עבודה זו התאפשרה הודות לקרן הרקמה האנושית וחקר תא, מה שהופך את הרקמות אנושיות זמינות למחקר. תמיכה כספית עבור עבודה זו קיבלה מהמשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (שם מענק: כבד רשת וירטואלית, מספר מענק: 0,315,759) וHepacult GmbH. תודתנו גם ללכת לעוזרים הטכניים מבנק רקמות Grosshadern בית החולים לאיסוף הדגימות הכבד והעוזרים הטכניים ממתקן Core בידוד תא לביצוע זלוף הכבד ובידוד הפטוציט. בפרט, אנו רוצים להודות לNatalja Löwen עבור הוכחת בהליך זה בווידאו. לבסוף, ברצוננו להודות לNatalja Löwen וEdeltraud Hanesch ליצירת האיורים לאיור 1 ודמויות בסקירה סכמטית של הווידאו.

1. הכנה של פתרונות זלוף ובידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות דרושים לטפטוף של חתיכת הכבד והבידוד של hepatocytes לפי טבלת 1. ניתן לאחסן את פתרונות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון סטרילי כל הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הפתרונות שבאים במגע עם הכבד צריכים להיות סטרילי. </li></ol> 2. הכנת זלוף הציוד ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציוד לטפטוף של פיסת הכבד יש להגדיר כפי שמוצגים באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבט המים צריך להיות מוגדר בטמפרטורה מתאימה, שהוא שונה בכל ניסיוני הגדרה מסוימת, כך שהפתרונים נמצאים בטמפרטורה של C ° 37 כאשר הם מגיעים לחתיכת הכבד. במקרה זה, אמבט המים מוגדר 41 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הפתרונות 1, 2 ו -3 וקבל זכוכית במעיל. פתרון 4 יש לחמם עד37 מעלות צלזיוס באמבט מים נפרד לשימוש כדי להפחית את האובדן של פעילות collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן קצר לפני זלוף הכבד, להדליק את הרגולטור של מיכל הדלק המכיל 95% O 2/5% CO 2 לגז מנגנון החמצון (איור 1E). </li></ol> 3. טפטוף של הכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לקבל חתיכת כבד עם כמה שיותר הקפסולה של Glisson שלמה ככל האפשר ואופן אידיאלי עם משטח רק 1 לחתוך מפתולוג לזלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכת הכבד הזה במשפך ביכנר המכיל מסנן דיסק מחורר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת זלוף צריכה להיות דרוכה עם פתרון 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קצב זרימה נמוך, cannulae השקיה המעוגל עם טיפים זית צריך להיות מוכנס לתוך כלי דם גדולים יותר על פני השטח החתך של פיסת הכבד. הדם שוטף החוצה מן הכבד, הרקמות הופכת להיות קלות יותר באזורים עם זלוף טוב. מספר cannulae משמש לגדלים שוניםשל כבדים מוצג באיור 2 א. גודל מד נבחר צריך לגרום להתאמה הדוקה שתחזיק cannulae במקום. יש להשאיר כלי הדם הקטנים יותר פתוחים לחיץ זלוף לניקוז מחוץ לחתיכת הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיל את קצב הזרימה במשאבת peristaltic לבין 110-460 מיליליטר / דקה בהתאם לגודל של הכבד (איור 2). התוצאה היא קצב זרימה של 44 ± 16 ממוצע מיליליטר / דקה לצינורית (איור 2 ג). המהירות שנבחרה תלויה בחתיכת הכבד וצריכה לגרום להתפחה עד קלה של חתיכת הכבד. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להדק את שהחלק מכלי השיט הפתוח עם מלחציים בכלי דם מיקרו על מנת להשיג את ההתפחה הקלה שהוזכר לעיל. זלוף טוב ניתן להבחין כאשר חתיכת הכבד היא צבע בהיר יותר לאורך כל דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על פיסה הלחה הכבד במהלך זלוף על ידי כיסוי אותו עם פיסת הגזה הספוגה בתמיסת מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse עם 1 ליטר של פתרון 1 כדי לשטוף את כל remaining דם בחתיכת הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את נוזל זלוף לפתרון 2 וינקב עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את נוזל זלוף לפתרון 3 וינקב עם 0.5 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את נוזל זלוף ל4 פתרון, אשר מכיל .1-0.15% מcollagenase (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצעד זה, זלוף צריך להתבצע באופן מחזוריות ל9-12 דקות או עד שהכבד מתעכל מספיק; רקמת הכבד אמורה להופיע להתפרק מעט מתחת הכמוסה של Glisson ולהרגיש התרכך כשמשש עם הצד הקהה של אזמל. </li></ol> 4. בידוד של hepatocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את משאבת peristaltic ולהסיר cannulae מחתיכת הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חתיכת הכבד בצלחת מתגבשת המכילה 100-200 מיליליטר של פתרון 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקפסולה של Glisson בזהירות ובעדינות לנער את התאים. אם ישנם אזורים שאינם perfused היטב, אזמל יכול לשמש כדי לחתוךאזורים אלה כדי לשחרר את התאים בתוך. הוסף עוד פתרון 5 צורך כבמהלך התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עוד פתרון 5 עד לנפח סופי של 500 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן השעיה תא פעמיים; ראשון דרך רשת 210 ניילון מיקרומטר ואחריו רשת ניילון 70 מיקרומטר. , הבא לשפוך את ההשעיה התא לתוך 200 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב72 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant ותא גלולה בעדינות resuspend בעדינות ב200 מיליליטר של פתרון 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מספר שלב הכביסה 4.6 שלוש פעמים. על המדרגה צנטריפוגות הסופית, תאי resuspend בפתרון אחסון קר (ראו רשימה של חומרים). תאים צריכים להיות כ 2-5,000,000 hepatocytes למיליליטר להערכה של תשואה וכדאיות באמצעות assay הרחקת trypan הכחול מבוסס hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע את assay הרחקת trypan הכחול, להוסיף 0.1 מיליליטר של תאים בדילול כראוי (2-5,000,000 ≈ / מיליליטר) לצינור microfuge מכיל 0.5 מיליליטר של soluti trypan הכחולב( 0.4% trypan הכחולים מומס בפוספט שנאגרו מלוח (PBS)) ו0.4 מיליליטר של PBS. לאחר ערבוב ההשעיה התא ביסודיות, טען hemocytometer עם ההשעיה ולבחון תחת מיקרוסקופ בהגדלה 100X. תחת מיקרוסקופ, התאים המתים יהיו מוכתמים כחולים ואילו תאי החיים מופיעים בלא כתם. לספור את מספר תאי חיים ומוחלט בכל אחד ממ&quot;מ 2 הרשתות 1 מסומנת על hemocytometer. כדאיות (%), תשואה של תאי חיים (מיליון hepatocytes למיליליטר פתרון אחסון קר (CSS) או מיליון hepatocytes לכבד ז) יכולה להיות מחושבת באמצעות נוסחאות שלהלן. </li></ol><img alt="משוואת 1" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1.jpg" /> הערה: במקרה זה, גורם לדילול trypan הכחול הוא 10 וגורם hemocytometer הוא 10,000.

<ol>
	<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Schneider, W. C., Potter, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assay+of+animal+tissues+for+respiratory+enzymes+II.+Succinic+dehydrogenase+and+cytochrome+oxidase.">The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).</li><li>Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+Binucleate+Cell+Counts+in+Resting+and+Regenerating+Rat+Liver+Employing+a+Mechanical+Method+for+the+Separation+of+Liver+Cells.">A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells.</a> Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).</li><li>Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mass+Isolation+of+Whole+Cells+from+Rat+Liver.">The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver.</a> Science. 117, 627-628 (1953).</li><li>Jacob, S. T., Bhargava, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Method+for+Preparation+of+Liver+Cell+Suspensions.">New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions.</a> Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).</li><li>Berry, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Properties+of+Cells+Isolated+from+Adult+Mouse+Liver.">Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver.</a> Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).</li><li>Laws, J. O., Stickland, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+Isolated+Liver+Cells.">Metabolism of Isolated Liver Cells.</a> Nature. 178, 309-310 (1038).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Rat-Liver+Cells+.3.+Enzymatic+Requirements+for+Tissue+Dispersion.">Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion.</a> Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).</li><li>Thasler, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charitable+State-Controlled+Foundation+Human+Tissue+and+Cell+Research:+Ethic+and+Legal+Aspects+in+the+Supply+of+Surgically+Removed+Human+Tissue+For+Research+in+the+Academic+and+Commercial+Sector+in+Germany.">Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany.</a> Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).</li><li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver.">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Pure+Hepatocytes+and+Reticuloendothelial+Cells+in+High-Yield+from+a+Single-Rat+Liver+by+Means+of+Percoll+Centrifugation+and+Selective+Adherence.">Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence.</a> J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).</li><li>Cantrell, E., Bresnick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzpyrene+Hydroxylase-Activity+in+Isolated+Parenchymal+and+Nonparenchymal+Cells+of+Rat-Liver.">Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver.</a> Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).</li><li>Weiskirchen, R., Gressner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of hepatic stellate cells.</a> Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).</li><li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steatotic+versus+cirrhotic+livers+as+a+source+for+human+hepatocyte+isolation.">Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation.</a> Transplant P. 33, 664-665 (2001).</li><li>Renz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+extended+donor+criteria+liver+allografts+maximizes+donor+use+and+patient+access+to+liver+transplantation.">Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation.</a> Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).</li><li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+donor+criteria+have+no+negative+impact+on+early+outcome+after+liver+transplantation:+a+single-center+multivariate+analysis.">Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis.</a> Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).</li><li>Alexandre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+pre-,+intra-+and+post-operative+parameters+of+donor+liver+on+the+outcome+of+isolated+human+hepatocytes.">Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+review:+Hemostats,+sealants,+and+adhesives+II:+Update+as+well+as+how+and+when+to+use+the+components+of+the+surgical+toolbox.">State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox.</a> Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostats,+sealants,+and+adhesives+III:+a+new+update+as+well+as+cost+and+regulatory+considerations+for+components+of+the+surgical+toolbox.">Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox.</a> Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).</li><li>Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotoxicity+of+cyanoacrylate+tissue+adhesives.+A+comparative+study.">Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study.</a> Archives of otolaryngology--head &amp; neck surgery. 116, 546-550 (1990).</li><li>Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histotoxicity+of+cyanoacrylates.+A+selective+review.">The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review.</a> Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).</li><li>Bhogal, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+human+hepatocytes+from+normal+and+diseased+liver+tissue:+a+one+hundred+liver+experience.">Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience.</a> PloS ONE. 6, e18222 (2011).</li><li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals.">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).</li><li>Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+hepatocytes+from+slaughterhouse+organs.+An+unlimited+resource+for+bioartificial+liver+devices.">Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices.</a> ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The principles of humane experimental technique. , (1959).</li></ol>

אופטימיזציה של פרוטוקול זה מומנה בחלקו על ידי מענק מHepacult GmbH. ד&quot;ר וולפגנג Thasler הוא אחד ממייסדי Hepacult GmbH ונשאר אחד מחברי הדירקטוריון בחברה זו. העסקת Maresa Demmel היא באופן חלקי על ידי Hepacult. מריה Hauner הוא מועסק על ידי Hepacult GmbH. Hepacult היא חברת ספין אוף בתחום הביוטכנולוגיה באוניברסיטה, אשר מציעה hepatocytes אדם בהסכמה וגישה פתוחה למטרות מחקר.

פרוטוקול זה גורם לבידוד של hepatocytes האנושי עם כדאיות גבוהה ובטהרה. על מנת להשיג את התוצאות הללו, חשוב להתחיל עם חתיכת הכבד מתאימה. חתיכת הכבד צריכה הכמוסה של Glisson שלמות על כל המשטחים, פרט למשטח לחתוך 1. גורם חשוב נוסף הוא אצווה המסוים של collagenase משמש, כפי שקבוצות שונות יכולות לגרום להבדלים ניכר בviabilities של hepatocytes לאחר עיכול 11. לכן, קבוצות שונות של collagenase צריכים להיבדק ויש לקבל את המנה שמייצרת hepatocytes עם הכדאיות הטובה ביותר בכמויות גדולות. לבסוף, זמן עיכול מתאים צריכה להיות נבחר על בסיס התשואה והכדאיות של התאים שהושגו. לדוגמא, כדאיות גבוהה עם תשואה נמוכה יכולה להצביע על זמן עיכול לא מספק, ותשואה גבוהה עם יכולת קיום נמוך יכולה להצביע על כך שזמן העיכול הוא ארוך מדי. בשיטה זו ניתן להתאים to בודד תאים וhepatocytes הלא parenchymal מאותה חתיכת הכבד. אחת דרכים לעשות זאת היא להשתמש supernatant מהצעד צנטריפוגה הראשון (שלב 4.6) ישירות לבידוד תא הלא parenchymal 12. דרך שנייה היא להסיר aliquot הנדרש של השעיה תא לאחר הסינון דרך רשת הניילון לבידוד הפטוציט (שלב 4.5) ולהכפיף את ההשעיה התא שנותרה לשלב עיכול pronase נוסף לפני בידוד תא הלא parenchymal כדי להגדיל את התשואה של תאים הלא parenchymal 13. לתשואה גבוהה יותר של תאים הלא parenchymal על חשבון hepatocytes, בשיטה זו ניתן לשנות על ידי החלפת collagenase לבד (צעד 3.10) לpronase וcollagenase ובאמצעות ההשעיה תא שנוצרה לבידוד תא הלא parenchymal 14. בנוסף לבידוד hepatocytes אדם, יכול גם להיות מותאמת בשיטה זו הוצגה לבודד hepatocytes מחתיכות כבד שנאספו לכאן ולכאןמינים אחרים מ &#39;עם גדלים דומים או כלי דם בגדלים דומים. זה עשוי להיות חשוב עבור חוקרים המשתמשים במודלים חלופיים, כגון חזירי, כלבים או מודלים הפרימטים. בידודים של hepatocytes אדם נעשים בדרך כלל באמצעות כבדים משני מקורות: כל הכבדים חשבו שאינם מתאימים להשתלה או רקמת כבד נורמלית מורפולוגית משולי כריתה. היתרון של המקור זה האחרון משמש בשיטה זו הוא שחתיכות הכבד נעשות זמינה למעבדה מוקדם יותר. מייד לאחר כריתה, הכבד שעבר הכריתה הוא הביא לפתולוג שמסיר את מה שנדרש לצורך האבחון. לאחר מכן הפתולוג יסיר חתיכה מתאימה של כבד מורפולוגית רגיל לבידוד הפטוציט ממה שמיועד להשלכה. באופן כללי, חתיכת כבד מגיעה למעבדה מוכנה לזלוף בזמן ממוצע של 56 ± 29 דקות (N = 103). לשם השוואה, כל הכבדים שאינם מתאימים להשתלה יהיו רק relהוקל למעבדה בין 13 ± 2 שעות ו16 ± 12 שעות 15. בנוסף, בשל שיקולים אתיים והמחסור בכבדים תורמים, בידוד של הפטוציטים מכל כבדים שאינם עומדים בכל הקריטריונים להשתלה הוא נמנע באזור Eurotransplant. סיבה לכך הוא הכבדים האלה עדיין יכולים לשמש להשתלה עם תורם קריטריונים מורחבים. מספר מחקרים הראו כי למקסם את גישת מטופל לתוצאות השתלה בתמותת רשימת ההמתנה פחתה ותוצאות משביעות רצון לנמענים שנבחרו 16,17. יתרון נוסף הוא שהתאים המתקבלים מחתיכות כריתת כבד מבודדים מכבד בריא מורפולוגית, בעוד שכבדים אינם מתאימים להשתלה יכול להיות steatotic, fibrotic או שחמת כבדה. ככזה, השיטה כאן תוצאות בתשואה גבוהה של 13 ± 11 מ&#39;hepatocytes לכבד גרם בהשוואה ל0.7 ± 0.3 מ&#39;או 3 ± 2 מ&#39;hepatocytes לכבד גרם מתקבל על ידי Baccarani, et al. 15 באמצעות כבדי שחמת כבדים או steatotic בהתאמה. עם זאת, חלקי כריתת כבד לגרום לתשואה כוללת נמוכה יותר של הפטוציטים כגודל של החתיכה זמינה היא בדרך כלל קטנה עם מגוון 2-250 גרם וממוצע של 37 ± 29 g (N = 648). בהשוואה לקבוצות אחרות, פרוטוקול זה ימנע את השימוש בדבקי cyanoacrylate. אלכסנדר, et al. 18 מצא כי השימוש בcyanoacrylate אתיל, דבק לכל המטרה בשימוש נפוץ, כדי לכסות את פני שטח החתך של הכבד, תוצאות בתשואה מוגברת של הפטוציטים מ3.5 ± .7-6.0 ± 1.6 מיליון hepatocytes לגרם כבד עם הערכים באו לידי ביטוי באמצעי ± שגיאת התקן של ממוצע. לשם השוואה, בפרוטוקול זה הוא מסוגל להשיג תשואה של 13.5 ± 0.4 מ&#39;hepatocytes לכבד גרם (בא לידי ביטוי באמצעי ± שגיאת התקן של ממוצע) ללא השימוש בדבקי cyanoacrylate. בעוד דבקי cyanoacrylate שימשו לסגירת פצעים &lt;sup&gt; 19,20, דבקים cyanoacrylate כיתה רפואית כגון cyanoacrylate octyl וcyanoacrylate וטיל יכולים להיות יקרים בהשוואה לcyanoacrylate אתיל. עם זאת, נגזרים שרשרת קצרה יותר כגון cyanoacrylate אתיל כבר נמצא להיות יותר histotoxic מ נגזרי שרשרת ארוכים יותר 21,22. שיטה זו היא פשוטה יותר ויותר זמן יעיל עקב השימוש של cannulae השקיה המעוגל עם טיפים זית. השימוש בcannulae של גודל מתאים יגרום התקף חזק שמחזיק את cannulae במקום ללא השימוש בדבק או תפרים 18 23. יש לי cannulae משמש קטרים ​​הנעים בין 1-2 מ&quot;מ בקטרים ​​טיפ בגודל 1.25-4.5 מ&quot;מ. מבחר של גדלים שונים צינורית צריך להיות זמין כאשר חתיכת כבד מוכנה לcannulation, כך שניתן לבחור את הצינורית בגודל המתאימה לכלי דם מסוימים, כפי שמוצגת בסרטון המצורף. שיטה זו גם מנצלת יותר cannulae באופן כללי (איור2A) בהשוואה למחקרים אחרים שבם 2 23 או 2-4 18 cannulae משמשים. זה עשוי לעזור להשגת זלוף טוב יותר לאורך כל הקטע המוביל לכדאיות גבוהה ותשואה בתקופה קצרה יותר לעיכול בכבד. לסיכום, פרוטוקול זה מבודד את hepatocytes אדם, אשר מהווה מודל חשוב ללימוד חילוף חומרים תאיים, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה של xenobiotics, התחדשות כבד ומחקר translational. סקר קודם על 150 תרופות הגורמות לרעילות אדם הראה כי ההתאמה בין הרעילות שנמצאה במחקרים בבעלי חיים וזה שנצפה בפרקטיקה קלינית היא 70% 24. לפיכך, hepatocytes אדם יישאר מודל חשוב לאימות מחקר שנעשה במודלים של בעלי חיים ועבור בדיקות סמים מוביל לתופעות לוואי לפני שהוא הולך לניסויים קליניים. יתר על כן, השימוש בhepatocytes האדם שבודד דגימות כבד שריד או hepatocytes מבודד מחיות המטבחיים 25 כמודל הואבקו אחד עם המסגרת האתית 3R 26 להחליף את השימוש בבעלי חיים במחקר במידת האפשר.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/50615/isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure </a>
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>0.5&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.
The Final Concentration of EGTA in Solution 2 and the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate in solutions 3 and 4 have been updated in Table 1.

Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

השעיה תא כבד ניתן להכין מהכבד בשיטות מכאניות או אנזימטי. שיטות מכאניות המשמשות להכנת תאי כבד שלמים כוללות כפייה של כבד דרך הגזה 2, רועד חתיכת כבד עם חרוזי זכוכית שייקרה קאהן 3, באמצעות homogenizers זכוכית עם עלי רופף 4,5 וכו &#39;במהלך השנים, שיטות מכאניות נפלו מתוך להעדיף בשל הנזק לקרומי תאים ואובדן התפקוד של הפטוציטים המבודדים 6,7. כתוצאה מכך, השימוש בשיטה אנזימטית הוא כיום השיטה העיקרית לבידודה של הפטוציטים. בידוד של hepatocytes באמצעות שיטה האנזימטית השתפר מאוד כאשר ברי והחבר 8 perfused collagenase וhyaluronidase דרך כבד דרך וריד הפורטל בחולדות. תהליך זה מנוצל זלוף כלי הדם כדי לאפשר לאנזימים לבוא במגע קרוב עם רוב של התאים, מה שמוביל לעלייה של פי 6 בתשואה של hepatocytes 8. יתר על כן, שיטה זו הניבה תאים ששמרו על השלמות המבנית שלהם, עם כמעט ללא שינוי של reticulum endoplasmic לתוך שלפוחית ​​מבודדת ולא נגרם נזק המיטוכונדריה 8. שיטה זו שונה על ידי 1 Seglen, שהיה חלוץ הליך זלוף שני שלבים לבידוד בתאים כבד. בהליך זה, בכבד חולדת perfused עם 2 + חיץ חופשי Ca אחרי זלוף עם חיץ collagenase המכיל Ca 2 + 1. ההסרה של Ca 2 + בשלב הראשון מסייעת לשבש דסמוזומים, תוך התוספת של Ca 2 + בשלב השני נדרשת לפעילות collagenase אופטימלית 1,9. בהתחשב בכך שהעבודה שפורסמה שתוארה לעיל בוצעה בחולדות, מאמר זה נועד להדגים הליך שונה שיכול לשמש לבידודה של הפטוציטים עם כדאיות גבוהה מזמזוםכבדים. השימוש בhepatocytes האנושי נשאר חשוב למחקר translational ולאימות ניסויים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים. חתיכות הכבד האנושיות השתמשו במחקר זה נרכשו בהסכמה לממשל דרך הקרן לחקר רקמות ותאים אנושיים, קרן ללא כוונת רווח בשליטה ממשלתית 10. לאחר הפתולוג הסיר את מה שנדרש לאבחון, חתיכות כבד נאספו מהרקמות שנותרו. הרקמה מחולק על ידי פתולוג הייתה מורפולוגית רקמה בריאה המתקבלת משולי כריתה לאחר כריתת כבד.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td>Ga&szlig;ner Glastechnik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass jacketed condenser</td>
			<td>Ga&szlig;ner Glastechnik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 &deg;C Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>35723-H24/EG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &deg;C Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)</td>
			<td>Linde</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas permeable tubing</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>2-4440</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>IP65</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>320010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5171014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flasks 1 L</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2121654</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flasks 5 L</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2121673</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2110654</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352075</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizing dish</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5144063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved irrigation cannulae with ball tips</td>
			<td>Ernst Kratz GmbH</td>
			<td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vascular clamps</td>
			<td>Ernst Kratz GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HT38.1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh 210 &mu;m</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh 70 &mu;m</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1419</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m sterile filters</td>
			<td>Peske</td>
			<td>99505</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2180144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2180154</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Peske</td>
			<td>06-0001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120,086</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>1508454</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Pasteur pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorised pipette filler (Pipette boy acu)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Hera safe-KS9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator (Low-flow surgical suction pump)</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>C361</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Gas Burner</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Fire Boy eco</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable laboratory coat</td>
			<td>Paperlynen GmbH</td>
			<td>MD0202414</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical mask with visor</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>48247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical hood</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>42072</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Semper Care</td>
			<td>CE0321</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Batch number NB 4G)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>17465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26868</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>01400-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Serva</td>
			<td>22700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>30180</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold storage solution</td>
			<td>Hepacult GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure

הכבד, איבר עם יכולת התחדשות יוצאת דופן, מבצע מגוון רחב של פונקציות, כגון סילוק רעלים, חילוף חומרים ועל הומאוסטזיס. ככזה, hepatocytes הוא מודל חשוב למגוון רחב של שאלות מחקר. בפרט, השימוש בhepatocytes האנושי הוא חשוב במיוחד בתחומי פרמקוקינטיקה, טוקסיקולוגיה, התחדשות כבד ומחקר translational. לכן, שיטה זו מציגה גרסה שונה של הליך זלוף collagenase שני שלבים לבודד hepatocytes כפי שתואר על ידי 1 Seglen. בעבר, hepatocytes היה מבודד בשיטות מכאניות. עם זאת, שיטות אנזימטיות הוכחו להיות מעולה כמו hepatocytes לשמור על השלמות המבנית שלהם ותפקוד לאחר בידוד. שיטה זו המוצגת כאן מתאים את עצמו בשיטה שנועדה בעבר לכבדי חולדה לחתיכות כבד אנושיות ותוצאות בתשואה גדולה של הפטוציטים עם כדאיות של 77 10% ±. העיקריהבדל בהליך זה הוא התהליך של cannulization של כלי הדם. יתר על כן, בשיטה שתוארה כאן יכולה להיות מיושמת גם לכבדים ממינים אחרים עם גדלים בכבד או בכלי דם דומים.

התקנת זלוף הציוד הדרוש לזלוף כבד יש להגדיר על פי איור 1. כדאיות ותשואה של hepatocytes אדם מבודד הכדאיות הממוצעת של hepatocytes אדם הבודד הייתה 77 ± 10% והתשואה הממוצעת של hepatocytes הייתה כבד 13 ± 11 מיליון hepatocytes / g, עם הערכים באו לידי ביטוי כאמצעי ± סטיית תקן. מספר בידודי הפטוציט מתבצע כדי להשיג הממוצעים האלה היו 648 בידודים שבוצעו מינואר 1999 לדצמבר 2012. מתאימים זלוף פרמטרים על מנת לבצע שטיפה וטפטוף של הכבד מוצלח, מספר cannulae משמש צריך להשתנות בהתאם למשקל (איור 2 א) בכבד. באופן כללי, יש להשתמש 4-8 cannulae לכבדים הנעים בין מתחת ל -20 גרם ליותר מ 80 גרם. שיעור מתאים של זלוף<html> , שהוא גם תלוי במשקל כבד, צריך להיבחר לזלוף מוצלח של הכבד (2B דמויות ו-C). זה נמצא כי מהירות ממוצעת של זלוף 44 צינורית מיליליטר / דקה -1 היא אידיאלית על פני מגוון של משקולות כבד שונות, ולכן צריכה להיות מותאמות במהירויות זלוף כראוי אם יותר cannulae משמשים. אם זלוף הוא מוצלח, הכבד צריך להיות חיוור בצבע ומעט התפיח את. טוהר hepatocytes באמצעות immunofluorescence, נמצא כי hepatocytes המבודד, שכתם באופן חיובי לאלבומין, היה טוהר 94 ± 1% (N = 4 עם 5 משכפל כל אחד) (3 א דמויות ו-B). איור 3 ג הוא תמונה בניגוד שלב נציג מראה את המאפיינים הצורניים של hepatocytes כגון גודל תא גדול וצורת תאי מצולעים. e = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615fig1.jpg" /> איור 1. חתיכת כבד התקנת זלוף. () מלכודת בועה, (ב &#39;) עם cannulae השקיה מעוגל עם טיפים זית הוכנסו בכלי דם במשפך ביכנר, הקבל זכוכית במעייל (C), מנגנון חמצון אמבט מים, (ה) (ד), ( F) 95% O 2/5% CO 2 מיכל גז ו() משאבת peristaltic G. <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615fig2.jpg" /> איור 2. (א) מספר cannulae בשימוש, (ב) שיעור זלוף (מיליליטר / דקה), או שיעור זלוף (ג) (מיליליטר / דקה. </sup&gt; צינורית) לגדלים שונים של כבד (ז). ערכים לייצג פירושו ± סטיית תקן עם N = 25, 41, 18, ​​14 ו -9 ל0-20 גרם, 20-40 גרם, 40-60 גרם, 60-80 גרם ו&gt; 80 כבד גרם בהתאמה. שונה באופן משמעותי מ 0-20 מצב גרם, P &lt;0.05. Ab שונה באופן משמעותי מגרם 20-40, 40-60 גרם ו60-80 מצב גרם, P &lt;0.05. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50615/50615fig3.jpg" /> איור 3. תמונות Immunofluorescent של תאים מבודדים חיוביים לאלבומין (א) (מוכתם בירוק) והשליטה המתאימה (B) השלילית (הגדלה 200X). גרעינים הם מוכתמים בכחול באמצעות DAPI. תמונת שלב (ג) לעומת של תאים מבודדים (הגדלה 100X). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פתרון </td><td> מרכיב </td><td> ריכוז סופי</td></tr><tr><td> פתרון 1 </td><td> נתרן כלורי </td><td> 154 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> פוטסיום כלוריד </td><td> 5.6 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> גלוקוז </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> קרבונט מימן נתרן </td><td> 25 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פתרון 2 </td><td> נתרן כלורי </td><td> 152.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 19.8 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> פוטסיום כלוריד </td><td> 5.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> גלוקוז </td><td> 5.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> קרבונט מימן נתרן </td><td> 24.8 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 0.1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td colspan="3"> כדי להכין פתרון 2, להוסיף 10 מיליליטר של 100 מ&quot;מ EGTA ל990 מיליליטר של פתרון 1. </td></TR&gt; <tr><td> פתרון 3 </td><td> נתרן כלורי </td><td> 152.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 19.8 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> פוטסיום כלוריד </td><td> 5.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> גלוקוז </td><td> 5.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> קרבונט מימן נתרן </td><td> 24.8 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> dihydrate סידן כלוריד </td><td> 0.5 מיקרומטר </td></tr><tr><td colspan="3"> כדי להכין את הפתרון 3, להוסיף 10 מיליליטר של M 0.5 dihydrate סידן כלורי ל990 מיליליטר של פתרון 1. </td></tr><tr><td> פתרון 4 </td><td> נתרן כלורי </td><td> 152.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 19.8 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> פוטסיום כלוריד </td><td> 5.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> גלוקוז </td><td> 5.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> hydr נתרןפחמתי עוגן </td><td> 24.8 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> dihydrate סידן כלוריד </td><td> 0.5 מיקרומטר </td></tr><tr><td></td><td> Collagenase </td><td> ראה טבלה 2 </td></tr><tr><td colspan="3"> להכין 4 פתרון, להוסיף כמות מתאימה של collagenase לפתרון 3. </td></tr><tr><td> פתרון 5 </td><td> נתרן כלורי </td><td> 120 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> dihydrate סידן כלוריד </td><td> 0.9 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> פוטסיום כלוריד </td><td> 6.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> אלבומין </td><td> 0.1% w / v </td></tr></tbody></table> טבלת 1. זלוף ופתרונות בידוד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> גודל של חתיכת כבד (ז) </td><td> ריכוז Collagenase(%) </td><td> פעילות Collagenase (U / ml) </td></tr><tr><td> &lt;25 </td><td> 0.10 </td><td> 250 </td></tr><tr><td> 25-40 </td><td> 0.11 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 41-80 </td><td> 0.13 </td><td> 350 </td></tr><tr><td> &gt; 80 </td><td> 0.15 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ריכוזי Collagenase (%) ופעילויות (U / ml) שישמשו לגדלים שונים של חתיכות כבד (ז).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure at JoVE.com

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה.

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion

Google

Research

JoVE Journal

Biology

30.8K Views.  Grosshadern Hospital, Munich.  הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקו?...

Video: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

בחינה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

כימות חלבון משופר באמצעות בידוד מיטוכונדריאלי דו-שלבי

Two-Step Tag-Free Isolation of Mitochondria for Improved Protein Discovery and Quantification

Most physiological and disease processes, from central metabolism to immune response to neurodegeneration, involve mitochondria. The mitochondrial proteome is composed of more than 1,000 proteins, and the abundance of each can vary dynamically in response to external stimuli or during disease progression. Here, we describe a protocol for isolating high-quality mitochondria from primary cells and tissues. The two-step procedure comprises (1) mechanical homogenization and differential centrifugation to isolate crude mitochondria, and (2) tag-free immune capture of mitochondria to isolate pure organelles and eliminate contaminants. Mitochondrial proteins from each purification stage are analyzed by quantitative mass spectrometry, and enrichment yields are calculated, allowing the discovery of novel mitochondrial proteins by subtractive proteomics. Our protocol provides a sensitive and comprehensive approach to studying mitochondrial content in cell lines, primary cells, and tissues.

Author Spotlight: בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים  

We present a two-step protocol for high-quality mitochondria isolation that is compatible with protein discovery and quantification at a proteome scale. Our protocol does not require genetic engineering and is thus suitable for studying mitochondria from any primary cells and tissues.