אנו מודים אן מארי דיון-Cote לדיונים שהובילו לפיתוחה של השיטה. JK וRB הם חוקרים דוקטורט FQNRT, מ-MG הוא חוקר Vanier CIHR, וג&#39;-YM הוא חוקר בכיר FRSQ. עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר לJY. מ &#39;

1. ייצור רקומביננטי baculovirus Baculoviruses מופקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus Bac-to-Bac של Invitrogen בעיקר על פי הפרוטוקול של היצרן עם שינויים קלים בלבד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וקטור pFastBac1 שונה (Gibco, חיים) נוצר המכיל GST ו תגים (איור 2). אתר MultiCloning (MCS) של וקטור PET-52b (+) (Novagen), המכיל 10xHis תג, היה מוכנס לתוך MCS של וקטור pFastBac1 ליצור pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis. רצף MCS PET-52b (+) היה PCR המוגבר בין אתרי הגבלת XbaI וBlpI, הוספת אתר BglII הגבלה ב5 &#39;בגפיים ובאתר הגבלת HindIII ב3&#39; בגפיים. מוצר ה-PCR שוכפל לאחר מכן בין BamHI ואתר הגבלת HindIII של pFastBac1, באמצעות ההתאמה של רצפי הגבלת BamHI וBglII. מאחר שהמטרה הייתה ליצור pFastBac1 המאפשר הביטוי שלחלבון רקומביננטי עם streptavidin ו10xHis תגים, אתר הגבלת BamHI של PET-52b (+) רצף MCS לא היה בשימוש. כמו כן, אתר הגבלת XbaI לא היה בשימוש, כדי למנוע את היתירות של אתרי הגבלה המתרחשים בין האתרים שכבר בMCS של pFastBac1 ואלה הוכנסו עם MCS של PET-52b (+). רצף קידוד GST עם אתר PreScission פרוטאז ההכרה (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) היה אז מוכנס לתוך pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis. רצף GST cDNA מpGEX-6P-2 (GE Healthcare) היה מוגבר PCR עם פריימרים המכילים אתרי הגבלת NcoI וKpnI ב5 &#39;ו 3&#39; גפיים, בהתאמה. אתר NcoI מאפשר תוספת של קודון התחלה אלא גם אלאנין לGST. מוצר ה-PCR היה אז משובט לתוך pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis בין אתרי הגבלת NcoI וKpnI, וכתוצאה מהמחיקה של Streptavidin התג. וקטור ההיתוך החדש ובכך הושג נקרא pFastBac1-GST-10xHis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone קידוד cDNA ליחסי הציבורotein עניין לתוך וקטור pFastBac-GST-10xHis בין GST (N-מסוף) והתג שלו (בטרמינל C-). להיות זהיר כדי להסיר את קודון עצירת cDNA כדי לאפשר האיחוי עם התג שלו בטרמינל C-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את ה coli DH10Bac עם pFastBac רקומביננטי (המתקבל בשלב 1.2) על מנת ליצור את bacmid. לאפשר מושבות לגדול בין לילה על 37 מעלות צלזיוס וכמה שעות ב30 ° C על צלחות סלקציה המכילות Bluo-gal וIPTG (10 מיקרוגרם / מיליליטר tetracyclin, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 7 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 100 מיקרוגרם / מיליליטר Bluo- גל, 40 מיקרוגרם / מיליליטר IPTG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק וrestreak 2 מושבות הלבנות (משלב 1.3) על צלחות בחירה כדי לאשר את הפנוטיפ הלבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 2 מיליליטר של LB המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר tetracyclin, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin עם שתי מושבות הלבנות משלב 1.4 ולתת להם לגדול בין לילה תחת תסיסה (250 סל&quot;ד) ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטהר את ה-DNA bacmid, גלולה החיידקים מצעד 1.5,resuspend התאים 300 μl של פתרון שאני ולהוסיף 300 μl של הפתרון השני (ערכת Maxiprep מQiagen). דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, להוסיף 300 μl של 3 M KOAc pH 5.5 ודגירה של 10 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות ב 4 ° C, מהירות מקסימלית עבור 10 דקות. הוספת 800 μl של isopropanol לsupernatants ודגירה של 10 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות ל15 דקות ב 4 ° C ולשטוף את הכדור עם 500 μl של 70% אתנול. תן את הכדור יבש וresuspend אותו בתנאים סטריליים ב40 μl של טריס-EDTA pH 8.0. ה-DNA bacmid יש לאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור baculoviruses כפי שתואר בפרוטוקול של היצרן. ניתן לאחסן Baculoviruses ב 4 ° C המוגנים מפני אור. </li></ol> 2. ביטוי חלבון רקומביננטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לבחור את baculovirus יעיל ביותר לטיהור וכדי לפקח על מה שפעם הוא הגיע לשיא של ביטוי חלבון, לבצע assay מיני זיהוםים כדלקמן: להדביק 2 x 10 7 של Sf9 נגועים תאים בתרבית ב27 מעלות צלזיוס בתקשורת של גרייס (השלימה עם 10% FBS ו -1% P / S) עם 133 μl (1/150) של baculovirus. לאסוף aliquots של 1.5 מיליליטר ב 0, 24, 48, ו72 שעות לאחר פגיעה. גלולה התאים ולנתח את רמת הביטוי של החלבון של עניין על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדנים נגד תג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש baculovirus יעיל ביותר משלב 2.1 להדביק טווה מכילה 1.0 x 10 6 תאי Sf9 לכל מיליליטר ב500 מיליליטר של תקשורת עם יחס של 1/150 בין הווירוס ואמצעי תקשורת. בואו התאים הנגועים לגדול בתרחיף ב27 מעלות צלזיוס ולאסוף את התאים כאשר ביטוי החלבון המרבי (כפי שנקבע בשלב 2.1 לעיל) הוא הגיע. ניתן לאחסן את תאי pelleted ב-80 ° C עד שימוש נוסף. </li></ol> 3. הכנת lysate תא מסיס את כל שלבי הדגירה הבאות מתבצעים על 4 מעלות צלזיוס בסיבוב קל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse Sתאי F9 לבטא חלבון עניין שלך ב~ 20 מיליליטר של חיץ מחייב GST (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Triton-X-100, מעכבי פרוטאז 1 מ&quot;מ DTT בPBS1X לריכוז סופי של NaCl של 250 מ&quot;מ, ו קוקטייל (Roche). באמבט מי קרח, dounce הפתרון 20x עם homogenizer dounce, sonicate 3x 30 שניות כל אחד (פלט 70%), וDounce שוב 20x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי). דגירה הכולל lysate התא עם 1 מ&quot;מ MgCl 2 וBenzonase 7 nuclease (2.5 U / ml) ל30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר DNA או RNA זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 18,000 סל&quot;ד במשך 30 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי). צנטריפוגה supernatant שוב ל30 דקות ב 18,000 סל&quot;ד ב 4 ° C כדי לקבל lysate מסיס ברור. להעביר את supernatant דרך פילטר 0.2 או 0.45 מיקרומטר כדי למנוע סתימה. </li></ol> 4. כריכה של חלבון על חרוזים GST <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה lysate התא מסיס עם 1 מיליליטר של חרוזים GST (prewashed שתי פעמים עם10 מיליליטר של GST מחייב חיץ) במשך שעה 1 ב 4 ° C בסיבוב עדין. </li></ol> הערה: זמן הדגירה צריך להיות מותאם בהתאם ליציבות של החלבון והיעילות מחייבת. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב מהיר ב700 סל&quot;ד ולהסיר supernatant המכיל חלבונים מאוגדים (זה יכול להיות כל הזמן לניתוח נוסף). שטוף את החלבונים הנכנס GST (איור 3B, מסלול 1) עם חיץ הכביסה GST (GST חיץ מחייב עם 350 סופי מ&quot;מ NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.2 2x. בשטיפה האחרונה, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את החרוזים עם 5 מ&quot;מ ה-ATP ו15 מ&quot;מ MgCl 2 (ב 10 מיליליטר חיץ מחייב GST) במשך שעה 1 ב 4 ° C כדי למנוע ספציפי מחייב של חלבוני חום הלם 8. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ הכביסה GST. </li></ol> 5. PreScission מחשוף של GST <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוזים GST, להסיר את supernatant ולשטוף את חרוזי GST עם buf P5fer (50 4 pH מ&quot;מ NaHPO 7.0, 500 mM NaCl, גליצרול 10%, 0.05% Triton-X-100, 5 imidazole מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה GST-החרוזים עם אנזים PreScission במאגר P5 מ3 שעות ללילה בשעה 4 ° C. (מחלקים את חרוזים GST בשברים של 100 μl ולהוסיף 4-8 יחידות (2-4 μl) של אנזים המדולל בשל חיץ P5 100 μl). </li></ol> הערה: זמן הדגירה של צעד PreScission צריך להיות מותאם לפי המשקל המולקולרי, כמו גם את היציבות של החלבון. אם השפלה הוא ציין, זמן דגירה זה יכול להיות ירידה למינימום של 2 שעות במקום למשך הלילה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מהיר ולאסוף את supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים לאחר הוספה של P5 100 μl חיץ לחרוזים וברכה כל השברים (איור 3B, מסלול 2). </li></ol> הערה: חרוזים הנותרים יכולים לשמש לניתוח יעילות מחשוף (איור 3B </strong&gt;, מסלול 3). בדרך כלל, 70-80% מהחלבון הוא ביקע. 6. לTALON מתכת זיקה שרף מחייב חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את elution מלמעלה ל3 שברים של 1 מיליליטר ודגירה כל אחד עם 100 חרוזים μl שרף זיקת מתכת טאלון יבשים (prewashed שתי פעמים עם חיץ P5) במשך שעה 1 בסיבוב. </li></ol> הערה: חלוקת elution בכמה שברים מגבירה את יעילות מחייב / שוטף. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את דקות שרף 5 עם חיץ P30 (חיץ P5 עם ריכוז סופי של 30 imidazole מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6.2 2x וברכת חרוזים בצינור יחיד. לפני השטיפה האחרונה, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר. </li></ol> תגובה: זה מתאים למדגם TALON המאוגד (איור 3B, מסלול 4). 7. Elution של החלבון המטוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שרף TALON חלבון קשורה למשך 5 דקות ברוטציה עם P500 חיץ (חיץ P5 עם ריכוז סופי של 500 imidazole מ&quot;מ). השתמש יחס בין החיץ וחרוזים של 1:1 v / נ (לדוגמא, אם אתה לקח 200 μl של חרוזים יבשים, תצטרך להוסיף 200 μl של P500). חזור על פעולה זו פעמיים ולשמור על כל שבריר eluted בנפרד (בשם elution 1 (E1), elution 2 (E2) וelution 3 (E3); איור 3B, נתיבי 5-7). </li></ol> הערה: חרוזים הנותרים יכולים לשמש לניתוח יעילות elution (איור 3B, ליין 8). בדרך כלל, 60-80% מהחלבון eluted בסך הכל. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הכמות ואיכות של החלבון מטוהר על ידי טעינה כ 20-40 μl של כל חלק עם ריכוז BSA סטנדרטי על SDS-PAGE וכתם עם Coomassie כחול (איור 3 ב) או כתם חלבון SYPRO לשם ויזואליזציה. </li></ol> תגובה: החלבון של עניין יכול גם להתגלות throughout הליך הטיהור באמצעות אנטי GST ונוגדנים נגדו (איור 3 ג). 8. אחסון של החלבון המטוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze החלבון מטוהר נגד חיץ אחסון מתאים (למשל 20 מ&quot;מ טריס אצטט pH 8.0, 200 מ&quot;מ כץ, 10% גליצרול, 1 mM EDTA, 0.5 מ&quot;מ DTT) ב 4 ° C. חשוב לבדוק למשקעים של החלבונים המטוהרים במהלך הדיאליזה. בדרך כלל אנחנו dialyze 2x עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס תחת סיבוב תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך aliquots הקטנים של החלבונים המטוהרים (10-20 μl) ולהקפיא בקרח יבש ל30 דקות. אחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס ולמנוע הפשרה / הקפאת מחזורים רבים. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

GST-פרוטוקול הטיהור שהוצג כאן מתאים לטיהור של מגוון רחב של גדלים של חלבונים רקומביננטיים: אנחנו מטוהרים בהצלחה לי RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), וחלבון לא יציב משקל מולקולרי גבוה של infantum שושנת יריחו: Li-BRCA2 (125kDa) 6,9. יתר על כן, החלבונים מטוהרים עם פרוטוקול זה היו ביוכימית פעיל 6. ההצלחה של שיטה זו אך ורק תלויה בביטוי, המסיסות והיציבות של החלבון הרצוי. וקטורי ביולוגיה מולקולריים לביטוי בצבאות אחרים, כגון E. coli או שמרים, ניתן לשנות בקלות באמצעות GST זמין באופן נרחב ותגיו. זה מדגיש את תחולתה ואת העלות האפקטיביות של הטכניקה הנוכחית עבור רוב מעבדות ביולוגיה מולקולריות. מגוון רחב של יתרונות השפיע על ההחלטה שלנו לבחור תאים נגועים על תאי חיידקים או יונקים לrecombinanביטוי חלבון t וטיהור. לדוגמא, שינויי posttranslational כגון מתילציה, זירחון וubiquitinylation יכולים מאוד להשפיע על התפקוד האנזימטית של חלבון 10. לפיכך, כדי ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של חלבון, זה נוח להשתמש במערכת המאפשרת לשינוי posttranslational, כגון תאי Sf9 נגועים. יתרון נוסף של שימוש Sf9 על תאי יונקים, למשל, הוא בעלת אופי כלכלי, שכן מערכת התא נגועה דורשת הרבה פחות תאים ושום שיטת transfection יקרה בהשוואה למערכת של היונקים. הפשטות של השיטה שהוצגה תסייע לחוקרים לקבל חלבון או חלבון מורכב בצורה מטוהרת מאוד עם ציוד מעבדה סטנדרטי, שבו יש יתרון למעבדה עם ציוד מינימאלי.

הטיהור של חלבונים רקומביננטי היא חיונית כדי לענות על שאלות בסיסיות בביוכימיה. דרכים מקובלות של טיהור חלבונים כמו כרומטוגרפיה חילוף יונים והרחקת גודל כרומטוגרפיה להסתמך על תכונות פיסיקליות של חלבון המטרה, כגון נקודה איזואלקטרית ותשלום או גודל, בהתאמה. מאפייני החלבון האחרונים משותפים למגוון של חלבונים, אשר מגדיל באופן משמעותי את הסיכוי לזיהום חלבונים באסטרטגיות טיהור חלבונים קונבנציונליות. בעיה זו עלולה לעקוף עם השימוש בעמודות טיהור מרובות, אשר זה זמן רב. במקביל, שיטות כרומטוגרפיה האחרונות דורשות התקנה ניסיונית יקרה. טיהור זיקת תג מגביר משמעותית יעד ספציפי, כמו ברוב המקרים התג יהיה ייחודי לחלבון של עניין. במחקרים שנערך לאחרונה, טיהור דגל או HA-זיקה כבר בשימוש נרחב. בניגוד לrec הקייםפרוטוקולי טיהור חלבוני ombinant הבמשמשים תגים בודדים, הקמנו את השילוב הייחודי של שני תגים. השיטה שלנו כרוכה ההיתוך של GST-תג בN-הסופית והתג שלו בC-הסופית של החלבון של עניין, ליחס אופטימלי בין הכמות וטוהר של החלבון הרצוי. GST הוא תג ארוך (29 KDA), שהוא יעיל ביותר לטיהור בחרוזי Sepharose גלוטתיון. יתר על כן, באמצעות GST מבטיח עלות אפקטיביות של שיטת 1 שלנו. האפשרות לבקע את GST עם אנזים PreScission (עם רצף הכרת LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, וכתוצאה מכך התוספת של רק שתי חומצות אמינו) יש יתרונות רבים, למשל, אסטרטגיה זו תמנע שינויים של פונקציות החלבון הפיזיולוגיות בשל הפרעה allosteric. התג שלו הקטן התמזגו הגפיים חלבון האחרים משמש בשלב טיהור שני כדי להגדיל את טוהר חלבון על ידי שטיפה את GST ביקע, כמו גם חלבונים ואחרים מושפלים<html> מזהמים. בנוסף, הפרוטוקול אינו מחייב צעד דיאליזה בעת מעבר מGST לעמודה שלו לטיהור צעד (שרף TALON). מזהמים נפוצים בתהליכי טיהור כאלה הם החלבונים Heat Shock (HSP). התוספת של שלב דגירה עם MgCl 2 ו-ATP מאפשרת הסרת המזהמים אלה (איור 1). חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) וביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) הן טכניקות נפוצות שתלויה במכשור יקר לייצר תשואה גבוהה של החלבון מטוהר של עניין. פרוטוקול הטיהור אצווה אנו מציגים כאן, לעומת זאת, הוא ידני ואינו דורש התקנת אינסטרומנטלי יקרה. ניתן להגיע לתשואה גבוהה של חלבון על ידי דרוג את הפרוטוקול. במקביל, עם פרוטוקול הטיהור אצווה, elution הנפח יכול להיות מותאם על מנת לשפר את ריכוז חלבון, שאינו נתון עם FPLC או HPLC. ntent &quot;&gt; כמו כן, עם GST-פרוטוקול הטיהור אצווה, חלבונים עם גודל טווח של ~ 10-300 kDa יכולים להיות מטוהרים. אחד היתרונות הגדולים ביותר הוא שניתן על ידי העובדה שאחד יכול לטהר כמה חלבונים באותו הזמן , למשל, שניהם wild-type ו המוטציה בחלבון שלה. ההצלחה של הפרוטוקול המובא אך ורק תלוי ברמת הביטוי והמסיסות של החלבון של עניין.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

מבחני מפתח בהאינזימולוגיה לאפיון ביוכימי של חלבונים במבחנה מחייבים ריכוז גבוה של החלבונים המטוהרים של עניין. פרוטוקולי טיהור חלבון צריכים לשלב יעילות, פשטות ויעילות עלות 1. כאן, אנו מתארים את שיטת GST-כמערכת חדשה בקנה מידה קטן טיהור זיקה לחלבונים רקומביננטיים, המבוססת על תג N-מסוף גלוטתיון Sepharose (GST) 2,3 ותג 10xHis טרמינל C-4, אשר שניהם התמזגו לחלבון של עניין. המבנה השני משמש להפקת baculoviruses, לזיהום של תאים נגועים Sf9 לביטוי חלבון 5. GST הוא תג ארוך למדי (29 KDA) המשמש כדי להבטיח את יעילות טיהור. עם זאת, זה יכול להשפיע על תכונות פיסיולוגיות של החלבון. לפיכך, הוא ביקע לאחר מכן את החלבון באמצעות אנזים PreScission 6. על מנת להבטיח את טוהר מרבי וכדי להסיר את GST ביקע, אנחנוהוסיף צעד טיהור הזיקה שני המבוסס על התג שלו קטן יחסית. חשוב מכך, הטכניקה שלנו מבוססת על שני תגים שונים איגוף שני קצוות של החלבון, אשר הוא כלי יעיל כדי להסיר חלבונים מושפלים, ולכן מעשיר את החלבונים באורך מלא. השיטה שהוצגה כאן אינה דורשת התקנת אינסטרומנטלי יקרה, כגון FPLC. בנוסף, אנו משולבים MgCl 2 ושוטף ATP כדי להסיר זיהומים חלבון הלם חום וטיפול nuclease לבטל לזהם חומצות גרעין. לסיכום, השילוב של שני תגים שונים איגוף N-וה-C-מסוף ואת היכולת לבקע את אחד מהתגים, ערבויות ההתאוששות של חלבון נקי במיוחד ואורך מלא של עניין.

כדי להמחיש את היעילות של GST-פרוטוקול הטיהור, אנחנו מטוהרים Rec14, ס חלבון pombe של 32.9 kDa. Rec14 cDNA שובט בוקטור pFastBac1 שונה שלנו ומאפשר תוספות של GST-ו תגים בN-ו-C-Termini, בהתאמה (איור 1 א). baculovirus רקומביננטי הוכן לאחר מכן ונהג להדביק תאים נגועים SF9 לביטוי חלבון. Lysates התא מסיס הודגרו עם חרוזים GST והנכנס חלבונים היו eluted על ידי ביקוע GST עם פרוטאז PreScission. -Rec14 החלבון וכתוצאה מכך היה הזיקה מטוהרת על שרף TALON וכרוך-חלבונים היו eluted עם חיץ TALON מכיל 500 imidazole מ&quot;מ. מטוהר Rec14-dialyzed במאגר אחסון ומאוחסן ב -80 ° C (איור 1). Lysates התא מסיס ומוחלט מתאי SF9 נגועים בbaculovirus Rec14 רקומביננטי, או מדומה נגוע כשליטה, נותח על ידי Coomמכתים Assie כחול, ומאפשר לנו לאשר את הביטוי של חלבון GST-Rec14-(איור 3 א). במהלך תהליך הטיהור, דוגמאות רבות נותחו על מנת לבצע את יעילות השיטה. ניתוח של דגימות אלה על ידי מכתים הכחול Coomassie (איור 3) מראה כי במהלך השלב הראשון של טיהור, GST-Rec14 היה קשור בצורה נכונה לחרוזי GST, עם משקל מולקולרי לכאורה של ~ 60 kDa בשל השילוב של Rec14 (32.9 KDA) עם GST (29 KDA) (מסלול 1). לאחר מחשוף PreScission של GST, Rec14-נודד ללא GST סביב 37 kDa (מסלול 2) ואילו GST ביקע ניתן דמיינו בחרוזי GST (מסלול 3, סביב 25 KDA). למרות חלק מRec14 ללא GST שעדיין נשאר קשורים לחרוזי GST (מסלול 3), העשרה בולטת בRec14-הושג (מסלול 2, ללא זיהום גלוי על כתמי כחולי Coomassie). צעד זה יכול להיות משופר על ידי הגדלת זמן הדגירה של החלבון עם PreScission. ניתוח של Rec14-כבול לTALONחרוזים (אחרי שלב 7.1, מסלול 4) בהשוואה לחלבוני eluted לאחר שלב טיהור GST (מסלול 2), מראה כי חלק גדול של Rec14-קשור לחרוזי TALON. לאחר מספר כביסות, היה eluted Rec14-ושנאסף. שלושה elutions כבר בוצע. הניתוח חשף טוהר גבוה של Rec14-(לא מזהם גלוי על ידי מכתים Coomassie, נתיבים 5 עד 7), והריכוז הגדול ביותר של Rec14-בelution הראשון. השוואה של שברים eluted (נתיבים 5 עד 7) לחרוזי TALON לאחר elution (מסלול 8) ממחישה את היעילות של elution, מאז-Rec14 יכול להתגלות רק מעטים כמחויבים בחרוזים. דגימות בשימוש באיור 3B היו נתונים לניתוח כתם מערבי עם אנטי GST ונוגדנים נגדו על מנת לעקוב Rec14 לאורך כל ההליך (איור 3 ג). הכתם אנטי GST מראה כי חלק GST-Rec14 וGST לבד, היו נוכחים בחלבוני eluted מהשלב טיהור GST (מסלול 2), ואת הבמזהמים הוסרו על ידי צעד טיהור זיקתו התג. כתם זה מאפשר לנו גם כדי לפקח שGST הוסר ביעילות מRec14 ידי טיפול PreScission וצעדו תג הטיהור (נתיבי 4 עד 8). הכתם נגדו שואף לזהות Rec14. אנחנו יכולים ובכך לאשר ש- Rec14 לא ביקע GST-Rec14-ולחלוטין והוסר מחרוזי GST (מסלול 11). בריכוז גבוה נראה יתר על כן,, Rec14 לצבור (מסלול 13). לסיכום, התוצאות שהוצגו להדגים את היעילות של טיהור GST-לטיהורו של ס &#39; pombe Rec14. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig1.jpg" /> איור 1. מתווה סכמטי של-GST שיטת טיהור זיקת שני השלבים. GST-Rec14-מבנה א משובט לתוך pFastBac (Baculovir<html> . וקטור ביטוי) טיהור זיקת שני שלבים ב &#39;של GST-Rec14-מlysate התא מסיס Sf9:., ואחריו מחשוף PreScission של GST מחייב GST, וelution עם imidazole מחייב TALON <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50320/50320fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג סכמטי של pFastBac1-GST-10xHis. GST (ירוק), אתר פרוטאז PreScission (תכלת), אתר multicloning (אדום), ותג 10-(כחול כהה) מוצגים. באותיות הקטנות הם רצפי נוקליאוטידים שמקורם בחיות המחמד 52b (+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50320/50320fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <html> together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig3.jpg" /> איור 3. תוצאת מופת של טיהור Rec14. GST-. מכתים Coomassie של שבריר חלבון כולל (מסלול 2 ו -3) וlysate מסיס תא (מסלול 4 &amp; 5) מתאי Sf9 טופלו מדומים (מסלול 2 ו -4) או נגוע בbaculovirus GST-Rec14-(מסלול 3 ו -5). Rec14-וGST בעלי משקל מולקולרי של כ 32.9 kDa ו29 kDa, בהתאמה, ויש לו את GST-Rec14-חלבון היתוך משקל מולקולרי של כ 61.9 kDa. ב Coomassie מכתים את הוכחת בכל שלב של שיטת טיהור חלבונים (ל נוהל ראה הסבר מפורט) ג כתם המערבי של השברים לאחר הליך הטיהור עם אנטי GST (מסלול 1 עד 8) ונוגדנים נגדו (מסלול 9-16).&quot;Target =&quot; _blank upload/50320/50320fig3large.jpg &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Google

Research

JoVE Journal

Biology

41.1K Views.  Hôtel-Dieu de Québec.  בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן. 

Video: GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.