Yazar metodunu göstermek için sürekli destek ve Bayan Katharina Zettl için teşekkürler Dr Matthias Mann. Bu çalışma Advancement of Science için Max-Planck Derneği tarafından desteklenmiştir.

1.. Enstrümantasyon Gerekli <ol><li> Mikrodiseksiyon ve örnek liziz doku dilimleri hazırlanması <ol><li> Termoblok 99 ° C ya da kaynar su ile bir banyo için ayarlanır. </li><li> Lazer işletim microdissector (örneğin PALM, Zeiss, Göttingen, Almanya). </li><li> Termostatlı bir tezgah üstü santrifüj, sıcaklık 20 ° C olarak ayarlanmış </li><li> Eppendorf-tipi imha tüpler için bir raf ile ıslak odacık (kutu). </li><li> Kuluçka, 37 ° C&#39;ye ayarlanmış </li><li> Mikro ölçekli kuartz küvetler (0.1-0.2 ml) ile UV ışık yakın heyecanlı floresan ölçülmesini sağlayan spektroflorometre. </li></ol></li></ol> 2. Çözümler <ol><li> &quot;Doku Liziz Tamponu &#39;(TLB): 0.1 M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1 M DTT,% 0.5 (w / v) polietilen glikol 20000 ve% 4 SDS. </li><li> UA çözeltisi: 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5, 8 M üre. 1 numune başına 1 ml hazırlayın. UA ve IAA çözeltiler taze hazırlanmış ve bir gün içinde kullanılmalıdır. </li><li> IAA çözeltisi: 0.05 M iUA odoacetamide. 1 numune başına 0.1 ml hazırlayın. </li><li> Endoproteinaz Lys-C, stok çözelti hazırlayın. </li><li> Tripsin, stok çözüm. </li><li> &#39;Sindirim tampon&#39; (DB): 0.05 M Tris-HCl pH 8.5. 1 numune başına 0.25 ml hazırlayın. </li><li> &#39;Triptofan Standart Çözelti&#39;: 1 mL deiyonize su içinde 0.1 ug triptofan. </li><li> &#39;Tayin tamponu B&#39; (ABB): 10 mM Tris-HCI, pH 7.6. </li><li> Britton ve Robinson Tamponu Universal (Brub) stok çözeltisi. 0.1 M CH3, COOH, 0.1 MH 3 PO 4 ve 0,1 MH 3 BO 3 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın ve gerekli pH, 1 M NaOH ile ayarlanır (2, 4, 5, 6, ve 11). Kullanımdan önce iyonu giderilmiş su ile 5 kat seyreltilir. </li><li> Deiyonize su içinde% 1 (v / v) CH 3 COOH: A Tampon. </li><li> Tampon B:% 60 (v / v) CH3CN,% 1 iyonu giderilmiş su içinde (v / v) CH3COOH. </li></ol> 3. Pipet İpucu ve &#39;StageTip&#39; Sütunlar <ol><li> Bir işbirliği içinde Empore-Anyon zarın 6 kat istifleme tarafından SAX uç-sütun hazırlayınMMON 0.2 ml pipet. Numune başına iki SAX-ucu sütun olun. </li><li> 0.2 ml pipet Empore-C 18 3 kat istifleme tarafından &#39;StageTip&#39; hazırlayın. Her numune için 6 Sahne ipuçları olun. </li></ol> 4. Mikrodiseksiyonu için Doku Dilimleri hazırlanması ve Numune Liziz <ol><li> Bir mikrotom ile kesme bölümleri (dilimlerin kalınlığı örnek bağlıdır. Süresi mikrodiseksiyon 7-10 um dilimleri ile çalışır). </li><li> 45 dakika boyunca UV ışığı ile membran slaytlar (MembraneSlide 1.0 PEN) ışın tedavisi. </li><li> 2 saat boyunca 37 ° C &#39;de ışın zar slaytlar üzerine kuru bölümleri monte edin. </li><li> 2.5 dakika ve 1.5 dakika için ksilen içinde birbirini takip eden iki inkubasyon ile monte edilmiş bölümleri Deparaffinize. Birbirini takip eden mutlak etanol inkubasyon,% 70 etanol ve su, 1 dakika boyunca, her bölümleri ile rehidrate. </li><li> , 20 sn için Mayer&#39;in hematoksilen ile bölümleri Leke 1 dakika ve hava-kuru su ile çalkalayın. </li><li> Hücre Nüfusu toplamaklazer yakalama mikrodiseksiyon sistemini kullanarak ilgi üzerine. PALM cihazı (Zeiss) kullanırken yapışkan harflerle örnekleri (Yapıştırıcı CAP 200) toplamak. </li><li> Kap içinde microdissected malzeme üzerinde TLB bir kısım Pipet. Tüpü kapatın ve kısa bir santrifüj ile süspansiyon toplamak. Lyse 1 saat boyunca çalkalama (600 rpm) ile, bir ısıtma bloğu içinde 99 ° C &#39;de microdissected doku. Microdissected doku 10 nl tamponunun 3 ul kullanın. </li><li> 10 dakika boyunca 18 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de santrifüj ile ham özü açıklığa kavuşturulacaktır. Lizat, -20 ° C&#39;de dondurulmuş saklanabilir </li></ol> 5. Örnek İşleme <ol><li> Çözeltinin az 10 ul filtre kalacak kadar 200 ultrafiltrasyon birimleri UA ul (Adli 30k) ve 14,000 x g santrifüj ile berraklaştırılmış lizat 50 ul kadar karıştırın. Genellikle bu adım, 10-15 dakika santrifüj gerektirir. </li><li> Ultrafiltrasyon birimine UA 200 ul Pipetve 5.1 olarak santrifüj. Toplama tüpü boşaltın. </li><li> Pipet 50 IAA çözeltisi ul ve 5.1 &#39;de olduğu gibi, 1 dakika için santrifüj ve bir termo-mikser içinde 600 rpm&#39;de karıştırın. </li><li> 5.1 &#39;de olduğu gibi ultrafiltrasyon ünitesi ve santrifüj UA 100 ul Pipet. Iki kez bu adımı tekrarlayın </li><li> 5.1 de ultrafiltrasyon ünitesi ve santrifüj DB Pipet 100 ul. Iki kez bu adımı tekrarlayın. </li><li> Yeni toplama tüpleri filtrasyon üniteleri aktarın. Pipet 40 ul endoproteinaz Lys-C (1:100 total protein oranı için proteinaz) ile DB ve 1 dakika için termo-mikser içinde 600 rpm&#39;de karıştırın. 18 saat boyunca 37 ° C&#39;de nemli bir oda içinde birimleri inkübe edin. </li><li> Örneğin 5.1 gibi 14.000 x g&#39;de santrifüj filtre üniteleri. </li><li> 5.1 &#39;de olduğu gibi, deiyonize su ve santrifüj filtre üniteleri Pipet 160 ul. Bir araya toplanan-akış (5.7 ve 5.8 adım) endoproteinaz Lys C tarafından yayımlanan peptidleri içerir </li><li> Yeni bir toplama tüpüne ultrafıltrasyon ünitesi aktarın. 40 ul ekleTripsin (protein oranı 1:100 enzim) ile DB ve 1 dakika için termo-mikser içinde 600 rpm&#39;de karıştırın. 4 saat 37 ° C&#39;de nemli bir oda içinde birimleri inkübe edin. Tekrar triptik peptidler toplamak için 5.7 ve 5.8 adımları. </li></ol> 6. Peptides kantitasyonu <ol><li> Üstünde, triptofan artıklarının çözücüye iyi erişilebilir olduğu için, protein sindirimi peptid içeriği için olan ölçüm seyreltilmiş tamponda gerçekleştirilebilir. </li><li> Kuvars küvete ABB, 0.2 ml pipet ve &#39;boş&#39; için emisyon spektrumunu kaydedebilirsiniz. </li><li> ABB ile küvete ve nazik karışımı TSS 1 ul hacimde ekleyerek 0.1 ug adımları kullanarak kalibrasyon eğrisi hazırlayın. </li><li> Küveti temizleyin. </li><li> Örnek Pipet ve spektrumu (örnek) kaydedebilirsiniz. </li><li> , Protein ve peptid konsantrasyonu hesaplamak 0.1 ug protein, triptofan b edilen karışımlarda triptofan içeriği ortalama% 1.1 &#39;göre yaklaşık 9 ug protein (karşılık gelen yanay) insan hücreleri lize protein içeriği özetle örnek veya peptit içeriği eşittir: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> F (normu1) 0.1 ug triptofan standart floresan olduğu. Peptid içeriği sindirim prosedürünün verim hesaplanmasını mümkün kılacak ve peptit fraksiyonasyon ve kütle spektrometrik analizi aşağıdaki için gerekli bilgileri sağlar. </li></ol> 7. Lys-C ve Triptik peptidlerin Fraksiyonu <ol><li> Sırasıyla Brub pH 11 ve pH 5, 0.2 ml, ile, Lys-C ve tripsin ile sindirimler ile elde edilen peptid çözüm seyreltin. </li><li> Santrifüj tüp adaptörü kapağı SAX ucu-sütun birleştirin. </li><li> Brub, Lys-C peptidleri ayrılması için pH 0.1 11 ml metanol, 0.1 ml ile arka arkaya 1 M NaOH, 0.1 ml, ve 3 kez SAX ucu sütun yıkayın ve dengeledes ve Brub, triptik peptidler için pH 5,. Sütun malzemeden geçen solüsyonların akış 4000 x g santrifüjleme ile kolaylaştırılır. </li><li> Ve Lys-ayrılması için 4; &#39;StageTips&#39; - Yıkama ve C18 denge - daha sonra daha sonra &#39;ile StageTips&#39;, metanol, 0.05 ml Tampon B ile 0.05 ml ve Tampon A içinde 0.05 ml altı C 18 ile hazırlayın C peptidler ve triptik peptidlerin ayrılması için iki. </li><li> &#39;StageTip&#39; - C 18&#39;de SAX İpucu-sütun birleştirin. Dengelenmiş SAX İpucu-sütunlar halinde örnek çözümler yerleştirin ve 3 dakika boyunca 5.000 xg&#39;de sütunları santrifüj. </li><li> 0,1 sırasıyla Lyc-C Brub ml, pH 11 ya da pH 5 ve triptik örnekleri ile &#39;pipet ucu&#39; sütun dengelenmesi. 5000 x g santrifüjleme ile akışını kolaylaştırmak. </li><li> Bir sonraki C 18 SAX Tip-sütun transfer - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Lys C ve örnek için BRU ile Brub pH 6, 4 ve 2 ile peptidlerin yıkama devamTriptik peptitler ile örnek için B pH 2. &#39;StageTip&#39; - Her yıkama adımı ayrı bir C 18 kullanın. </li><li> Tampon A içinde 0.05 ml &#39;StageTips&#39; - C18 yıkayın </li><li> Bir kütle spektrometresi ile monte LC sistemi içine enjeksiyon için numunelerin doğrudan kullanılan şişelere Tampon B içinde 0,05 ml fraksiyonlar elue. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

Yazar ifşa hiçbir şey vardır.

, Nükleik asit sekanslama ve mikrodizi teknikleri ile karşılaştırılabilir bir derinliğe proteomik teknolojisi ile FFPE malzeme çalışma yeteneği biyomarker ve ilaç hedefi tespiti yeni ufuklar açabilir. Açıklanan protokol karakterizasyonu ve 10000 protein bir ölçekte microdissected hücre popülasyonlarının proteomlarda miktarını ölçülebilir sağlar. Microdissected malzemenin daha az kullanıldığında daha küçük bir veri setleri üretilebilir, ancak belki de bir çok durumda, aynı zamanda, bu önemli klinik veriler sağlayabilir. Bu nedenle, numuneler ya MED-FASP işleminden sonra direkt olarak analiz edilebilir veya daha fraksiyonlarda ayrılabilir. FASP prosedür proteaz herhangi bir türü ile uyumlu olduğundan, diğer enzimler ya da bunların kombinasyonu protein sindirimler 6&#39;dan kullanılabilir. FFPE malzeme kalitesi analizi en kritik bir konu olduğu görülmektedir. Biz sabit aynı kökenli doku ama gelen farklı olduğunu yaşadımKBB klinikleri farklı özellikleri vardı. Başka bir klinikte benzer malzemenin neredeyse işe yaramaz iken, biz yüksek verimde peptitler oluşturmak başardık tek bir kaynaktan doku kullanma. Bu fiksasyon uygulanır ve gömme işlemleri hem de depolama koşulları klinik malzeme 12&#39;nin özelliklerini etkileyen önemli faktörler olduğu muhtemeldir. Bu nedenle, daha büyük bir başlatmadan önce birkaç örnek özelliklerini test etmek için tavsiye edilir. Birçok yayın geçmişte FFPE malzeme kullanımını rapor etmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmalarda tanımlanan proteinlerin sayısının fazla 1,000-2,000 proteinleri 4 geçmemiştir. 10.000 &#39;den fazla protein ihtiva eden insan hücre spesifik proteomlarda büyüklüğü göz önüne alındığında, bu tür çalışmalar, hemen hemen temizlik işlevleri dahil çok fazla proteinler ile sınırlı çok yüzeysel bir resim sağlamak için sadece mümkün. Bizim protokol klinik veya biyolojik madde f etkili izolasyonunu sağlayanrom doku korunmuş ve parçalama, protein işleme ve peptid prefractionation için optimize edilmiştir. Sonuç olarak bizim örnek hazırlama, iş akışı, high-end kütle spektrometresi ile birleştiğinde, neredeyse tam bir proteomlarda içgörüler verir. Kayda değer, bu dakika Numune miktarı gereksinimleri mümkündür. Korunmuş dokuların kullanmanın büyük avantajı kendi göreceli geniş yer olduğunu. FFPE örnekleri yıllar ve on yıllar boyunca arşivlenir ve bazen yararsız kabul, şimdi, proteomik teknoloji sayesinde, klinik araştırmalar için de son derece değerli malzeme görünür. Birçok hastalık FFPE malzemenin taze veya dondurulmuş malzeme soruşturma kullanılarak incelenebilir Oysa nadir hastalıklar 12 araştırılması için özellikle önemli gibi görünüyor, örnek bir temsilcisi kümesi genellikle uzun bir zaman alıyor koleksiyonu vardı.

Paraformaldehitle Tespit ve parafin (FFPE) gömme korunması ve klinik doku malzeme pathomorphologic soruşturma için standart bir yöntemdir. Korunmuş doku Mikroskopi hastalığı ile ilgili morfolojik değişikliklerin belirlenmesi ve hastalık ile ilgili antijenlerin meydana algılanmasını ve puanlama sağlar. FFPE örnek genellikle sadece küçük bir kısmı bu analizlerde kullanılan olduğundan, klinik malzemenin büyük miktarlarda arşivlenmiş kalır ve çalışmalar, diğer türleri de yararlanılabilir. Son on yılda yaşam bilimleri araştırma güçlü proteomik teknolojisi ile güçlendirilmiştir. Bu teknoloji sağlayan karmaşık bir protein karışımları içinde binlerce proteinin tanımlanması ve kantitatif. Teknolojisinin önemli bir özelliği, büyük ölçekli analizleri için malzeme, sadece az miktardaki gerekli olmasıdır. Son çalışmalar, proteomik proteinler yaklaşık comp bir ölçekte incelenebilir göstermiştirlete 1, 2 Proteomlar. Araştırmaların Bu tür hücrelerin kompozisyon ve hastalıklarda anormal seviyelerinde meydana gelen proteinlerin gruplarının tanımlanmasında sistem geniş bir bakış açısı sağlar. Bu çalışmaların büyük bir kütle spektrometresi kapasitelerini gerekli ise, son iş kimlik benzer ölçüde ölçümü 3 tek bir gün içinde elde edilebileceğini göstermiştir. Nispeten düşük örnek miktarının ihtiyacı ve korunmuş klinik örneklerin geniş yer FFPE malzemenin proteomik keşif (bir yorum 4 görmek için) sağlayan yöntemler geliştirmek için bize ve başkalarına cazip. Biz sabit doku 5 proteinlerin kantitatif çıkarma sağlayan bir protokol geliştirdik bir ısı tedavi altına formalin fiksasyon reversibilitesi yararlanarak. Sabitlemek için prosedür proteinleri değil, aynı zamanda en azından bir dönüşüm sonrası modifikasyonlar, sadece muhafaza göstermiştir. Phosphorylation ve N-glikosilasyon ancak FFPE örnekleri 5, bu iyice kontrollü doku toplama, depolama ve tespit koşulları olan bir ön kullanılarak incelenebilir. Sonra, sabit bir doku lazer yakalama mikrodiseksiyon ve proteomik reaktör merkezli örnek işleme 6, 7 yöntemini optimize ettik. Kolorektal kanseri üzerinde büyük ölçekli bir çalışmada klinik malzeme 8 microdissected 7.500 proteinlerin kantitatif analiz izin. Son olarak, üst üste iki adım protein sindirimi protokolünü 9 uygulayarak microdissected malzeme keşif yolu düzeldi. Tek bir enzim ile sindirim ortak stratejileri ile karşılaştırıldığında, bu prosedür daha sekansa özgü peptidlerin nesil sağlar ve dolayısıyla, protein tanımlama daha yüksek bir derinlik ile sonuçlanır. Microdissected insan kolon adenom analizi örnek 3 başına 9500 proteinlerin derinliğe kadar proteomik analiz izin verdi. Bu saplamaen az 2 peptidleri ile 88-89% proteinlerin tanımlanmasına izin veren numune başına 55,000 peptidler eşleştirilir y. Burada LC-MS/MS analizi için FFPE malzemeden numunelerin hazırlanması için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu protokol bir reaktör biçimi (FASP) in Mikrodiseksiyon için doku dilimleri hazırlanması, izole edilmiş hücrelerin parçalanma ve numune işleme oluşur 6. Sonra peptid verimleri bir spektroflometrik belirlenmesini açıklamak; optimum peptid tanımlanması için yüksek öneme sahip bir görev kütle spektrometresi ile. Son olarak, güçlü anyon değiştirici (SAX) esaslı peptid paya ayırma için ayırma tekniği göstermektedir. Bu yöntemde, peptid ayrılması ve son temizleme hem de pipet ucu microcolumns 10, 11 kullanılarak yapılmaktadır. Bu adım, isteğe bağlı, ancak daha az mikrogram fazla peptitler tek numuneden elde edilebileceği çalışmalarda önerilir. SAX-fraksiyon ölçüde ident sayısını ve dinamik aralığı artırabilirifications ve protein dizisi kapsama 3, 10 uzanır.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Korunan klinik malzeme insan bozuklukları proteomik soruşturma için eşsiz bir kaynaktır. Burada formalin büyük ölçekli kantitatif analiz sabit ve parafin (FFPE) doku sağlayan optimize edilmiş bir protokol açıklar. Prosedür, dört ayrı adımları içerir. Birincisi FFPE malzeme ve ilgi duyulan hücrelerin mikro-kesim gelen bölümlerinin hazırlanmasıdır. İkinci aşamada izole edilmiş hücreler lize edildi ve &#39;filtre destekli numune hazırlama&#39; (FASP) tekniği kullanılarak işlenir. Bu aşamada, protein numune lisis için kullanılan tepkin maddeler tükenmiş ve endoproteinaz lysC ve tripsin kullanılarak iki adımda sindirilir. Her bir sindirimden sonra, peptidler ayrı fraksiyonlar halinde toplanır ve bunların içeriği son derece hassas bir floresan ölçümü ile belirlenir. Son olarak, peptidler &#39;pipet ucu&#39; microcolumns üzerinde fraksiyone edilmiştir. LysC-peptidler ise 4 bölüme ayrılır triptik peptides 2 bölüme ayrılmıştır. Bu şekilde hazırlanan numuneler 10000 protein derinliğe kadar malzeme az miktarda ikinci proteomlarda analizini sağlar. Bu durumda, tarif edilen olası biyolojik akışı ve ilaç hedefleri tespit edilmesi için de bir sistem geniş bir şekilde hastalıkların çalışmak için güçlü bir tekniktir.

FFPE malzeme proteomik analizi numune hazırlama için sağlam ve tekrarlanabilir yöntemleri gerektirir. Bu yayında etkili sabit malzemeden hücre popülasyonlarının izole edilmesini ve doğrudan LC-MS/MS analizi için kullanılabilecek yüksek saflıkta elde edilen peptit parçaları olarak kimyasal işleme izin veren bir protokol göstermektedir. FFPE örnekler ve mikro-kesim, MED FASP yaklaşımı kullanılarak proteinlerin örnek ve işleme (2) liziz, ve (3) miktarının ve (4) damıtımı bölümlerinin (1) hazırlanması: Prosedür, dört ayrı bölümden oluşur peptidler (Şekil 1). Prosedürün ilk aşamasında FFPE numuneler bir mikrotom ile kesitli ve zar kaplı slaytlar üzerine monte edilmiştir. Doku bölümleri ve slayt zarın yüzeyi arasındaki yapışmayı arttırmak için, UV ışığı ile kayıcı yüzey ışın tedavisi için gereklidir. Bu amaçla, bir UV lambasının ışık kullanımıBir hücre kültürü tezgah entegre. Bu aşamadan sonra slaytlar örneklerin parafin ve rehidrasyon çıkarılmasını sağlayan yıkama tabi tutulur. Rehidrate madde, kısa bir süre için hematoksilin ile boyandı. Bu numunenin bir zayıf lekelenme ile sonuçlanır, ancak mikro-kesim için örnek alanlar görselleştirilmesi için yeterlidir. Boyama işlemi, su fazlası ile slaytları durulama ile hızla durdurulmalıdır. Fakir peptid getirilerindeki numune sonuçlarının bir uzun süreli boyama. Bir sonraki adımda, kuru bölümler mikrodiseksiyon tabi tutulur. Tek tek hücrelerin doku alanlarının seçimi soruşturma türüne bağlıdır ve her zaman histoloji veya pathomorphology özel bilgi gerektirir. Lazer yayımlanan malzeme, numune toplama tüpleri yapışkan yüzeyleri üzerinde toplanır. Yapışkan malzemenin bağlama kapasitesi sınırlı olduğu için t kapak arasındaki microdissected malzeme transferi için gerekli olanörneğin her 3-5 mm 2 diseksiyonu sonra o tüpü. Bu kolayca, kapak ve bir santrifüj tüpünün kısa bir iplik üzerine doku liziz tamponu (LTB) birkaç mikrolitre pipetleme ile yapılabilir. Numune, tüpün alt toplanan sonra kapak üzerindeki mikrodiseksiyon ve numune toplama devam edilebilir. Bütün numune toplanmaktadır sonra tüpler, ek olarak 1 saat boyunca sürekli ajitasyon ile 99 ° C &#39;de Parafilm ile kapatılır ve bir su banyosu içinde inkübe olması gerekir. İnkübasyon sırasında, su kapak üzerinde yoğunlaşır için, her 15 dakikada bir kısa bir süre tüpler tüp koni içindeki suyu geri toplamak için santrifüj gerekir. Peptidler elde etmek için doku lizatları, MED-FASP yaklaşımı kullanılarak işlenir. Bu yöntemde, lize edilmiş proteinler sisteinil kalıntılarında carboamidomethylated deterjan ve diğer düşük molekül ağırlıklı maddelerden tükenmiş ve daha sonra art arda, iki enzim ile sindirilmiş difbunların parçalanma Özelliklerdeki fering: lysC ve tripsin endoproteinaz. Her sindirim aşamasından sonra peptidler ayrı fraksiyonlar halinde toplanır. Numune hazırlama bu bölümünde, başlangıçta zar geçirilen filtrasyon ünitesi yüklenen çözeltisinin fazla% 95 kadar santrifüj adımları her devam etmek önemlidir. Kolon doku ve kanser analiz biz bu yöntemin verimi 100 nl microdissected madde (Tablo 1) (100 ug, doku ya da bir 10 um kesiti 10 mm2) başına peptidin 3-6 ug. Dokulardan ekstre total protein ekstraksiyonu ve sindirim işlemleri birlikte orjinal taze dokuya ilgili olarak bir% 30-60 verimle sonuçlanan doku ağırlığının yaklaşık% 10 olduğu. Bu değerler, dehidrasyon ve boyama, mikro-kesim ve ultrafiltrasyon birimleri sindirilmemiş numunenin kısmının tutma sırasında proteinin kayıplarını göstermektedir. Çünkü hiçbir çıkarma ve işlemen-microdissected FFPE doku bu kritik örnek kayıpları MED-FASP önce tüm adımları sırasında meydana olasıdır 75,% 5 protein-to-peptid-dönüşüm verimi ile sonuçlanmıştır. Bu prosedür ile elde edilen peptid karışımlarının önemli bir özelliği, bundan başka ayırma peptid ayırma işlemi ve kütle spektrometrisi tanımlanmasını kolaylaştıran yüksek saflıkta. Yakın zamanda, kolorektal adenoma örnekleri 3 analizi ile gösterilmiştir. Bu çalışmada, MS / MS ve etkinlikleri yaklaşık% 40 FFPE dokudan peptidlerin belirlenmesine yol açmıştır ve bir LC-MS/MS çalışma başına kadar 17000 peptidler haritalama ile sonuçlanmıştır. Daha yüksek oranlar tanımlama sadece donmuş in vitro kültürlenmiş hücrelerin 3 analizinde elde edilmiştir. Bütün prosedürün son iki bölgelerinde izole peptidler nicelendirilir ve pipet ucu microcolumns göre parçalara ayrılmış. Microdissected dokusundan izole peptidin miktarlarda olmak olduğuDüşük 10 ug bunlar yaygın olarak kullanılan boya bazlı protein tahlilleri kullanılarak sayısal olamaz. Ayrıca bu konsantrasyonlarda A 280 UV-spektral ölçümler sayesinde ışık saçma etkisi yararlı değildir. Bunun aksine, triptofan artıklarının floresans ölçümleri peptit içeriğinin belirlenmesi için güvenilir bir yol sunar. Son zamanlarda kültürlenmiş hücrelerden 5000 proteinler, &#39;tek bir atış&#39; 4 saat LC-MS/MS analizi 7 tespit edilebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte bu tip analiz nadiren 3.000 &#39;den fazla bin proteinlerin tespiti sağlar: yerli dokulara uygulanır. MED FASP üretilen peptitler LC-MS/MS önce ön parçalandı gereken analizin derinliğinin arttırmak. SAX tabanlı mikro kolon ayırma basit ve verimli bir ayrıştırma yöntemi 10 olduğunu. Zaten sabit doku 5, 8, 9 analiz de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalarda proteomik uygulanmıştır. SAX-&#39;pipet ucu&#39; microcoluMNS ve C 18 - &#39;StageTip&#39; tuz giderme sütun 9 hazırlanması kolaydır. Sütunlar, fişlerin istifleme ile monte SAX kesmek veya C 18 membranlar, 200 ul pipet 11 edilmektedir. SAX-parçalandı FFPE numunelerin analizi örnekleri, Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Şekil 1. Prosedür genel bakış. FFPE örnekler ve mikro-kesim, MED FASP yaklaşımı kullanılarak proteinlerin örnek ve işleme (2) liziz, ve (3) miktarının ve (4) damıtımı bölümlerinin (1) hazırlanması: Prosedür, dört ayrı bölümden oluşur peptidler. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Örnek </td><td fo:width="1in"> Örnek ön ayırma / sindirim </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> El Kütle spektrometresi </td><td fo:width="1.25in"> Peptit verim ng / nL örnek (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Tek bir örnek Başına benzersiz Protein Tanımları </td><td fo:width=".75in"> Referans </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • Normal kolon mukozası </td><td> SAX / bir enzimi </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8), 30 ± 8 (n = 8), </td><td> 5985 ± 54 5.868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • Kolon Adenom </td><td> SAX / iki enzimler </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6.1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. FFPE microdissected doku proteomik analiz temsil edici sonuçları.

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Arşiv formalin sabit ve (FFPE) gömülü parafin klinik numuneleri hastalıkların araştırılması için değerli bir malzemedir. Burada microdissected FFPE doku derinlemesine proteomik analizini sağlayan bir örnek hazırlama iş akışını göstermektedir.

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

proteomic-sample-preparation-from-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Biology

27.5K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Biochemistry.  Arşiv formalin sabit ve (FFPE) gömülü parafin klinik numuneleri hastalıkların araştırılması için değerli bir malzemedir. Burada microdissected FFPE doku derinlemesine proteomik analizini sağlayan bir örnek hazırlama iş akışını göstermektedir. 

Video: Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Biyoloji

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp.</emProteomik Araştırmalar> Kültürler

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...