המחבר מודה ד&quot;ר מתיאס מאן לתמיכה המתמשכת והגב &#39;קתרינה Zettl עבור הוכחת השיטה. עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק לקידום המדע.

1. מכשור הנדרש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פרוסות רקמה לתמוגה microdissection והמדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Thermoblock מוגדר 99 ° C או אמבטיה עם מים רותחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microdissector הפעלה לייזר (לדוגמא PALM, Zeiss, גטינגן, גרמניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ספסל העליון Thermostated, טמפרטורה מוגדרת 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדר הרטוב (קופסא) עם מתלה לצינורות Eppendorf לרשות מהסוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממה מוגדרת 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spectrofluorometer המאפשר מדידה של הקרינה נרגשת ליד אור UV עם cuvettes מיקרו בקנה המידה קוורץ (0.1-0.2 מיליליטר). </li></ol></li></ol> 2. פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;רקמות תמוגה מאגר &#39;(TLB): של 0.1 M טריס-HCl, pH 8.0, 0.1 M DTT, 0.5% (w / v) פוליאתילן גליקול 20,000 ו -4% SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון UA: 8 מ אוריאה ב0.1 M טריס-HCl pH 8.5. הכן 1 מיליליטר לדגימה 1. פתרונות UA והרשות צריכים להיות מוכנים טרי ולהשתמש בם בתוך יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון רשות העתיקות: 0.05 M iodoacetamide בUA. הכן 0.1 מיליליטר לדגימה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Endoproteinase יס-C, פתרון מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריפסין, פתרון מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &#39;עיכול חיץ &quot;(DB): 0.05 M טריס-HCl pH 8.5. הכן 0.25 מיליליטר לדגימה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &#39;טריפטופן תקן הפתרון&#39;: 0.1 מיקרוגרם טריפטופן ב 1 מיליליטר מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &#39;החיץ B Assay&#39; (ABB): 10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מניות של בריטון ורובינסון האוניברסלי חוצץ (BRUB). הכן תמיסה המכילה 0.1 M CH 3 COOH, 0.1 MH 3 PO 4, ו0.1 MH 3 BO 3 ולהתאים עם 1 M NaOH לpH הנדרש (2, 4, 5, 6, ו -11). לפני השימוש לדלל פי 5 במי deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ: 1% (v / v) CH 3 COOH במי deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצפת B: 60% (V / V) CH 3 CN, 1% (v / v) CH3COOH במי deionized. </li></ol> 3. פיפטה עצה ועמודות&#39; StageTip &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את קצה טור SAX ידי ערמת 6 שכבות של קרום Empore-אניון בשיתוף0.2 mmon מיליליטר פיפטה קצה. בצע שתי עמודות SAX-טיפ לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &#39;StageTip&#39; על ידי ערמת 3 שכבות של Empore-C 18 בקצה פיפטה 0.2 מיליליטר. הפוך 6 טיפים במה לכל דגימה. </li></ol> 4. הכנת פרוסות רקמה לMicrodissection ומדגם תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך קטעים עם microtome (עובי הפרוסות תלוי במדגם. בדרך כלל microdissection עובד היטב עם פרוסות של 7-10 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין שקופיות קרום (1.0 MembraneSlide PEN) עם UV-אור 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את הסעיפים בשקופיות הקרום להקרין ויבשות ב37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize הסעיפים רכובים על ידי שני incubations רצוף בקסילן ל2.5 דקות ו1.5 דקות. רעננותם החלקים על ידי incubations רצוף באתנול מוחלט, 70% אתנול, ומים, כל דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את החלקים עם hematoxylin מאיר חברה ל20 שניות, לשטוף במים במשך 1 דקות, ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף populati התאבעניין שימוש במערכת microdissection ללכוד לייזר. בעת השימוש במכשיר כף היד (Zeiss) לאסוף את הדגימות בכובעי הדבק (דבק CAP 200). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה aliquot של TLB על חומר microdissected בכובע. סגור את הצינור ולאסוף את ההשעיה על ידי צנטריפוגה קצרה. Lyse רקמות microdissected ב99 ° C בבלוק חימום עם תסיסה (600 סל&quot;ד) במשך שעה 1. השתמש 3 μl של חיץ ל10 NL של רקמת microdissected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את התמצית גולמי על ידי צנטריפוגה ב16,000 XG ב C ° 18 10 דקות. Lysate ניתן לאחסן קפוא ב -20 ° C. </li></ol> 5. עיבוד לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עד 50 μl של lysate הבהיר עם 200 μl של UA ביחידות אולטרה (30k משפטי) ו צנטריפוגות ב XG 14,000 עד פחות מ -10 μl מהפתרון יישאר במסנן. בדרך כלל שלב זה דורש 10-15 צנטריפוגה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של UA ליחידת אולטרהו צנטריפוגות כמו ב5.1. רוקן את צינור האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של פתרון רשות העתיקות ומערבבים ב600 סל&quot;ד בתרם מיקסר דקות 1 ו צנטריפוגות כמו ב5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​UA 100 μl ליחידת אולטרה צנטריפוגות כמו ב5.1. חזור על פעולה זו פעמיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של DB פיפטה 100 μl ליחידת אולטרה ו צנטריפוגות ב5.1. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את יחידות סינון לצינורות איסוף חדשים. DB פיפטה 40 μl עם endoproteinase יס-C (proteinase יחס חלבון כולל של 1:100) ומערבבים ב600 סל&quot;ד בתרם מיקסר דקות 1. דגירה היחידות בתא רטוב ב-C ° 37 ל18 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה יחידות הסינון ב14,000 XG כגון ב5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 160 μl מים deionized ו צנטריפוגות יחידות הסינון כמו ב5.1. הזרימה דרך נקווה (5.7 ו5.8 צעדים) מכיל פפטידים שפורסמו על ידי endoproteinase יס ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את יחידת אולטרה לצינור איסוף חדש. הוסף 40 μlDB עם טריפסין (אנזים ל1:100 יחס חלבון) ומערבבים ב600 סל&quot;ד בתרם מיקסר דקות 1. דגירה היחידות בתא רטוב ב-C ° 37 במשך 4 שעות. חזור על שלבים 5.7 ו5.8 לאסוף פפטידים tryptic. </li></ol> 6. Quantitation של פפטידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדידה של תוכן הפפטיד בחלבון מעכל יכולה להתבצע בחיץ מדולל בגלל שאריות טריפטופן הן גם נגישות לממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 0.2 מיליליטר של ABB לקובט קוורץ ולהקליט את ספקטרום הפליטה עבור &#39;ריק&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עקומת כיול באמצעות 0.1 מיקרוגרם צעדים על ידי הוספת aliquots μl 1 של TSS לקובט והתערובת עדינה עם ABB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את המדגם ולהקליט את הספקטרום (לדוגמא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב של ריכוז החלבון ופפטיד מאז 0.1 מיקרוגרם טריפטופן מתאים לכ -9 חלבון מיקרוגרם (המבוסס על 1.1% הממוצע של תוכן טריפטופן בתערובות חלבון שהושגו בy lysing תאים אנושיים) תכולת החלבון של שווה במדגם או הפפטיד התוכן בתקציר: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> כאשר F (Standard1) הוא הקרינה של 0.1 מיקרוגרם סטנדרטי טריפטופן. תוכן פפטיד מאפשר חישוב התשואה של הליך העיכול ומספק מידע חיוני לחלוקה הבאה פפטיד וניתוח ספקטרומטריה. </li></ol> 7. חלוקה של פפטידים ליס-C וtryptic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פתרונות פפטיד מתקבלים על ידי digestions עם יס-C וטריפסין עם 0.2 מיליליטר של BRUB pH 11 וpH 5, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את קצה טור SAX במכסה מתאם צינור צנטריפוגלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולאזן את קצה טור SAX ברציפות עם 0.1 מיליליטר של מתנול, 0.1 מיליליטר של 1 M NaOH, ו3 פעמים עם 0.1 מיליליטר של BRUB, pH 11 להפרדת ליס-C peptides ועם BRUB, pH 5 לפפטידים tryptic. הזרימה של הפתרונות דרך חומר העמודה היא הקלה על ידי צנטריפוגה ב4,000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולאזן 18 C - &#39;StageTips&#39; לאחר מכן עם, 0.05 מיליליטר של מתנול, ולאחר מכן עם 0.05 מיליליטר של הצפת B ועם 0.05 מיליליטר של א הצפת הכן שישה C 18 - &#39;StageTips&#39;; 4 להפרדת ליס- פפטידים C ושתי להפרדת פפטידים tryptic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את SAX עצה העמודות ב18 C - &#39;StageTip&#39;. טען את הפתרונות לדוגמא לעצה-עמודות SAX equilibrated צנטריפוגות העמודות בXG 5,000 במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודות &#39;פיפטה קצה&#39; עם 0.1 מיליליטר של BRUB, pH 11 או pH 5, בהתאמה לLyc-C ודגימות tryptic. להקל על הזרימה על ידי צנטריפוגה ב5,000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר SAX עצה העמודה לC הבא 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך משחררי של פפטידים עם BRUB 6 pH, 4, ו -2 למדגם C ליס ועם ברוB-pH 2 לדוגמה עם פפטידים tryptic. לכל שלב elution להשתמש C נפרד 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את 18 C - &#39;StageTips&#39; עם 0.05 מיליליטר של א המאגר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute שברים עם 0.05 מיליליטר של הצפת B לתוך צלוחיות המשמשות ישירות להזרקה של הדגימות למערכת LC התאספו עם ספקטרומטר מסה. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

המחבר יש מה למסור.

היכולת ללמוד את חומר FFPE ידי טכנולוגית proteomic לעומק דומה עם רצף חומצות גרעין וטכניקות microarray פותחת אופקים חדשים בסמנים ביולוגיים וגילוי יעד תרופה. הפרוטוקול המתואר מאפשר אפיון וכימות של proteomes של אוכלוסיות של תאי microdissected בסולם של 10,000 חלבונים. בעת השימוש בפחות חומר microdissected יכולים להיות שנוצרו מערכי נתונים קטנים יותר, אבל אולי במקרים רבים אלה יכולים גם לספק מידע קליני חשוב. לכן, ניתן לנתח גם את הדגימות ישירות לאחר הליך MED-FASP או ניתן להפרידו בפחות שברים. מאז הליך FASP תואם עם כל סוג של פרוטאז, ניתן להשתמש בם אנזימים אחרים או השילוב שלהם מdigestions החלבון 6. נראה איכות חומר FFPE להיות הנושא הקריטי ביותר של הניתוח. יש לנו ניסיון שהרקמה קבועה מאותו המוצא, אלא מגיעים משונההיו לי מרפאות אף אוזן גרון מאפיינים מובחנים. שימוש ברקמה ממקור אחד שהיינו מסוגל לייצר פפטידים בתשואות גבוהות, ואילו חומר דומה ממרפאה אחרת היה כמעט חסר תועלת. סביר להניח כי הקיבעון שיושם ונהלי הטבעה כמו גם תנאי אחסון הם הגורמים העיקריים המשפיעים על תכונות החומר הקליני 12. לכן מומלץ לבחון את המאפיינים של כמה דגימות לפני תחילת פרויקט גדול יותר. פרסומים רבים דיווחו על השימוש בחומר FFPE בעבר. עם זאת, מספרם של החלבונים שזוהו במחקרים אלה לא עלה על יותר מ 1,000-2,000 חלבונים 4. בהתחשב בגודל של proteomes הספציפי התא האנושי הכולל יותר מ 10,000 חלבונים, מחקרים כאלה היו מסוגלים רק כדי לספק תמונה שטחית מאוד, כמעט רק חלבונים נפוצים ביותר המעורבים בפונקציות ניהול משק בית. הפרוטוקול שלנו מאפשר בידוד יעיל של f החומר הקלינית או ביולוגיתrom נשמר רקמות, והוא מותאם לתמוגה, עיבוד חלבון וprefractionation פפטיד. כתוצאה מכך מדגם זרימת העבודה ההכנה שלנו, כאשר מצמידים לספקטרומטריית המסה-high-end, מאפשרת תובנות proteomes כמעט מלא. ראוי לציון, זה אפשרי בדרישות סכום מדגם דקה. היתרון העיקרי של שימוש ברקמות שהשתמרו הוא הזמינות רחבה היחסית שלהם. דגימות FFPE בארכיון במשך שנים ועשורים רבים, ולעתים נחשבות כחסר תועלת, עכשיו, הודות לטכנולוגית proteomic, מופיע חומר כיקר מאוד למחקר קליני. בעוד שניתן ללמוד במחלות רבות באמצעות חקירת חומר טרי או קפואה של חומר FFPE נראה להיות חשוב במיוחד ללימוד מחלות נדירות 12, היה אוסף של קבוצה מייצגת של מדגם לוקחת בדרך כלל זמן רב.

תיקון עם paraformaldehyde והטבעה בפרפין (FFPE) היא השיטה סטנדרטית לשימור וחקירת pathomorphologic חומר רקמה קליני. מיקרוסקופית של הרקמה שהשתמרה מאפשר זיהוי של שינויים מורפולוגיים מחלה קשורה, ואיתור וניקוד של מופע של אנטיגנים הקשורים למחלות. מאז בדרך כלל רק חלק קטן ממדגם FFPE משמש בניתוחים אלו, כמויות גדולות של חומר קליני יישארו בארכיון וניתן לנצל בסוגים אחרים של מחקרים. במהלך העשור האחרון המחקר בתחום מדעי חיים התחזק על ידי טכנולוגית proteomic רבת עוצמה. טכנולוגיה זו מאפשרת זיהוי וכימות של אלפי חלבונים בתערובות חלבון מורכבים. תכונה חשובה של הטכנולוגיה היא שכמויות זעירות בלבד של חומר יש צורך בקנה מידה גדולה מנתח. מחקרי proteomic אחרונים הוכיחו כי חלבונים יכולים להיות למדו בסולם של comp כמעטlete proteomes 1, 2. סוג זה של חקירות מאפשר תובנות רחבים מערכת בהרכב של התאים וזיהוי של קבוצות של חלבונים המתרחשים ברמות חריגות במחלות. בעוד שמחקרים אלה נדרשים יכולות ספקטרומטריה גדולות, העבודה האחרונה הוכיחה כי במידה דומה של זיהוי יכולה להיות מושגת בתוך יום אחד של מדידה 3. הדרישה של כמות מדגם נמוכה יחסית והזמינות רחבה של הדגימות הקליניות השתמרו מתפתות ואחרים כדי לפתח שיטות המאפשרות חקר proteomic של חומר FFPE (לסקירה ראתה 4). מנצל את ההפיכות של קיבעון פורמלין תחת טיפול בחום שפיתחנו פרוטוקול המאפשר מיצוי כמותי של חלבונים מהרקמות הקבועים 5. הראינו כי הליך הקיבעון שומר לא רק חלבונים, אלא גם לפחות כמה שינויי posttranslational. Phosphorylation ו-N-glycosylation ניתן ללמוד באמצעות דגימות FFPE 5, לעומת זאת תנאי הכרחי לכך הוא תנאי אוסף רקמות, אחסון וקיבוע מבוקר באופן יסודי. בשלב הבא, יש לנו מותאם השיטה לmicrodissection ללכוד לייזר של הרקמה קבועה ואת עיבוד proteomic הכור מבוסס מדגם 6, 7. מחקר בקנה מידה גדולה על סרטן מעי גס אפשר ניתוח כמותי של 7,500 חלבונים מmicrodissected מחומר קליני 8. לבסוף, יש לנו שיפור בדרך של חקר חומר microdissected ידי החלת רציפות ושתיים חלבון צעד פרוטוקול עיכול 9. בהשוואה לאסטרטגיות עיכול הנפוצות באמצעות אנזים יחיד, הליך זה מאפשר לדור של יותר פפטידים רצף ייחודי וכתוצאה מכך, תוצאות בעומק גבוה יותר של זיהוי חלבון. ניתוח של אדנומה במעי הגס האנושית microdissected אפשר ניתוח proteomic לעומק של 9,500 חלבונים לדגימה 3. בהרבעה זהy מיפינו 55,000 פפטידים לדגימה המאפשרים זיהוי של חלבוני 88-89% עם לפחות 2 פפטידים. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור הכנת דגימות מחומר FFPE לניתוח LC-MS/MS. פרוטוקול זה כולל הכנה של פרוסות רקמה לmicrodissection, תמוגה של התאים המבודדים, ועיבוד לדוגמא בפורמט כור (FASP) 6. לאחר מכן אנו מתארים נחישות spectrofluorometric תשואות פפטיד; משימה עם חשיבות גבוהה לזיהוי הפפטיד אופטימלי על ידי ספקטרומטריית המסה. לבסוף, אנחנו מדגימים מחליף חזקים אניון (SAX) מבוססות טכניקת הפרדה לחלוקת פפטיד. בשיטה זו הן הפרדת הפפטיד וניקוי סופי מתבצעות באמצעות microcolumns פיפטה קצה 10, 11. שלב זה הוא אופציונלי, אך מומלץ במחקרים בהם ניתן להשיג יותר מאשר כמה מיקרוגרם פפטידים ממדגם יחיד. SAX-חלוקה באופן משמעותי יכולה להגדיל את המספר והטווח הדינמי של זיהויכישורים, ולהרחיב את כיסוי חלבון רצף 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

חומר קליני שהשתמר הוא מקור ייחודי לחקירת proteomic של הפרעות אנושיות. כאן אנו מתארים פרוטוקול מותאם המאפשר ניתוח כמוני בקנה מידה הגדולה של פורמלין קבוע ופרפין מוטבע רקמה (FFPE). ההליך מורכב מארבעה שלבים מובחנים. הראשון הוא ההכנה של חלקים מחומר FFPE וmicrodissection של תאים של עניין. בשלב השני התאים המבודדים הם lysed ומעובדים באמצעות &#39;הכנת מדגם מסנן בעזרת &quot;טכניקה (FASP). בשלב זה, חלבונים מתרוקנים מחומרים כימיים המשמשים לתמוגה המדגם ומתעכלים בשני שלבים באמצעות endoproteinase LysC וטריפסין. לאחר כל מערכת העיכול, פפטידים שנאספו במקטעים נפרדים ותוכנם נקבע באמצעות מדידת הקרינה רגישה מאוד. לבסוף, פפטידים מופרדים על microcolumns &#39;פיפטה קצה&#39;. LysC-פפטידים מופרדים ל4 שברים ואילו PE trypticptides מופרד ל -2 חלקים. בדרך זו דגימות מוכנות לאפשר ניתוח של proteomes מכמויות זעירות של חומר לעומק של 10,000 חלבונים. לכן, העבודה שתוארה היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד מחלות במערכת רחבה אופנה, כמו גם לזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ומטרות תרופה.

ניתוח proteomic חומר FFPE דורש שיטות חזקות לשחזור להכנת מדגם. בפרסום זה אנו מדגימים פרוטוקול המאפשרים בידוד אפקטיבי של אוכלוסיות תאים מהחומר הקבוע והעיבוד הכימי שלהם וכתוצאה מכך השברים פפטיד טוהר גבוהים שניתן להשתמש בם ישירות לניתוח LC-MS/MS. ההליך מורכב מארבעה חלקים נפרדים: (1) הכנת החלקים של דגימות FFPE וmicrodissection, (2) תמוגה של המדגם והעיבוד של החלבונים באמצעות גישת MED FASP, ו (3) quantitation ו (4) חלוקה של פפטידים (איור 1). בשלב הראשון של הליך דגימות FFPE הם מחולק עם microtome רכוב על שקופיות קרום מכוסה. כדי להגביר את ההדבקה בין חלקי רקמות ועל פני השטח של קרום השקופיות הוא הכרחי כדי להקרין שקופיות המשטח עם אור האולטרה סגול. לשם כך אנו משתמשים באור של מנורת UVמשולב לספסל תרבית תאים. לאחר שלב זה השקופיות חשופים לשטיפות ומאפשרות הסרת פרפין וההתייבשות של הדגימות. חומר rehydrated מוכתם בhematoxilin לזמן קצר. התוצאה היא הכתמה חלשה של המדגם אבל מספיק להדמיה של אזורי המדגם לmicrodissection. תהליך הצביעה צריך להיפסק במהירות על ידי שטיפה של השקופיות עם עודף של מים. צביעה ממושכת של תוצאות מדגם תשואות פפטיד עניות. בשלב הבא בסעיפים היבשים חשופים לmicrodissection. הבחירה של אזורי הרקמה של תאים בודדים תלוי בסוג של חקירה ותמיד דורשת ידע ספציפי בהיסטולוגיה או pathomorphology. החומר שוחרר הלייזר נאסף על משטחי דבק של צינורות איסוף דגימה. מאז את יכולת הקשירה של חומר ההדבקה מוגבלת יש צורך להעביר את חומר microdissected מהמכסה כדי לאהוא הצינור לאחר הנתיחה של כל 3-5 מ&quot;מ 2 של המדגם. ניתן לעשות זאת בקלות על ידי pipetting של כמה מיקרוליטר של מאגר תמוגה הרקמות (LTB) על גבי המכסה וספינינג קצר של הצינור בצנטריפוגה. אחרי המדגם נאסף בחלק התחתון של הצינור, ניתן המשיכו microdissection ואיסוף הדגימה על המכסה. ברגע שכל הדגימה שנאסף הצינורות צריכים להיות פקוקים בנוסף עם Parafilm וטופחו באמבט מים בכ -99 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת במשך שעה 1. מאז במהלך הדגירה המים מתעבה על המכסה, כל 15 דקות הצינורות צריכים להיות centrifuged זמן קצר כדי לאסוף בחזרה את המים בחרוט הצינור. כדי להשיג פפטידים lysates הרקמות מעובדים באמצעות גישת MED-FASP. בשיטה זו חלבוני lysed מתרוקנים מחומרי הניקוי וחומרים אחרים במשקל מולקולרי נמוכים, carboamidomethylated בשאריות ציסטנילים, ולאחר מכן מתעכלים ברצף עם שני אנזימים differing בספציפיות הביקוע שלהם: endoproteinase LysC וטריפסין. לאחר כל שלב עיכול פפטידים נאספים לתוך שברים נפרדים. בחלק זה של הכנת המדגם זה חשוב להמשיך כל אחד מהצעדים צנטריפוגה עד יותר מ 95% מהפתרון תחילה נטען לתוך יחידת הסינון עבר את הממברנה. ניתוח רקמות מעי הגס והסרטן שלה אנו ציינו כי תשואות הליך זה 3-6 מיקרוגרם של הפפטיד ל100 NL (רקמת 100 מיקרוגרם או 10 מ&quot;מ 2 של סעיף 10 מיקרומטר) של חומר microdissected (טבלת 1). מאז חלבון סך הכל ניתן להפיק מרקמות הוא כ 10% ממשקל רקמת נהלי החילוץ והעיכול לגרום יחד בתשואת 30-60% בביחס לרקמה הטרי המקורית. ערכים אלה משקפים הפסדים של החלבון במהלך התייבשות ומכתים, microdissection, ושימור של החלק מהמדגם לא מעוכל ביחידות אולטרה. בגלל מיצוי ועיבוד של לארקמת FFPE n-microdissected הביאה לתשואת חלבון לפפטיד-המרה של 75% 5 סביר להניח כי הפסדי המדגם הקריטיים מתרחשים במהלך השלבים לפני MED-FASP. תכונה חשובה של תערובות פפטיד מתקבלות על ידי הליך זה היא טוהר הגבוה שלהם המאפשר תהליך נוסף חלוקה פפטיד חלוקה והזדהות ספקטרומטריית מסה. לאחרונה זה הוכח על ידי ניתוח של דגימות אדנומה מעי גס 3. במחקר כי כ -40% מאירועי MS / MS הובילו לזיהוי של פפטידים מרקמת FFPE והביאו מיפוי של עד 17,000 פפטידים לכל מפעיל LC-MS/MS אחת. שיעורי זיהוי גבוהים הושגו רק בניתוח של תאים קפואים במבחנה תרבותית 3. בשני החלקים האחרונים של ההליך כולו פפטידים מבודדים הם לכמת ומופרד בmicrocolumns פיפטה קצה. מאז הכמויות של פפטיד מבודדים מרקמת microdissected הן להיותהנמוך 10 מיקרוגרם שלא ניתן לכמת באמצעות מבחני חלבון מבוסס צבע נפוץ. גם מדידות קרינת UV-רפאים 280 בריכוזים אלה אינן שימושיות בשל השפעת פיזור אור. לעומת זאת, מדידות של הקרינה של שאריות טריפטופן מציעות דרך אמינה לקביעת תוכן פפטיד. לאחרונה יש לנו הראינו כי עד 5,000 חלבונים מהתאים בתרבית יכולים להיות מזוהים ב&#39;ירייה אחת &#39;4 ניתוח LC-MS/MS שעות 7. עם זאת ניתוח מסוג זה מיושם על רקמות ילידים לעתים רחוקות מאפשר זיהוי של יותר מ 3,000 אלף חלבונים. כדי להגדיל את עומק ניתוח פפטידים שנוצרו בMED FASP צריכים להיות מראש מופרדים לפני LC-MS/MS. הפרדת מייקר עמודת SAX מבוסס היא שיטת חלוקה פשוטה ויעילה 10. זה כבר הותקן במספר מחקרי proteomic כוללים אלה ניתוח רקמות קבועות 5, 8, 9. Microcolu SAX-&#39;פיפטה הקצה&#39;MNS, ו18 C - עמודות desalting &#39;StageTip&#39; 9 הם קלים להכנה. העמודות נאספו על ידי לערום של תקעים, לחתוך מSAX או 18 C ממברנות, בקצה פיפטה μl 200 11. דוגמאות לניתוח של דגימות FFPE-מופרד SAX מוצגים בטבלה 1. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> איור 1. סקירת הליך. ההליך מורכב מארבעה חלקים נפרדים: (1) הכנת החלקים של דגימות FFPE וmicrodissection, (2) תמוגה של המדגם והעיבוד של החלבונים באמצעות גישת MED FASP, ו (3) quantitation ו (4) חלוקה של פפטידים. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> מדגם </td><td fo:width="1in"> לפני חלוקה / עיכול לדוגמא </strאונג&gt; </td><td fo:width="1in"> ספקטרומטר מסה משמש </td><td fo:width="1.25in"> ng תשואת פפטיד / מדגם NL (± סטיית תקן) </td><td fo:width="1.25in"> הזדהויות חלבון ייחודיות למדגם יחיד </td><td fo:width=".75in"> הפניה </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • רירית מעי הגס רגילה </td><td> SAX / אנזים אחד </td><td> Orbitrap-לוס </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5,985 ± 54 5,868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • הגס אדנומה </td><td> SAX / שני אנזימים </td><td> ש Exactive </td><td> 56 ± 6.1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. נציג תוצאות של ניתוחי proteomic של רקמת microdissected FFPE.

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

קבוע פורמלין תצלום ופרפין המוטבע (FFPE) דגימות קליניות הם חומר רב ערך לחקירה של מחלות. כאן אנו מדגימים מדגם זרימת עבודה הכנה המאפשרת ניתוח מעמיק בproteomic של רקמת FFPE microdissected.

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

proteomic-sample-preparation-from-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Biology

27.4K Views.  Max Planck Institute of Biochemistry.  קבוע פורמלין תצלום ופרפין המוטבע (FFPE) דגימות קליניות הם חומר רב ערך לחקירה של מחלות. כאן אנו מדגימים מדגם זרימת עבודה הכנה המאפשרת ניתוח מעמיק בproteomic של רקמת FFPE microdissected. 

Video: Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...