשיבותה של הכנה מכבדת לסירוס בתנאי החדר במחקר זה (איור 1), משך הפריחה מכבדת העיקרית נע בין2-3 ימים. בדרך כלל, פרחים ממוקמים באמצע הדיסטלי של התפרחת (איור 2 א) proximally הראשון ופתיחה מקדימה פתוח וdistally. המספר האידיאלי של פרחים כדי להישמר על המכבד הוא 20-30. זהירות יש לנקוט בעת ההסרה של פרחים בשלה, כך שרק פרחים מפותחים (הפרח העליון או הגדול ביותר על spikelet 17) נשמרים. תיוג עם סמן אדום בשני הצדדים של הפרחים מסייע להבחין ביעילות צאצאי outcross משוערת מזרעים מפרחים חדשים שפותחו לאחר סירוס. בנוסף, חשוב להשאיר את הזיפים על panicles לפני הסירוס כדי להגן על הפרחים מפני נזקי חום רבים, עם זאת, כאופציה, הם יכולים להסיר לאחר סירוס באמצעות מספריים באביב על מנת להקל האבקה, במיוחד כאשר מכבד מחייבים טכניקה היא מועסק (2C דמויות ו2 ד). טמפרטורה אופטימליתמשך טיפול ד לטיפול במים חמים הבסיס לסירוס באמצעות טבילה במים חמה הוא שהאבקה היא רגישה יותר לחום מאשר משטח סטיגמות. עם זאת, משך הזמן והטמפרטורה של טיפולים חום עשויים להשתנות בין מינים והצטרפויות Setaria. באופן כללי, טמפרטורה גבוהה יותר עם זמן קצר יותר לטיפול או לטמפרטורה נמוכה יותר בזמן טיפול ארוך יותר תהיה לה ההשפעה על סירוס. זה כבר דווח כי טיפול בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות 10 או 47 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות 14 ס שניתנו אבקת italica שאינו ברת קיימא, אבל את היעילות של טיפולים אלה לא נקבע. פיתחנו הפרוטוקול שלנו בעקבות ההשערה כי תחת טמפרטורה ואת משך זמן אופטימליים של טיפול, אבקת פרחים של כל הפרחים שמרה על ההורה הנקבי יהיה שאינו בת קיימא תוך סטיגמות יישארו פתוחה. עם זאת, לאחר השוואה וניתוח ההשפעות של כמה טמפרטורות ותקופות טיפול (טבלה 1), מצאנו כי הרגישות לטיפול בחום משתנה בין הפרחים שמרו על כל מכבד, ובכך שקשה לחסל את הזרעים כתוצאה מהאבקה עצמית לחלוטין. אנו מסיקים כי היעילות בייצור צאצאי outcross היא הגדולה ביותר, כאשר טיפולים מבוצעים ב48 מעלות צלזיוס במשך 3-6 דקות בס A10.1 הצטרפות viridis. זמן שיא של anthesis והפריה הדדית כאשר הפרחים מגיעים לבגרות והם עומדים לפתוח, מאבקים הם לבנים בצבע צהבהב ואבקה נשפכה בהקדם מאבקי exsert מהפרחים 8. מאבקים הופכים בהדרגה חום לאחר האבקה נשפכה כפרחים מתחילים להיסגר. שוחרר פעם אחת, את הכדאיות של אבקה אינה ידועה. לכן, זה קריטי להשתמש באבקה מפתיחה או פרחים טריים פתחו בהורה הזכר בהקדם האפשרי. בתנאי החדר שלנו (איור 1), רוב floweRS של הורי גברים מתחיל לפתוח בשעת 10:10 בבוקר והפרחים נפתחו לשפוך אבקה בשעת 10:30 PM. לכן, החלון הרצוי לביצוע האבקה הוא 10:30-11:00. סטיגמות יישארו מחוץ לglumes אחרי פרחים קרובים ועשויות להיות פתוח לאבקה. זה כבר נצפה בעבר ואישר בס italica שסטיגמות הן פתוחים במשך כ 48 פתיחת הודעה פרח-HR על ידי סילס et al. 6, ולכן חשוב לpanicles התיק הבא טיפול בחום ולאחר ביצוע צלבים מבוקרים. כאמור לעיל, אנו ממליצים pollinations ביצועים בשני יום 2 ויום 3 שלאחר סירוס. שיטות להאבקה החוקרים השווינו את היעילות של שלוש טכניקות האבקה. אם פרחים פורחים לא מגבילים, האבקה מכבדת למכבדת היא הטכניקה היעילה ביותר ותניב מספר גדול יותר של צאצאי outcross. אם panicles הפורח מגביל, תדירות גבוהה יותר של oצאצאי utcross יופקו כאשר נעשה שימוש בשיטת מאבק ל- הסטיגמה. יש לנו להשיג צאצאי outcross משתי השיטות בהצלחה. שיטת &quot;מחייב panicles&quot; נעשתה שימוש בחציית ס italica 6 אבל מצאנו בשיטה זו כדי להיות השיטה היעילה לפחות כמו חלון הזמן לשפיכת אבקה של הורה הזכר הוא קצר. יתר על כן, יש פחות שליטה על האבקה והזיפים על ס panicles viridis עשוי גם לעכב את התנועה של אבקה על גבי משטח סטיגמות. קצירת זרע, ייבוש ואחסון לאחר קציר, צריכים להיות מיובשים זרעים ב30-33 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. Anthecium יש להוציא עבור מכתים גאס, במידת צורך. זרעים צריכים להיות מאוחסנים במקום יבש, קריר (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%) עבור אחסון לטווח קצר (פחות משנתיים) או בתא זרע (T: 4.0 10 ° C ± 1.0 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 20% ± 1%) עבור אחסון לטווח ארוך.תנאי אחסון לקויים עלולים לגרום שיעורי כדאיות נמוכים 8. יש לנו ציינו כי שיעור הנביטה של ס A10.1 viridis הוא כ -5%, כאשר נזרע 4 ימים לאחר הקציר, אך ניתן להגדיל 90-96% לאחר האחסון במעבדה (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%) ל110 ימים לאחר קציר ואחריו ריבוד של שלושה ימים ב-80 ° C לשבור תרדמת זרעים. לריבוד ב -80 מעלות צלזיוס, ניתן להציב זרעים יבשים בכלי אטום (צינור למשל מיקרו צנטריפוגות או מעטפת מטבע בשקית פלסטיק אטומה) והמשיכו ב-80 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים לפני השתילה. לאחר 16 חודשים של אחסון במעבדה (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%), עדיין ניתן להשיג אחוזי נביטה של ​​90-95%. בנוסף, כדי לשבור את תרדמת, יכולים להיות מיובשים זרעים ב30-33 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים לאחר קציר, ולאחר מכן ניתנו ריבוד של שלושה ימים ב-80 מעלות צלזיוס ואחרי הסרתanthecium לפני השתילה. לאחר טיפולים אלה, שיעורי נביטת זרעים של עד 33% יכולים להיות מושגת. יתרונות, מגבלות ושינויים אפשריים כאן אנו מספקים פרוטוקול הסטנדרטי הראשון לביצוע צלבים בס viridis A10.1 באמצעות טיפול בחום לסירוס. בניגוד לסירוס פיזי, פרוטוקול זה הוא פחות פולשני וקל יחסית כדי להקים במעבדה. בדרך כלל זה לוקח בערך 15 דקות לקצץ מכבד אחד ויכול להיות מטופח -15 panicles וחצה / אדם / יום. בהנחה ממוצעת של 3-5 צאצאים / מכבד outcross ניתן לשחזר בתנאים מותאמים, סך של 45-75 צאצאי outcross יכול להיות מיוצר על ידי אדם אחד ביום אחד. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על חוצה במינים Setaria אחרים, אם כי אופטימיזציות נוספות תהיה סבירה. אם חלל חדר הצמיחה מוגבל, ניתן לגדל צמחים בבית ירוק או תאי גידול מבלי גיד לפני עלות השחרtment עד המכבד עולה לפני שהם עברו לתנאי בתא מותאם.

ס viridis הוא דשא NADP-ME C תת סוג 4 הקשור באופן הדוק ולקליפות הזנת יואנרגיה המניה (תת NAD-ME), דוחן דוחן יבול תבואה, והדשא גינאה עשב החקלאי 5. הגנום 510 Mb של צורה מעובדת של Setaria, ש &#39; italica, לאחרונה רצף 1,2 ורצף הגנום 25x כיסוי היחסי עשבים, ש &#39; viridis, הוא בהתקדמות (לא פורסם). ס יש viridis מספר המאפיינים ההופכים אותו למערכת גנטית מודל פוטנציאל מצוין, כולל זמן דור מהיר, קומתו הקטנה, דרישות גידול פשוט, וייצור זרע פורה 3. חשוב מכך, שיטות לאחרונה פותחו עבור שניהם שינוי החולף ויציב של ס viridis המספק ההזדמנות ליצירת צמחים מהונדסים 4. עם זאת, צוואר בקבוק עיקרי בפיתוח של כלים גנטיים לס viridis הוא recalcitrance לoutcrossing. נכון להיום, אין פרוטוקול סטנדרטי כבר פורסם שיאפשר ייצור מהיר של זרעים מצלבים מבוקרים. צלבים גנטיים בס italica בדרך כלל מבוצע על ידי סירוס באמצעות הסרת מאבקים מפרחי 6,7,8 או באמצעות טיפול בחום של פרחים של הורים נשיים 9-11. בעקבות טיפולים, מאבקים או panicles מפרחים שאינם מטופלים אלה / הורי זכרים משופשפים בעדינות נגד סטיגמות שחרור אבקה. בסירוס, מאבקים יוסרו באמצעות מלקחיים קנס מייד לאחר פלוראט פותח והמאבק מתחיל exsert, אך טרם לשפוך אבקה 6-8. בין האתגרים של שיטה זו האחרונה הוא הקושי בביצוע סירוס במרווח זמן צר שבין הפתיחה וסככת אבקה של הפרח. משך הזמן של פתיחה וסגירה של פרח בודד ישתנה בהתאם להצטרפות ותנאי סביבה, ויכול לנוע בין 7 דקות &lt;sup&gt; 6-2.5 שעות 12 בס italica. מאז שפיכה של אבקה מתרחשת כמאבקי exsert מפלוראט, מאבקי צורך להסירו בזהירות ובמהירות, ולכן, קשה להימנע מזיהום עקב האבקה עצמית. בנוסף, כpollinations מבוצע מייד לאחר סירוס, מספר הצלבים שניתן לבצע לאדם / ליום מוגבל. כשיטת חלופית, יכול להיות טבול panicles הבוגר במים חמים כדי לחמם-להרוג את פיתוח גרגרי אבקה 9,10,13,14 עם היתרון של ביצוע צלבים על מספר גדול של panicles. עם זאת, הטמפרטורה ומשך הזמן של טיפול בחום משתנים מאוד מניסויים שונים (למשל 47 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות 14 ו42 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות 10). יתר על כן, אין ניתוחים שיטתיים על היעילות של emasculations תיווך החום פורסמו. לכן, סטנדרטי ושיטה פשוטה לביצוע צלבים גנטיים בס viridis יאיץ פיתוח משאבים הגנטיים והקמתו של ס &#39;באופן משמעותי viridis כמערכת מודל בתוך קהילת המחקר. אנו מדווחים על הפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול סטנדרטי לביצוע צלבים גנטיים בס viridis. צמחים גדלים תחת סביבות מבוקרות כדי לסנכרן פיתוח פרח ולהגדיל את שחזור של ההליך. צלבים מבוצעים באמצעות ס מהונדס שורת viridis כהורה הזכר המכיל את גן כתב גאס 4 כדי להקל על זיהוי של צלבים גנטיים מבוקרים מוצלחים. Transgene גאס הוא מונע על ידי אמרגן היוביקוויטין אורז המאפשר את הניקוד של זרעי F1 מייד לאחר קציר ובכך מספק assay איכותי קל לקבוע את היעילות של סירוס והאבקה. יש לנו עובדי טיפול פשוט חום עם מים חמים לסירוס מלווה בתיוג של פרחים שהיו emasculaטד לחסל את הזרעים וכתוצאה מפרחים חדשים שפותחו לאחר סירוס. לאחר בדיקת סדרה של טיפולים חום בטמפרטורות מתירנית ומשתנה משך טבילה במים חמים, הקמנו משכי טמפרטורה וזמן אופטימליים של 48 ° C 3-6 דקות. טיפול קר לפני עלות השחר נמצא לקדם anthesis סינכרוני בשני ההורים על מנת להקל על האבקה צולבת. יש לנו גם דנו בשלבים העיקריים בפרוטוקול והיישום העתידי של שיטה זו להצטרפויות Setaria אחרות.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Cat. Number</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scissors, spring</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>14126</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps, Dumostar Biology Polished</td>
			<td>SPI Supplies</td>
			<td>TD5BP-XD</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T (Fine Science Tools)</td>
			<td>14005-12</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28"</td>
			<td><a href="http://www.pjpmarketplace.com" target="_blank">http://www.pjpmarketplace.com</a></td>
			<td>361001</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715401C </td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>metro mix 360</td>
			<td>Hommert International</td>
			<td>10-0356-1</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's 15-16-17</td>
			<td>Hommert International</td>
			<td>07-5925-1</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red</td>
			<td>Staples</td>
			<td>37002</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DA-10, B0015IP380</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip </td>
			<td>Amazon</td>
			<td>N/A</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>water bath</td>
			<td>VWR scientific</td>
			<td>Model: 1166</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BDW walk in plant growth chamber</td>
			<td>Conviron</td>
			<td>BDW 40</td>
 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

methods for performing crosses in setaria viridis, a new model system for the grasses

Setaria viridis הוא מערכת מודל מתעורר ל4 C עשבים. היא קשורה קשר הדוק ולקליפות מניית ההזנה ביואנרגיה ודוחן דוחן יבול תבואה. לאחרונה, הגנום 510 Mb של דוחן דוחן, ש &#39; italica, כבר רצף 1,2 ורצף הגנום 25x כיסוי של ס ביחס העשבים viridis הוא בהתקדמות. ס יש viridis מספר המאפיינים ההופכים אותו למערכת גנטית מודל פוטנציאל מצוין, כולל זמן דור מהיר, קומתו הקטנה, דרישות גידול פשוטות, ייצור זרע פורה 3 ומערכות שפותחו לשינוי הן זמני ויציב 4. עם זאת, הגנטיקה של ס viridis הוא נחקר במידה רבה, בחלקו, בשל חוסר שיטות מפורטות לביצוע צלבים. נכון להיום, אין פרוטוקול סטנדרטי אומצה שיאפשר ייצור מהיר של זרעים מצלבים מבוקרים. נוכחות הפרוטוקולכאן ented מותאם לביצוע צלבים גנטיים בס viridis, A10.1 הצטרפות. יש לנו עובדי טיפול בחום פשוט עם מים חמים לסירוס לאחר הגיזום המכבד לשמור 20-30 פרחים וסימון של פרחים לחסל את הזרעים וכתוצאה מפרחים חדשים שפותחו לאחר סירוס. לאחר בדיקת סדרה של טיפולים חום בטמפרטורות מתירנית ומשתנה משך הטבילה, הקמנו טמפרטורה אופטימלית וטווח של 48 ° C זמן ל3-6 דקות. באמצעות שיטה זו, מינימום של 15 צלבים יכול להתבצע על ידי עובד אחד ליום וממוצע של 3-5 צאצאים outcross למכבד ניתן לשחזר. לכן, בממוצע 45-75 צאצאי outcross יכול להיות מיוצר על ידי אדם אחד ביום אחד. יישום רחב של טכניקה זו יאפשר הפיתוח של אוכלוסיות שורה טהורים רקומביננטי של ס &#39; viridis X ס viridis או ס viridis X ס italica, מיפוי מוטציות בתפזורת seניתוח gregant ויצירת מוטציות מסדר גבוהה יותר לניתוח גנטי.

במחקר זה, השתמשנו בס הרצף A10.1 הצטרפות viridis כהורה הנקבי, וס מהונדס שורת viridis (גם A10.1) המכילה את גן כתב גאס 4 כהורה זכר לכל pollinations. משטר צמיחה מותאם היה משמש לסנכרון פריחה כפי שמוצג באיור 1. בדקנו כמה שילובים של טמפרטורה וזמן של טיפול בחום עבור סירוס וציינתי כי כ 40-80% מהפרחים שמרה על מכבד המסורס פרחו ביום nd 2 והשאר פרח ביום 3 rd (איור 2). עם זאת, אם הטיפול בחום היה חמור מדי, לדוגמא, C ° 49 למשך 4 דקות, מעט מאוד, אם בכלל, פרחים פרח ביום nd 2. חוצה האבקה בוצעה ב -2 או 3 ביום שלישי אחרי הסירוס, שהיה תלוי בזמן השיא של anthesis של הורים ממין זכר. זה היה משקיפיםאד שפרחים צעירים המשיכו להתפתח לאחר סירוס, התבגר והאבקה עצמית pollinations המבוקר 3-6 ימים אחרי. אחרי 7-10 ימים לאחר הפריה, פרחים, כי הם בצבע לבן נראים על מכבד. פרחים לבנים אלה מופרה בשל נזק חום או האבקה עניות. במקביל, את הפרחים שכבר האבקת הצלחה מתחילים לשאת זרעים כהים ולהתחיל מתנפצים לאחר 14 ימים. הזרעים הכהים עם סימנים אדומים שנקטפו על 14 היום ה לאחר ההאבקה יכולים להבחין באופן ברור מהזרעים ללא סימנים אדומים שעדיין היו ירוקים ולא נשבר. אם קצירה מתעכבת, anthecium של הזרעים עם ובלי סימונים אדומים פונה שניהם כהה, מה שהופך אותו קשה להבחין במהירות את הזרעים עם סימנים אדומים בבריכות שנקטפו. כדי לייעל את הטיפול בחום הניסויים כמה פרוטוקול המעבר בוצעו כפי שמסוכמים בטבלה 1. ממוצע של0-10 זרעים / מכבדים נתגלו ניסויי טיפול בחום שונים. לאחר קציר, זרעים יובשו ב30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים במייבש זרעים ואחרי הסרת anthecium באמצעות מסיר anthecium. לאחר anthecium הוסר, זרעי F1 משוערים הוכתמו פתרון מכתים גאס, וצאצאי outcross מוכתמים בצבע כחול ב1-2 שעות (איור 2F). בהתבסס על תוצאות אלו, אנו ממליצים על טיפול בחום של 48 מעלות צלזיוס למשך 3-6 דקות. יתר על כן, אנו ממליצים כי צלבים להתבצע על גם ביום 2 ויום 3 הבאות סירוס. כדי לבחון את היעילות של טכניקה זו בביצוע צלבים עם הצטרפויות Setaria אחרות או מינים, חוצה בין ס A10.1 viridis ושמונה ס המגוון הצטרפויות viridis ואחד ס הצטרפות pumila בוצעה. למרות ימים לפריחה מגוונים בין ההצטרפויות מצאנו כי פרחים מכל שמונה ס הצטרפויות viridis ואחד סהצטרפות pumila להתחיל פתיחה בין 10:00-11:00 עם זמן פתיחת שיא ב10:20-11:00 לאחר הטיפול הקר שלפני עלות השחר. זה מצביע על כך שלפני עלות שחר הטיפול בקור יכול להיות מיושם על הצטרפויות Setaria מגוונות. טיפול בחום של 48 מעלות צלזיוס במשך 5-6 דקות שימש לסרס ס A10.1 viridis ששימש כהורה הנקבי לכל הצלבים שבוצעו. אנחנו התאוששתי מאחד ל12 זרעים מהכלאות בין A10.1 ושלוש של ס המגוון הצטרפויות viridis ושישה זרעים מצלב יחיד בין ס A10.1 viridis וס אחת הצטרפות pumila. עם זאת, בשלב זה אנחנו לא נקבעו אם זרעים אלה נבעו מtestcross מוצלח או היו התוצאה של זיהום עצמי. בכל מקרה, תוצאות הראשוניות אלה מצביעים על כך שתנאי גידול המשמשים לס A10.1 viridis יכול לשמש כדי ליצור צלבים עם ס המגוון הצטרפויות viridis ואולי מינים אחרים של Setaria. <tablדואר border = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> פינוק חום טמפ (° C) </td><td> פינוק חום זמן (דקות) </td><td> # צלבים </td><td> ממוצע. # של פרחים אחרי לקצץ </td><td> יום של האבקה (יום אחרי emasc) </td><td> ממוצע. # זרעים (אדום) / מכבד (מתכוון) </td><td> ממוצע. % גאס (+) / זרעים (אדום) </td><td> ממוצע. זרעים # היב (גאס +) </td><td> # דקות היב זרעים </td><td> זרעי היב # Max </td></tr><tr><td> 47 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 27 </td><td> יום 2 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 48 </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 36 </td><td> יום 2 </td><td> 5 </td><td> 60 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 4</td><td> 3 </td><td> 25 </td><td> יום 3 </td><td> 10 </td><td> 50 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 7 </td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 8 </td><td> 25 </td><td> יום 2 </td><td> 5 </td><td> 60 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td> 3 </td><td> 25 </td><td> יום 2 </td><td> 4 </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 24 </td><td> יום 2 </td><td> 3 </td><td> 33 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 25 </td><td> יום 3 </td><td> 4 </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> N / </td><td> N /</td></tr><tr><td> 49 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 23 </td><td> יום 2 </td><td> 5 </td><td> 25 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 7 </td><td> 26 </td><td> יום 2 </td><td> 8 </td><td> 25 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 5 </td><td> 22 </td><td> יום 2 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 25 </td><td> יום 2 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. אופטימיזציה של טיפול בחום לסירוס. תוצאות של שינוי הן בטמפרטורה ושעה של טיפול בחום. Pollinations בוצע אחד (2 nd יום) או יומיים (3 יום שלישי) הבא של הסירוס וoutcrosses המוצלחcored עם מכתים גאס <img alt="איור 1" fo:content-src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1highres.jpg" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1.jpg" /> איור 1. תנאי חדר צמיחה אופטימליים עם לפני עלות השחר טיפול קר. טמפרטורה ופרקי זמן לצמיחה ולתיאום אופטימליים של ייצור פרחים מוצגים. חיצים ירוקים ואדומים מראים חלון אופטימלי לביצוע צלבים וסירוס, בהתאמה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig2.jpg" /> איור 2. הכנה מכבדת למעבר ומכתים גאס של צאצאי outcross. () מכבד של A10.1 Setaria viridis לפני החיתוך, מראה כ 1/10 פרחים נפתחו. ארבעת החלקים ויווני בהתקדמות של anthesis לאורך המכבד מוצגים. <strongמכבד&gt; (ב &#39;) גזוז לפני סירוס עם זיפי עודפים. (C) מכבד מסורס לאחר הסרת זיפים. (ד&#39;) מכבד מסורסת ביום 2 הודעה סירוס, מראה פרחים שפורחים (תמונה שצולמה בשעת 10:30 בבוקר). (ה) מכבד של הורה הזכר (מהונדס Setaria שורת A10.1 viridis ביצוע β-glucuronidase (גאס) גן כתב) שהוא פורח לאחר טיפול לפני עלות השחר (תמונה נלקחה ב 10:30). באמצעות דואר, ברים בקנה מידה = 1 מ&quot;מ. (F) צאצאי outcross משוערת לאחר צביעת גאס לשעה 2 ואחריו distaining ב70% (v / v) אתנול. שני זרעים מהימין הם בקרות שליליות וחיוביות, בהתאמה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig3.jpg" /> איור 3. תרשים זרימה של פרוטוקול ייצוג סכמטי של מ &#39;מעורבים בביצוע ס צעדי ajor viridis חוצה.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses at JoVE.com

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

פיתחנו מתודולוגיה לביצוע צלבים בviridis Setaria (ס &#39;viridis). השיטה כוללת גיזום המכבד לפני טיפול במים חמים כדי להרוג את האבקה ובת קיימא. צלבים מבוצעים הבא משטר צמיחה מבוקרת היטב ובדרך כלל לגרום להתאוששות של 1 עד 7 האבקה צולבת זרע / s לכל מכבד.

שיטות לביצוע צלבים ב<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, מערכת דגם חדש לעשבים

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

methods-for-performing-crosses-setaria-viridis-new-model-system-for

Research

JoVE Journal

Environment

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

21.5K Views.  Donald Danforth Plant Science Center.  פיתחנו מתודולוגיה לביצוע צלבים בviridis Setaria (ס 'viridis). השיטה כוללת גיזום המכבד לפני טיפול במים חמים כדי להרוג את האבקה ובת קיימא. צלבים מבוצעים הבא משטר צמיחה מבוקרת היטב ובדרך כלל לגרום להתאוששות של 1 עד 7 האבקה צולבת זרע / s לכל מכבד. 

Video: Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

יישום חדש של החשמל חדירה הגרף (EPG) לרכישה ומדידת אותות חשמליים שביפים מסננת אלמנטים

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

שיטות Resampling הקרקע לעקוב אחר שינויים בריכוזיים הכימית של קרקעות יער

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

מדידה ומיפוי דפוסים של סחף אדמה ומשקעים הקשורים אדמה ריכוזים קרבונט תחת ניהול חקלאיים

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and rates of mortality in populations, which has a variety of applications in ecology, including agricultural ecosystems. Horizontal, or cohort-based, life tables provide for the most direct and accurate method of quantifying vital population rates because they follow a group of individuals in a population from birth to death. Here, protocols are presented for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field that takes advantage of the sessile nature of the immature life stages of a global insect pest, Bemisia tabaci. Individual insects are located on the underside of cotton leaves and are marked by drawing a small circle around the insect with a non-toxic pen. This insect can then be observed repeatedly over time with the aid of hand lenses to measure development from one stage to the next and to identify stage-specific causes of death associated with natural and introduced mortality forces. Analyses explain how to correctly measure multiple mortality forces that act contemporaneously within each stage and how to use such data to provide meaningful population dynamic metrics. The method does not directly account for adult survival and reproduction, which limits inference to dynamics of immature stages. An example is presented that focused on measuring the impact of bottom-up (plant quality) and top-down (natural enemies) effects on the mortality dynamics of B. tabaci in the cotton system.

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables allow quantification of the sources and rates of mortality in insect populations and contribute to understanding, predicting and manipulating population dynamics in agroecosystems. Methods for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field for an insect with sessile immature life stages are presented.

מתודולוגיית פיתוח טבלאות החיים עבור חרקים Sessile בשימוש השדה כנימת עש הטבק, כנימת עש הטבק, כותנה כמו מערכת מודל

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye anatomy of insects. These include traditional histological techniques optimized for work on ant eyes and adapted to work in concert with other techniques such as transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). These techniques, although vastly useful, can be difficult for the novice microscopist, so great emphasis has been placed in this article on troubleshooting and optimization for different specimens. We provide information on imaging techniques for the entire specimen (photo-microscopy and SEM) and discuss their advantages and disadvantages. We highlight the technique used in determining lens diameters for the entire eye and discuss new techniques for improvement. Lastly, we discuss techniques involved in preparing samples for LM and TEM, sectioning, staining, and imaging these samples. We discuss the hurdles that one might come across when preparing samples and how best to navigate around them.

This article outlines a suite of techniques in light and electron microscopy to study the internal and external eye anatomy of insects. These include several traditional techniques optimized for work on ant eyes, detailed troubleshooting, and suggestions for optimization for different specimens and regions of interest.

טכניקות חוקר האנטומיה של מערכת הראייה נמלה

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

פיתוח שיטות חדשות לכימות תנועת הדגים בצפיפות בכלים סטריאו-וידאו תת-מימי

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

שיטה לניתוח Pentosan נוכח יוטה ביומסה והמרה שלה לתוך מונומרים סוכר באמצעות נוזל חומצי יוניים

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) in vitro exposure systems are often large and bulky, making transport to the field and operation at the source of emission or within the breathing zone difficult. Through miniaturization of these systems, the lab can be brought to the field, expediting processing time and providing a more appropriate exposure method that does not alter the aerosol prior to contacting the cells. The Portable In vitro Exposure Cassette (PIVEC) adapts a 37 mm filter cassette to allow for in vitro toxicity testing outside of a traditional laboratory setting. The PIVEC was characterized using three sizes of copper nanoparticles to determine deposition efficiency based on gravimetric and particle number concentration analysis. Initial cytotoxicity experiments were performed with exposed lung cells to determine the ability of the system to deposit particles while maintaining cell viability. The PIVEC provides a similar or increased deposition efficiency when comparing to available perpendicular flow in vitro exposure devices. Despite the lower sample throughput, the small size gives some advantages to the current in vitro ALI exposure systems. These include the ability to be worn for personal monitoring, mobility from the laboratory to the source of emission, and the option to set-up multiple systems for spatial resolution while maintaining a lower user cost. The PIVEC is a system capable of collecting aerosols in the field and within the breathing zone onto an air-interfaced, in vitro model.

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Here, we present a protocol to perform portable cellular aerosol exposures and measure cellular response. The method uses cells, grown at the air-liquid interface, mimicking in vivo physiology. Cellular response to copper nanoparticle aerosols was observed as oxidative stress through reactive oxygen species generation and cytotoxicity as lactate dehydrogenase release.

חדש נייד במבחנה חשיפה קלטת לדיגום אירוסול

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a significant increase and decrease in guard cell volume, respectively. Because shuttle transport of ions and water occurs between guard cells and larger neighboring epidermal cells during stomatal movement, the spaced distribution of plant stomata is considered an optimal distribution for stomatal movement. Experimental systems for perturbing the spaced pattern of stomata are useful to examine the spacing pattern's significance. Several key genes associated with the spaced stomatal distribution have been identified, and clustered stomata can be experimentally induced by altering these genes. Alternatively, clustered stomata can be also induced by exogenous treatments without genetic modification. In this article, we describe a simple induction system for clustered stomata in Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sucrose-containing medium solution. Our method is easy and directly applicable to transgenic or mutant lines. Larger chloroplasts are presented as a cell biological hallmark of sucrose-induced clustered guard cells. In addition, a representative confocal microscopic image of cortical microtubules is shown as an example of intracellular observation of clustered guard cells. The radial orientation of cortical microtubules is maintained in clustered guard cells as in spaced guard cells in control conditions.

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

The goal of this protocol is to demonstrate how to induce clustered stomata in cotyledons of Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sugar-containing medium solution and how to observe intracellular structures such as chloroplasts and microtubules in the clustered guard cells using confocal laser microscopy.

מערכת אינדוקציה מקובצים באשכולות הפיוניות על ידי סוכר פתרון טבילה טיפול בשתילי תודרנית לבנה

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...