המחברים רוצים להכיר חברים בעבר ובהווה של המעבדה קים, מארק Nilan לטיפול בדג זברה ותחזוקה, ד&quot;ר רוברט וילר לדיונים מועילים ושיתוף נתונים, ומענקי NIH 3RO1GM087308-02S1 ו1P20RR024475-01A2 וחקלאות מיין והיער להתנסות תחנה (מספר פרסום 3303) למימון.

1. טיפול ותחזוקה של דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי: דג הזברה מבוגר שרצים המוני כפי שתוארו קודם לכן 13. איסוף עובר הוליד כמתואר 14 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microinjection (אם רוצה): עוברי Microinject 1-4 שלב תא דג הזברה עם oligonucleotides morpholino למציאת מוצרי גן או mRNA לביטוי יתר מוצרי גן כפי שתוארו לעיל 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על בריכה נאותה של בקרות מדומה מוזרקת (לפחות 48 חיים, מדומה הזריק דגי שליטה ו48 חיים, יש צורך בדגי מניפולציות בניסוי למלא microplate 96 היטב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על עוברים: לגדול עוברים בצלחות פטרי עמוקים על 28 מעלות צלזיוס במי ביצה (אוקיינוס ​​ים המלח מיידי 60 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במזוקק-autoclaved מים) עד לשלב ההתפתחותי הרצוי (תגובת פרץ בדרכי הנשימה היא לא ניתן לגילוי שימוש בפרוטוקול זה בעוברי דג הזברה צעיר מ2 ימים לאחר הפריה 12). הערה: זה כבר observed כי מניעת פיגמנטציה בעוברי דג הזברה או דרך השימוש של 1-2-פניל thiourea (PTU) או דג הזברה המוטציה golden/slc24a5 אינו משנה את האינדוקציה של הקרינה על ידי PMA (נתונים שלא פורסמו, עוברים שנבדקו ב48, 72, ו96 באופן משמעותי hpf). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העוברים מתים מדי יום עם פיפטה העברה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג בזהירות מים ביצה ישנות ולחדש עם מים ביצה חדשים מדי יום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי Dechorionate: ביום של הניסוי, עובר dechorionate (אם עוברים עדיין בchorions) כפי שתוארו לעיל באמצעות שני מלקחיים בסדר 14 (assay פרץ נשימה זה יכול גם להתבצע על כליות גזורים מן דג הזברה מבוגר 12 ופרוטוקולים מפורטים לכליות נתיחה מדג הזברה מבוגר תוארו בעבר 16,17). </li></ol> 2. פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של H2DCFDA: לשקול את 1 מ&quot;ג של H2DCFDA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דימ&quot;ג ssolve 1 של H2DCFDA ב 1 מיליליטר של sulfoxide דימתיל (DMSO) כדי להפוך 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 22 aliquots μl של פתרון מניות זה ב1.7 מיליליטר microcentrifuge צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עטוף את aliquots של פתרון מניות H2DCFDA בנייר אלומיניום ולשמור בחושך בכל הזדמנות אפשרית, כי H2DCFDA הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> aliquots החנות H2DCFDA ב -20 ° C עד 3 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות - הכן פתרון מניות של אצטט Myristate phorbol (PMA): לשקול את 1 מ&quot;ג של PMA תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים (כלומר, כפפות, משקפי מגן ומסכה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים PMA ב 1 מיליליטר של DMSO לעשות 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 11 aliquots μl ב1.7 מיליליטר microcentrifuge צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> aliquots חנות של פתרון מניות PMA ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של H2DCFDA: ביום של הניסוי, להפוך את פתרון עובד H2DCFDA על ידי הוספת פתרון מניות H2DCFDA חלק 1 עד 1DMSO חלק (500 מיקרוגרם / מיליליטר H2DCFDA ריכוז סופי). לדוגמא, להוסיף 20 μl של פתרון מניות H2DCFDA ו20 DMSO μl לנייר כסף עטוף 1.7 מיליליטר צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של PMA: ביום של הניסוי, להפוך את פתרון עובד PMA על ידי הוספת פתרון מניות PMA חלק 1 ל49 חלקים nuclease מים חופשיים (20 מיקרוגרם / מיליליטר PMA ריכוז סופי). לדוגמא, לדלל 10 פתרון מניות PMA μl במי nuclease ללא μl 490 בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מינון של H2DCFDA: ביום של הניסוי, להפוך את פתרון מינון H2DCFDA עם ריכוז סופי של מיקרוגרם / מיליליטר H2DCFDA 1 במי ביצה. הכרכים מוכנים של פתרונות המינון ניתן לשנות כרצונכם, אך להבטיח כי הריכוזים הסופיים של חומרים כימיים נשמרים. לכליות, במקום מים ביצה, להשתמש באותו הנפח של medium/F-12 שונה Dulbecco של הנשר (50% DMEM, 50% F-12, ללא פנול אדום). כדי להפוך 5 מיליליטר של H2DCFDAמינון פתרון, להשתמש פיפטה 5 מיליליטר סרולוגיות להעביר 5 מיליליטר של מים ביצה (או DMEM/F-12) ל15 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי עטוף בנייר כסף ושכותרתו &quot;H&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 μl מים ביצה (או DMEM/F-12) מהמ&quot;ל 15 צינור חרוטי שכותרתו &#39;H&#39; וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של פתרון עובד H2DCFDA לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר שכותרתו &quot;H&quot; ומערבולת לערבב (נפח זה מספיק ל48 עובר או דוגמאות כליות (מחצית microplate היטב 96) ובארות אלה יספקו מדידות של הרמה של הקרינה רקע). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מינון של H2DCFDA + PMA: ביום של הניסוי, להפוך את פתרון H2DCFDA + PMA מינון עם ריכוזים סופיים של: H2DCFDA - 1 מיקרוגרם / מיליליטר ו PMA - 400 ng / ml. כדי להפוך 5 מיליליטר של תמיסת מינון H2DCFDA + PMA, השתמש פיפטה סרולוגיות 5 מיליליטר להעביר 5 מיליליטר של מים ביצה (או DMEM/F-12) לתוך צינור חרוטי חדש 15 מיליליטר שכותרתו &quot;H + P &#39;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 110 _6; ליטר של מים ביצה (או DMEM/F-12) מהמ&quot;ל 15 צינור חרוטי שכותרתו &#39;P + H&#39; וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של פתרון עובד H2DCFDA, ואז להוסיף לפתרון עובד PMA 100 μl לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר שכותרתו &#39;P + H&#39; ומערבולת לערבב (נפח זה מספיק ל48 דוגמאות או את החצי השני של microplate היטב 96 ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את פתרונות מינון על קרח. </li></ol> 3. תכנות Reader Microplate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשיר: כוח על קורא microplate. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את מקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תכנית לקריאת הקרינה: למשל עירור: 485 ננומטר; פליטה: 528 ננומטר; תפקיד אופטיקה: עליון 510 ננומטר; רגישות: 65, בצעד רועד 5 שניות לפני הקריאה. </li></ol></li></ol> 4. 96 ובכן Microplate הגדרה (ראה איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מצרכים: השג מנות עם עוברי dechorionated, microplate גם שחור 96, pipettor p200 וטיפים, דלי קרח עם H2DCFDA ופתרונות מינון H2DCFDA + PMA, pipettor p200 רבת ערוצים, שני מאגרי סטרילי, רדיד אלומיניום, ומספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר העברה אחד לבאר כל microplate 96 גם: מספריים השתמשו כדי לחתוך קצה פיפטה כך שעוברים או כליות כושר דרך הפתח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר pipettor p200 100 μl ולהעביר עובר אחד יחד עם מים ביצה (או DMEM/F-12) לכמה שיותר מהבארות של microplate גם שחור 96 כרצוי (אין צורך לשנות את קצה פיפטה לכל אחד שונה מדגם עובר בתוך תנאי ניסוי, אבל ייתכן שיהיה צורך לשנות את הטיפים בין תנאי ניסוי). הקפד להימנע מהעברת chorions שייר, כמו אלה נוטים להטות את הנתונים שנאספו. להעברת כליות, pipettor גדולה נפח (מוגדרת 100 μl) יכולה לשמש וניתן לחתוך טיפים פיפטה כדי להשיג גודל שעמם גדול יותר, במידת צורך. ייתכן שיהיה צורך לשלב את הבארות ללא דגימות עובר או בכליות, אבל עםפתרונות מינון כדי לשלוט על כמה מניפולציות ניסיוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרונות מינון: יוצקים פתרון מינון H2DCFDA לתוך מאגר 25 מיליליטר סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipettor p200 רבת ערוצים ושמונה טיפים לפיפטה בו זמנית מפתרון מינון H2DCFDA 100 μl לעמודה אחת בmicroplate 96 היטב (500 ריכוז ng / ml הסופי של H2DCFDA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו (שינוי טיפים לא הכרחי) לעמודים רבים ככל רצוי (בדרך כלל שישה עמודים או 48 בארות אם מילוי microplate 96 גם כולו). הוספת פתרון זה למחצית מהדגימות עובר השליטה ומחצית מהדגימות עובר המניפולציה ניסויית (96 microplate גם דוגמא להגדיר מוצגת באיור 2, בארות אלה (בצבע כתום) יספק נתונים הקרינה רקע בדגימות אינן מושרה עם PMA) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פתרון מינון H2DCFDA + PMA לתוך מאגר 25 מיליליטר חדש, סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipettor p200 רבת ערוצים ושמונה טיפים לsimultaneously פיפטה של פתרון מינון H2DCFDA + PMA 100 μl למדורים הנותרים (בצבע אדום באיור 2) של microplate 96 היטב (משתנה טיפים הוא לא הכרחי, ריכוזים סופיים של ng H2DCFDA-500 / מיליליטר וPMA-200 ng / ml) . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה microplate ברדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער את microplate כ 20 שניות ב150 סל&quot;ד homogenize פתרונות בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה microplate ב28 מעלות צלזיוס כאשר הוא לא להיות לקרוא. </li></ol> 5. כימות הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא microplate בזמן = 0 שעות לאחר התוספת של PMA באמצעות הפרמטרים שתוארו בשלב 3.1.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך במדידות בכל כמה דקות למרווח הזמן הרצוי או דגירה microplate העטוף בנייר האלומיניום ב28 מעלות צלזיוס עד לנקודת זמן מאוחרת יותר, ולאחר מכן לקחת את מדידת נקודת סיום בזמן רצוי (לדוגמא: 4 שעות לאחר התוספת של PMA). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לא פלסטיקפיפטה ransfer כדי לאחזר את העוברים מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העוברים לפי הטיפול שלך בבעלי החיים ופרוטוקול שימוש, למשל הטבילה בMS222 tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את microplate וחומרים חד פעמי אחרים במכל הפסולת הביולוגי המסוכן. </li></ol> 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלט על נקודת הזמן שבה אתה רוצה להשוות ערכי הקרינה (למשל 4 שעות לאחר התוספת של PMA, טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסר ערך הקרינה של קבוצת ביקורת בלתי המושרית הממוצעת מערכי הקרינה של קבוצת הביקורת המושרית PMA הבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו עבור קבוצת הניסוי עם ובלי PMA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את ערכי הקרינה מנורמלים אלה בשני טורים, השליטה + קבוצת PMA וקבוצת הניסוי + PMA (טבלת 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הממוצעים וסטיות תקן לערכי הקרינה מנורמלים של השליטה + grou PMAp וקבוצת PMA + הניסיונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את ערכי הקרינה מנורמלים באמצעות מבחן t מזווג כדי לקבוע מובהקות סטטיסטיות (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרף אמצעי השליטה + קבוצת PMA וקבוצת הניסוי + PMA עם ברים שגיאה המשקפים את סטיות התקן המתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את רמת המובהקות בגרף ובאגדת הדמות (איור 2). </li></ol>

<ol>
	<li>Medzhitov, R., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity:+Impact+on+the+Adaptive+Immune+Response.">Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response.</a> Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Maturation+of+the+Immune+System+in+Zebrafish,+Danio+rerio:+A+Gene+expression+Profiling.">Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling.</a> In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).</li><li>Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+Profiling+and+Functional+Analyses+of+the+Zebrafish+Embryonic+Innate+Immune+Response+to+Salmonella+Infection.">Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection.</a> J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).</li><li>Ordas, A., Hegedus, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Sequencing+of+the+Innate+Immune+Transcriptomic+Response+of+Zebrafish+Embryos+to+Salmonella+Infection.">Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection.</a> Fish &amp; Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transgenic+Zebrafish+Model+of+Neutrophilic+Inflammation.">A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation.</a> Blood. 13, 3976-3978 (2006).</li><li>Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+Inflammation+by+Retrograde+Chemotaxis+of+Neutrophils+in+Transgenic+Zebrafish.">Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+Promoter+Transgenes+Direct+Macrophage-Lineage+Expression+in+Zebrafish.">mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish.</a> Blood. 4, 56-56 (2011).</li><li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Zebrafish+is+Mediated+by+the+Cystic+Fibrosis+Transmembrane+Conductance+Regulator.">Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.</a> Infect. Immun. 11, 4542 (2010).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Disseminated+Candidiasis+in+Zebrafish+Reveals+Role+of+Phagocyte+Oxidase+in+Limiting+Filamentous+Growth.">Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth.</a> Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).</li><li>Rotman, J., van Gils, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+of+Innate+Immune+Gene+Expression+in+Zebrafish+using+Reverse+Transcription+-+Multiplex+Ligation-Dependent+Probe+Amplification.">Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification.</a> BMC Research Notes. 4, (2011).</li><li>d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Chemically+Induced+Inflammation+Assay+in+Zebrafish.">A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish.</a> BMC Biology. 8, 151 (2010).</li><li>Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Respiratory+Burst+Assay+using+Zebrafish+Kidneys+and+Embryos.">Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos.</a> Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).</li><li>Avdesh, A., Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+Care+and+Maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+Laboratory:+An+Introduction.">Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Brothers, K. M., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Disseminated+Candidiasis+in+Zebrafish+Larvae.">Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney.">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish.">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).</li><li>Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Unconventional+Behavior+of+Neutrophils+in+Developing+Zebrafish.">Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li><li>Davidson, A. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'Definitive'+(and+'Primitive')+Guide+to+Zebrafish+Hematopoiesis.">The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis.</a> Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).</li><li>Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Stimuli+Change+Expression+of+Genes+and+Neutrophil+Function+in+Fathead+Minnow+Pimephales+promelas+Rafinesque.">Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque.</a> Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Scale+Gradient+of+Hydrogen+Peroxide+Mediates+Rapid+Wound+Detection+in+Zebrafish.">A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish.</a> Nature. 459, 996-1000 (2009).</li><li>Thisse, B., Pflumio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+zebrafish+genome+during+embryogenesis.+(NIH+R01+RR15402).">Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402).</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2001).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Release+Clones:+A+High+Throughput+Expression+Analysis.">Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis.</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Table+18.4.">Table 18.4.</a> The Molecular Probes Handbook. , .</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

התפקיד העיקרי של phagocytes הוא לזהות, לבלוע ולהשמיד פתוגנים. היכולת של phagocytes לייצר פרץ נשימה נאות היא קריטית עבור פונקציה זו. לפיכך, כימות של תגובת פרץ בדרכי הנשימה היא שיטה אחת כדי לאפשר השוואה של בריאות כללית מולדת חיסונית ותפקוד בין קבוצות של יחידים ו / או בתגובה למניפו...

מערכת החיסון מורכבת משני סניפים: חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות. החסינות מולדת היא אבולוציונית עתיקה יותר חסינות אדפטיבית. חסרי חוליות נמצאות כיום חשבו שיש רק חסינות מולדת, בעוד שבעלי חוליות יש שני הסניפים המולדים ובעלי כושר הסתגלות. בעוד חסינות אדפטיבית מקנה חסינות ספציפית וארוכת טווח לפתוגנים מסוימים, חסינות מולדת היא תגובה מיידית לחיידקים פולשים, וירוסים ופטריות. היבט חיוני של תגובת החיסון המולדת כולל את שחרורו של ציטוקינים וכמוקינים, שגורם לדלקת וגיוס phagocytes (למשל מקרופאגים, נויטרופילים) לבלוע ולהשמיד פולשים זרים. תגובות חיסוניים מולדים מוצלחות לערב: (1) הכרה במיקרואורגניזמים פולשים, (2) אינדוקציה של המפלים המתאימים איתות (למשל שחרורו של ציטוקינים וכמוקינים); (3) התפתחות תקינה / מספרים מספקים של תאי phagocytic; (4) הגירה של phagocytes לאתרים של זיהום; (5) היבלעות של פתוגנים, וכן (6) השמדת מיקרואורגניזמים נבלעו. מחסור בכל אחד מהשלבים הבאים עלול להוביל למארח להיות המום, ונכנע ל, הזיהום. תגובה חיסונית מולדת חזקה היא חיונית לבריאותם של אורגניזמים כי זה קו הגנה הראשון מפני פתוגנים בכל הצמחים ובעלי החיים. בבעלי חוליות, זה גם מגביר את התגובה החיסונית אדפטיבית 1. לכן, זה קריטי, כי אנחנו מסוגלים להעריך את כל ההיבטים של תגובת החיסון המולדת כדי להבין את זה טוב יותר ועל מנת לייעל את תפקודו. אורגניזמים מודל רבים משמשים ללמוד חסינות מולדת, החל Arabadopsis לג elegans לדרוזופילה לעכברים לתאי אדם בתרבית. יתרון בשימוש במערכת מודל (Danio rerio) דג הזברה ללמוד חסינות מולדת הוא שדג הזברה היא חוליות, עם im שני המולדות אדפטיביתmunity, אך הפיתוח של חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות מופרד בזמן. דג הזברה להסתמך רק על חסינות מולדת להגנה מפני זיהום עד חסינות אדפטיבית הופכת מתפקד במלואה, אשר מתרחשת לאחר סביב 4-6 שבועות הפריה 2. בנוסף לכלים למניפולציה גנטית, בהירות אופטית והתפתחות מהירה, חיצונית, חסינות מולדת כמצב עיקרון ההגנה בעוברי דג הזברה מספקת מודל מופשט שבו ללמוד את המורכבות של תגובת החיסון המולדת in vivo. פרוטוקולים מרובים פותחו כדי להעריך את ההיבטים שונים של התגובה החיסונית המולדת בעוברי דג הזברה. Microarrays וRNAseq אימתו כי פרופילי ציטוקינים שהושרו על ידי התגובה החיסונית המולדת דג הזברה הם דומים לזו של בני אדם וגם הציעו את מעורבותם של גנים בלתי צפויים בחסינות מולדת 3,4. השקיפות של עובר דג הזברה וניאון, transgenזני ic של פתוגנים ודג זברה מאפשרים ויזואליזציה של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן דינמיים in vivo בזמן אמת. עוברי דג הזברה מהונדסים להביע GFP תחת שליטה של אמרגן נויטרופילים הספציפיים myeloperoxidase 5,6 או אמרגן MPEG1 מקרופאג ספציפי 7 הפכו אותו ניתן לחזות ולכמת הגירת תא בלען לאתרים של זיהומים מקומיים 8, כמו גם כדי להמחיש phagocytosis והרס של כותרתו fluorescently פתוגנים 8,9. עוברי דג הזברה גם נתונים לדור של מבחני תפוקה גבוהה והמסכים כימיים. בהתאם לכך, שיטות תפוקה גבוהה של ניתוח transcriptome על זיהום 10 והגירה תא בלען לאתרים של פגיעה כימית שגרמה 11 לאחרונה פותחו. של הטכניקות המפורטות לעיל, אף כמותית להעריך את השלב הסופי של השמדת הפתוגן ידי phagocytes. שלב סופי זהכרוך בפרץ בדרכי הנשימה (כלומר ייצור של ROS ותרכובות רעילות אחרות), אשר להרוג פתוגנים נבלעו. מונואמין NADPH האנזים הוא מקור עיקרי של ROS בתאי phagocytic. הרכבה של יחידות משנה של תוצאות אנזים מונואמין NADPH בהעברת אלקטרונים לחמצן, שהניבו אניוני סופראוקסיד. דרך תגובות אנזימטיות שלאחר מכן, סופראוקסיד אז יכול להיות מומר למי חמצן וחומצת hypochlorous (איור 1 א). זה פרץ הנשימה של phagocytes שהורג פתוגנים וכך, כימות של פוטנציאל פרץ הנשימה של עוברי דג הזברה היא מעיד על בריאות מערכת החיסון מולדת בכללותה. פיתחנו assay הקרינה מבוסס לכמת את פרץ הנשימה בקבוצות של עוברי דג הזברה בודדים 12. assay זה מנצל בצורה לא פלורסנט, מופחתת של צבע זמין באופן מסחרי, תא חדיר. צבע זה, 2 &#39;, diacetate 7&#39;-dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA), מומר לנורותמתחם הסנט, 2 &#39;, 7&#39;-dichlorofluorescein (DCF), על חמצון. ROS המגוון שנוצר על ידי פרץ הנשימה תא בלען יכול לחמצן H2DCFDA וליצור הקרינה 24. המראה של הקרינה יכול לשמש כדי לכמת ולהשוות את תגובת פרץ בדרכי הנשימה בין קבוצות של דג הזברה. אצטט החלבון קינאז C Myristate phorbol אגוניסט (PMA) משמש כדי לגרום כימי מונואמין NADPH כדי לייצר ROS ובכך להגדיל את קריאות הקרינה (איור 1). בזאת, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של גרסה שונה והמותאמת של assay זה דג הזברה עובר הנשימה פרץ. assay זה יכול לשמש כדי להשוות את פרץ הנשימה בין קבוצות של עוברי דג הזברה בודדים לאורך זמן ו / או בתגובה למניפולציות ניסיוני (מציאה חלבון למשל בתיווך morpholino). השימוש בשיטה זו, בשילוב עם מבחני חסינות אחרים דג הזברה מולדים, תספק תמונה של מורכב וקריטי שלמה יותרתגובה חיסונית מולדת.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

פרץ הנשימה תא בלען הוא חלק מהתגובה החיסונית המולדת לזיהום הפתוגן וכרוך בייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS). ROS הם רעילים ולתפקד כדי להרוג מיקרואורגניזמים phagocytized. בvivo כימות של ROS נגזר תא בלען מספקת מידע לגבי היכולת של האורגניזם לעלות תגובה חיסונית מולדת חזקה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לכמת ולהשוות ROS בעוברי דג הזברה שלמים על אינדוקציה כימית של פרץ הנשימה תא בלען. שיטה זו עושה שימוש במתחם שאינו ניאון שהופך ניאון על ידי חמצון ROS. עוברי דג הזברה אישיות pipetted לתוך הבארות של microplate וטופחו בfluorogenic מצע זה עם או בלי inducer כימי של הפרץ בדרכי הנשימה. הקרינה בכל אחד גם היא לכמת בנקודות זמן רצויות באמצעות קורא microplate. קריאות הקרינה מותאמות לחסל את הקרינה רקע ולאחר מכן במשותףmpared באמצעות מבחן t מזווג. שיטה זו מאפשרת השוואה של פוטנציאל פרץ הנשימה של עוברי דג הזברה בשלבי התפתחות שונים ובתגובה למניפולציות ניסיוני, כגון מציאה חלבון, ביטוי יתר, או טיפול עם סוכנים תרופתיים. גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לפקח על תגובת פרץ בדרכי הנשימה בכליות שלמות גזורות או תכשירי תא מכליות של דג הזברה מבוגר וכמה מיני דגים אחרים. אנו מאמינים כי הפשטות והתאמה היחסית של פרוטוקול זה ישלימו את הפרוטוקולים קיימים ויהיו עניין לחוקרים המבקשים להבין את התגובה החיסונית המולדת טוב יותר.

כאן, אנו מספקים 72 שעות שלאחר הפריה (hpf) נתונים המשווים את תגובת דרכי הנשימה פרץ בעוברי דג הזברה (wild-type, רקע א.ב.) ב48 ו. 48 עוברי hpf שימשו כקבוצת הביקורת שלנו ו72 hpf העוברים כקבוצת הניסוי שלנו. גודל המדגם השתמש היה 24 עוברים הנגרמים האו&quot;ם ו24 עוברים הנגרמים PMA לשלב ההתפתחותי. ק?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish at JoVE.com

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

התגובה החיסונית המולדת מגנה על אורגניזמים מפני זיהום הפתוגן. מרכיב קריטי של התגובה החיסונית המולדת, פרץ הנשימה תא בלען, מייצר מיני חמצן תגובתי שהורגים מיקרואורגניזמים פולשים. אנו מתארים assay פרץ נשימה שמכמת מיני חמצן תגובתי נוצרו כאשר התגובה החיסונית המולדת מושרה כימית.

כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

quantification-respiratory-burst-response-as-an-indicator-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.5K Views.  University of Maine.  התגובה החיסונית המולדת מגנה על אורגניזמים מפני זיהום הפתוגן. מרכיב קריטי של התגובה החיסונית המולדת, פרץ הנשימה תא בלען, מייצר מיני חמצן תגובתי שהורגים מיקרואורגניזמים פולשים. אנו מתארים assay פרץ נשימה שמכמת מיני חמצן תגובתי נוצרו כאשר התגו?...

Video: Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

דגם העכבר כדי להעריך מולדת התגובה החיסונית לזיהום Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...