עבודה זו מומנה על ידי NIH R01 DK05823 (כדי RGW), F32 DK083213 (כדי JWW), F30 DK081265 (כדי ALO), ועל ידי מענק מטעם פרד סוזן Biesecker מרכז ילדים כבד (כדי RGW).

ההליך כולו מתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. 1. הכנת פתרונות אנזימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין פתרונות האנזים על פי טבלה 1 מסנן סטרילי באמצעות כמה 0.22 מיקרומטר הסינון. שמור על פתרון 1 פתרון 2 בטמפרטורת החדר פתרון 3 על 4 ° C עד השימוש. כל פתרונות וציוד לבוא במגע עם תאים מבודדים חייב להיות סטרילי. </li></ol> 2. הכנת ציוד זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מערכת טפטוף עם HBSS מינוס Ca 2 + / Mg 2 +, אשר כבר חימם עד 37 ° C. הערה: כדי להבטיח perfusate היא 37 מעלות צלזיוס כאשר הוא מגיע לכבד, HBSS מחומם באמבט מים מוגדר 37 ° C. לאחר שהוא עובר דרך המשאבה זלוף, זה עובר דרך הקבל כוס במקטורן המחובר למערכת circulator מים עד 40 ° C (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כירורגית כדי לעקרOLS בכוס עם אתנול 70%. </li></ol> 3. טפטוף של הכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה זכר בוגר Sprague-Dawley בזריקה intraperitoneal הנמבוטאל (50-100 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף לפי הצורך להשיג הרדמה מספקת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חיה במצב שכיבה על מגש פלסטיק לתקן את הגפיים למגש עם הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את הבטן עם EtOH 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בעור על הבטן על קו האמצע. לנתח את העור הרחק fascia על ידי ביצוע חתך גדול בצורת על הבטן. חותכים את שרירי הבטן במספריים בעקבות אותה צורה לחשוף את חלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חושפים את הווריד הפורטל באמצעות 2 מטליות כותנה להזיז בעדינות את הקרביים בטן לצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור שני תפרים סטריליים 2.0 משי מתחת הווריד הפורטל ולקשור באופן רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate וריד הפורטל עם קטטר 16-18 מד הרביעי ולהבטיח את הקטטר במקום על ידי הידוק רופף TIאד התפרים מהשלב הקודם (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק הפרין בדילול מלא באמצעות קטטר IV (1 מ&quot;ל של הפארין יחידות USP 5000 / מ&quot;ל מדולל של 4 מ&quot;ל HBSS מינוס Ca 2 + / Mg 2 +). הכבד צריך מחוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור קטטר IV למערכת זלוף. Perfuse עם HBSS מינוס Ca 2 + / 2 + Mg בשיעור של 20 מ&quot;ל / דקה במשך 10 דקות. Transect IVC נחות אל הכבד כדי לאפשר ניקוז של דם perfusate. לשאוב דם נקווה מחלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את נוזל זלוף לפתרון collagenase 0.3% (150 מ&quot;ג של collagenase מסוג 2 ב 500 מ&quot;ל HBSS בתוספת Ca 2 + / 2 + Mg) ו perfuse במשך 25 דקות. לשמור על לחות בכבד על ידי כיסוי אותו עם דש גזור הבטן קודם לכן. לשים כיסוי על צלחת פטרי דש בטן עמדה מנורת החום על פני שטח כדי לשמור על הטמפרטורה התוך בטני על כ 37 ° C. </li></ol> 4. הכנת הדואר המרה עץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכבד על ידי הרמתה מתוך חלל הבטן עם מלקחיים ומניחים אותו בתוך צלחת תרבות סטרילית רקמות מלא L-15 קר של ליבוביץ בתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בשכונה תרבות רקמות, לקלף את הקפסולה הכבד בעדינות להקניט parenchyma הכבד בנפרד עם מלקחיים. להעביר את הכבד באמצעות כלים שונים מלאים עם L-15 של Liebovitz התקשורת תוך כדי להקניט משם parenchyma, עד שלבסוף נשאר עם עץ מבודד המרה. Parenchyma הכבד הוא בצבע חום, בעוד עץ המרה שנותר לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עץ מבודד המרה לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל 10 מ&quot;ל מלא של סטרפטומיצין / פניצילין (10,000 IU / mL פניצילין 10,000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין); להשאיר על קרח במשך 15 דקות. </li></ol> 5. הבידוד של שבר פיברובלסטים Portal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העץ המרה לתוך צינור סטרילי 50 מ&quot;ל ו בז לקצץ במספריים סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כמות קטנה של אנזים סולution # 1 לתוך הצינור (כ - 5 מ&quot;ל) ולהמשיך לרכך את העץ המרה עד שהוא מגיע עקביות slurry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לתוך בקבוק זכוכית סטרילית. לשטוף את צינור בז עם פתרון הנותרים # 1, ואז לשפוך אותו לתוך בקבוק זכוכית. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רועד בסל&quot;ד 100 במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן slurry דרך הגביע מכוסה בשכבה אחת של רשת ניילון (30 מיקרון גודל הנקבוביות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל הרקמה הנותרת על גבי רשת אל בקבוק זכוכית על ידי שטיפה סטרילית רשת עם פתרון האנזים # 2. להתחיל לשפוך 1/2 (25 מ&quot;ל) של הפתרון לתוך צלחת פטרי 15 ס&quot;מ סטרילי. מוציאים בזהירות את הרשת מן הגביע על ידי מחזיק את הקצוות של הרשת מבלי לזהם את אזור המרכז, ולאחר מכן היפוך רשת ו טובל אותו פתרון בצלחת פטרי כדי להסיר כל שנותר רקמות על רשת. מחק את הרשת. מעבירים את הפתרון בצלחת פטרי לתוך בקבוק זכוכית סטרילית. יש לשטוף צלחת פטרי עם הרמ&quot;אining 25 מ&quot;ל פתרון # 2 ולהעביר אותו בקבוק זכוכית זהה. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רועד בסל&quot;ד 100 במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, קחו את תסנין בכוס ויוצקים לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל. סרכזת ב 1600 סל&quot;ד (460 x ג&#39;) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate מדיה resuspend גלולה ב 25 מ&quot;ל של פתרון # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הפתרון משלב 5.5 ולסנן אותו לתוך מבחנה סטרילית 2 מכוסה רשת 30 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הרשת. בצנטריפוגה תסנין בסל&quot;ד 1600 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. Aspirate ו resuspend גלולה עם 25 מ&quot;ל של פתרון # 3 כפי שנעשה בשלב 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב בין 2 שברים של צעדים 5.7 ו -5.9 ו סרכזת שוב בסל&quot;ד 1600 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate מדיה resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל של מדיה פורטל תרבות פיברובלסטים (DMEM/F12 השלימו עם 10% fungizone FBS 1% פניצילין / סטרפטומיצין, gentamycin 0.3% ו 0.2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עבור יכולת הקיום ואת הצלחת במאכלים בתרבית רקמה. בהתאם ליישום המבוקש, 0.5 עד 5 x 10 6 תאים לכל צלחת של 10 ס&quot;מ בתרבית רקמה מתאימים. מאת עכברוש Sprague-Dawley מבוגר, אנחנו בדרך כלל להשיג 2 עד 10 מיליון תאים קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיה תרבות למחרת כדי להסיר אי - חסיד פסולת. לאחר מכן, להחליף את המדיה כל תרבות 2 ימים. </li></ol> 6. נציג תוצאות Fibroblasts פורטל ראשיים מבודד הכבד חולדה בוגרת מוצגים 1, 3 ו - 7 ימים לאחר הבידוד (איור 3). שימו לב כי תאים מוארכים, עם טיפוסי המורפולוגיה של fibroblasts. תאים יכולים להיות מוכתם נוגדנים נגד ואלסטין (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) כדי לאשר את טוהר. Fibroblasts פורטל עוברים התמיינות myofibroblastic בתרבות. זו ניתן להדגים על ידי immunostaining של אקטין α-שריר חלק (α-SMA, A2547, Sigma, סנט לואיס, מיזורי). <tableהגבול = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Collagenase 0.3% הפתרון </td><td> 2 סוג collagenase </td><td> 150 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> HBSS עם Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td rowspan="7"> פתרון # 1 (Pronase) </td><td> שור סרום אלבומין </td><td> 50 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> Collagenase סוג 2 </td><td> 25 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> 18 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 3 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פן / סטרפטוקוקוס </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון # 2 </td><td> שור סרום אלבומין </td><td> 50 מ&quot;ג </td></tr><tr><td rowspan="6"> (Hyaluronidase) </td><td> Collagenase סוג 2 </td><td> 25 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> 22 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 3 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פן / סטרפטוקוקוס </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td rowspan="2"> פתרון # 3 </td><td> DNase </td><td> 3 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> RPMI בינוני 1640 </td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1. פתרונות האנזים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig1.jpg" /> באיור 1. זלוף להגדיר. א מים circulator עבור עמודה ההתחממות. טור ב &#39;המכיל התקשורת זלוף. ג שסתום בקרה יצוא המשאבה. משאבת ד יבוא. א משתנה במהירות peristaltic המשאבה. פ תרמוס עם אבקת כביסה ביו נקי. ג מנורת חום. מים ה &#39;אמבטיה מדיה זלוף ההתחממות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig2.jpg" /> FiguRe 2. ב זלוף באתרו. א קטטר IV המוחדרת לווריד פורטל מאובטח באמצעות תפר ומחובר צינורות טפטוף דרך שסתום. ב זכוכית פיפטה מחובר תרמוס ו יניקה הקיר כדי להסיר את נוזל זלוף מתנקז transected IVC. ט המעיים. כבד ל. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig3.jpg" /> איור 3. לעומת זאת שלב ו immunofluorescence כתם של הפורטל fibroblasts עכברוש התרבות. Fibroblasts פורטל בתרבית של 1, 3 ו 7 ימים לאחר הבידוד קובעו ונצבעו על ואלסטין, α-SMA ו DAPI.

<ol>
	<li>Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+-+like+cells+and+liver+fibrogenesis:+Emerging+concepts+in+a+rapidly+moving+scenario.">Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario.</a> Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).</li><li>Dranoff, J. A., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+fibroblasts:+Underappreciated+mediators+of+biliary+fibrosis.">Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis.</a> Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).</li><li>Tuchweber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+phenotypic+modulation+of+portal+fibroblasts+in+the+early+stages+of+cholestatic+fibrosis+in+the+rat.">Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat.</a> Lab Invest. 74, 265-278 (1996).</li><li>Beaussier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominent+contribution+of+portal+mesenchymal+cells+to+liver+fibrosis+in+ischemic+and+obstructive+cholestatic+injuries.">Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries.</a> Lab Invest. 87, 292-303 (2007).</li><li>Kinnman, N., Housset, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peribiliary+myofibroblasts+in+biliary+type+liver+fibrosis.">Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis.</a> Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).</li><li>Kinnman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myofibroblastic+conversion+of+peribiliary+fibrogenic+cells+distinct+from+hepatic+stellate+cells+is+stimulated+by+platelet-derived+growth+factor+during+liver+fibrogenesis.">The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis.</a> Lab Invest. 83, 163-173 (2003).</li><li>Uchio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+retinol-binding+protein-1+expression+and+modulation+during+in+vivo+and+in+vitro+myofibroblastic+differentiation+of+rat+hepatic+stellate+cells+and+portal+fibroblasts.">Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts.</a> Lab Invest. 82, 619-628 (2002).</li><li>Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+rat+liver+fibroblasts.">Isolation of primary rat liver fibroblasts.</a> J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+and+substrate+stiffness+regulate+portal+fibroblast+activation+in+culture.">Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture.</a> Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).</li><li>Bosselut, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+proteomic+features+of+two+fibrogenic+liver+cell+populations:+hepatic+stellate+cells+and+portal+myofibroblasts.">Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts.</a> Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).</li><li>Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecto-nucleoside+triphosphate+diphosphohydrolase+NTPDase2/CD39L1+is+expressed+in+a+novel+functional+compartment+within+the+liver.">The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver.</a> Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Fibroblasts פורטל לשחק תפקיד חשוב סיסטיק המרה. כאן אנו מתארים שינוי של הפרוטוקול המקורי שפורסם על ידי קרוגלוב ו Dranoff 8 לבידוד fibroblasts פורטל מהכבד חולדה, המספקת דרך פשוטה לבחון את אוכלוסיית תאים במבחנה. גישה זו משתמשת העיכול פרוטאז וגודל מבוסס הסינון. היתרון העיקרי של שיטה זו היא אוכלוסיה טהורה יחסית של תאים ניתן להשיג ללא מעבר בתרבות, המאפשר מחקר של ביטוי גנים או התנהגות התא תפקודית מספר ימים לאחר הבידוד. טכניקה זו מציעה גם אפשרות של בידוד תאים כבדי שניהם בריאים וחולים. אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הוא עיכול אנזימטי של parenchyma הכבד. כדי להבטיח עיכול מוצלח, חשוב לוודא דם סחוט לגמרי את הכבד במהלך perfu הראשוניתשיאון על ידי וודא כי יש אפילו לחלוט הכבד. כדי להקל, ניתן להשתמש מטלית כותנה כדי לעסות בעדינות את הכבד תוך המרוססת. יתר על מערכת העיכול של parenchyma תוצאות הכבד בתשואה נמוכה של תאים קיימא, בעוד תת העיכול יקשה להפריד parenchyma הכבד מעץ המרה. מאז ההכנות של pronase יש משונות הפעילות האנזימטית בין מגרשים שונים, אופטימיזציה של כמות משתמשים עשוי להיות נחוץ כאשר יש תשואה נמוכה של תאים קיימא. פרוטוקול זה עשוי להיות שונה עבור בידוד fibroblasts פורטל מהכבד עכבר או חולדה צעירה הכבד באמצעות קטטר קטן IV מד כדי cannulate וריד השער, להקטין את היקף פתרונות זלוף ביחס למשקל בעל החיים, ולהפחית את שיעור זלוף הכבד כ 10 mL / min. Fibroblasts פורטל בתרבות עוברים התמיינות myofibroblastic ב 10-14 ימים, כפי שמעידים לשעבר α-SMAדיכאון 9. סמנים שונים שימשו להבחין fibroblasts לפורטל stellate תאים בכבד, כולל fibulin-2, IL-6, אלסטין, nucleoside טריפוספט diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 ו חלבונים עצביים כגון synaptophysin 2, 6, 10, 11 . מצאנו כי ואלסטין הוא סמן טוב fibroblasts הפורטל, גם לאחר התמיינות myofibroblastic, בעוד NTPDase2 אבד לאחר fibroblasts פורטל עברו תרבות אחרי כמה ימים 9. לכן, אנו בדרך כלל לאשר את הבידוד של fibroblasts פורטל ידי מכתים immunofluorescence עבור ואלסטין. המגבלה של טכניקה זו היא, מיד לאחר בידוד פיברובלסטים הפורטל, יש חלק קטן של זיהום תאים, כולל תאים Kupffer ותאי המרה. Fibroblasts פורטל יתגבר על תאים אלה מזהמים תוך 2-3 ימים, לעומת זאת, מניב האוכלוסייה טהור יחסית (&gt; 98%) 9. סיNCE fibroblasts פורטל בתרבות עוברים התמיינות myofibroblastic על הפלסטיק תרביות רקמה, אנחנו בדרך כלל ללמוד תאים אלה תוך 7 ימים של בידוד. התאים נשמרים בפורטל תרבות התקשורת פיברובלסטים המכילים 10% בסרום שור עוברית, כמתואר בסעיף שיטות. עם זאת, תאים אלה ישרדו בתקשורת צמיחה המכילים 2% בסרום שור עוברית במשך כמה ימים. אנחנו בדרך כלל לא משתמשים במדיה בסרום נמוכות עד לפחות 24 שעות לאחר בידוד. לאחר fibroblasts פורטל עוברים התמיינות myofibroblastic, ניתן passaged מספר פעמים והמשיך כמו מניות הקפואים של myofibroblasts.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> 2 סוג collagenase </td><td> וורטינגטון ביוכימיים (לייקווד, ניו ג&#39;רזי) </td><td> LS004177 </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> רוש (אינדיאנפוליס, אינדיאנה) </td><td> 70290120 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> סיגמא (סנט לואיס, מיזורי) </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease </td><td> סיגמא </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen (Carlsbad, CA) </td><td> 11320 </td></tr><tr><td> HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> Mediatech (Manassas, VA) </td><td> 21-021-CM </td></tr><tr><td> HBSS עם Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> Mediatech </td><td> 21-020-CM </td></tr><tr><td> של ליבוביץ L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td></tr><tr><td> RPMI בינוני 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> שור אלבומין בסרום </td><td> סיגמא </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> תאומים ביו (מערב סקרמנטו, קליפורניה) </td><td> 900-108 </td></tr><tr><td> Nitex ניילון קווי 30 מיקרומטר </td><td> Genesee מדעי (סן דייגו, קליפורניה) </td><td> 57-105 </td></tr></tbody></table>

isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion

לייפת הכבד מוגדר על ידי בתצהיר יתר של תאי מטריקס ידי myofibroblasts מופעל. ישנם סימנים מקדימים מרובים של myofibroblasts בכבד, כולל stellate תאים בכבד, fibroblasts הפורטל מח עצם fibroblasts הנגזרות 1. Stellate תאים בכבד כבר למד הכי טוב, אבל fibroblasts פורטל מוכרים יותר ויותר תורמים חשובים בריכה myofibroblast, בעיקר סיסטיק המרה 2. Fibroblasts פורטל ריבוי עוברים בעקבות פציעה אפיתל המרה, שעלול לשחק תפקיד מפתח בשלבים הראשונים של המרה צלקות 3-5. שיטת בידוד fibroblasts הפורטל יאפשר במחקר במבחנה של אוכלוסייה זו התא להוביל להבנה טובה יותר של תפקיד fibroblasts פורטל משחקים סיסטיק המרה. Fibroblasts פורטל היו מבודדים תוך שימוש בטכניקות שונות, כולל 6 תוצאה, 7 ו Liזלוף ver עם עיכול אנזימטי ואחריו מבחר בגודל 8. היתרון של מערכת העיכול ובחירת הטכניקה גודל לעומת הטכניקה תוצאה היא לתאים ניתן ללמוד ללא צורך במעבר בתרבות. כאן אנו מתארים גירסה שונה של הטכניקה המקורית שתואר על ידי קרוגלוב ו Dranoff 8 עבור בידוד של fibroblasts פורטל מהכבד עכברוש המביא אוכלוסייה טהורה יחסית של תאים ראשוניים.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion at JoVE.com

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

הטכניקה לבידוד fibroblasts פורטל מהכבד עכברוש מתואר. הם כבדי perfused ו מתעכל<em&gt; באתרו</em&gt; עם collagenase, ואחריו<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; העיכול של slurry הכבד בחירת גודל של תאים. שיטה זו מספקת האוכלוסייה הטהורה של fibroblasts פורטל ללא צורך במעבר בתרבות.

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

isolation-of-rat-portal-fibroblasts-by-in-situ-liver-perfusion

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

19.1K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia. הטכניקה לבידוד fibroblasts פורטל מהכבד עכברוש מתואר. הם כבדי perfused ו מתעכל באתרו עם collagenase, ואחריו לשעבר vivo העיכול של slurry הכבד בחירת גודל של תאים. שיטה זו מספקת האוכלוסייה הטהורה של fibroblasts פורטל ללא צורך במעבר בתרבות.

Video: Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

ב אנדוציטוזה כבד vivo ואחריו טיהור בתאי הכבד על ידי זלוף כבד

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

נהלים לעכברוש<em&gt; באתר</em&gt; מאפייני התכווצות שרירי שלד

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...