המחברים מבקשים להודות קואי צ&#39;או, קומה דה קורט, מרפסת אסתר ראלף קרבאליו לתמונות בתרשים 4 אולריקה Nehrdich ודייוי דה ויט לטיפול דגים, ובני מעבדה אחרות דיונים מועילים. עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית תמהיל חכם של משרד הולנד לעניינים כלכליים ומשרד החינוך, התרבות והמדע, הנציבות האירופית 7 הפרויקט במסגרת ZF-בריאות (בריאות F4-2010-242048), מארי קירי האירופי הדרכה ראשונית רשת FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), ועל ידי NHMRC אוסטרלי (637,394). אוסטרליה הרגנרציה לרפואה המכון נתמך על ידי תרומות של ממשלת מדינת ויקטוריה ממשלת אוסטרליה.

<ol>
	<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li><li>Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17, 693-702 (2002).</li><li>vander Sar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections.">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).</li><li>Zakrzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-specific+gene+functions+in+Spi1-directed+innate+immunity.">Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity.</a> Blood. 116, 1-11 (2010).</li><li>Le Guyader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li><li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo.">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126, 3735-3745 (1999).</li><li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mycobacterium+marinum+TesA+mutant+defective+for+major+cell+wall-associated+lipids+is+highly+attenuated+in+Dictyostelium+discoideum+and+zebrafish+embryos.">A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos.</a> Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).</li><li>Carvalho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).</li><li>van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+the+zebrafish+host+transcriptome+response+to+acute+and+chronic+mycobacterial+infection+and+the+role+of+innate+and+adaptive+immune+components.">Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components.</a> Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book.">The Zebrafish Book.</a> A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Brain+Ventricle+Injection.">Zebrafish Brain Ventricle Injection.</a> J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 49-56 (2011).</li><li>Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+and+functional+analyses+of+the+zebrafish+embryonic+innate+immune+response+to+Salmonella+infection.">Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection.</a> J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).</li><li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Stoop, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component.">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).</li><li>Levraud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+zebrafish+IFN+receptor:+implications+for+the+origin+of+the+vertebrate+IFN+system.">Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system.</a> Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).</li><li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity.">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth.">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).</li><li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo:+unlike+macrophages,+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes.">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).</li><li>van Soest, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).</li><li>Adams, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+tolerance+in+replicating+mycobacteria+mediated+by+a+macrophage-induced+efflux+mechanism.">Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism.</a> Cell. 145, 39-53 (2011).</li><li>Ellett, F. L., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+quantification+of+fluorescent+leukocyte+numbers+in+zebrafish+embryos.">Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos.</a> Methods in Enzymology. , (2011).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).</li><li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish.">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li><li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish.">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

שיטות הזיהום המתוארות במאמר זה נעשה שימוש לעתים קרובות כדי ללמוד את הפונקציה של גנים מולדים המארחות חסינות או גנים ארסיות חיידקים 1. תוך ורידי של מיקרו הזרקה שיטות (פרוטוקולים 5 ו 6.1) משמשים בדרך כלל ללימודים כאלה. וריד הזנב על האי דם האחורי הוא המיקום הנוח ביותר עבור הזרקה תוך ורידית של 1-בני יומם עוברים. כמו וריד הזנב הופך להיות קשה יותר לחדור בשלבים מאוחרים יותר, אנו מעדיפים את צינור של קיביה כאתר הזרקה תוך ורידית של עוברי ב DPF 2-3. בכל מקרה זה קריטי להזריק את העוברים עם מספרים עקביים של חיידקים, אשר צריך להיבדק על ידי הזרקת inocula ציפוי על ספירת CFU. ההיבטים הבאים יש לקחת בחשבון כדי להשיג זריקות לשחזור. ראשית, חשוב שיהיה באיכות גבוהה microcapillary זכוכית מחטי הזרקה. אם קצה המחט גדולה מדי, הזרקת תיצור חור לנקב גדול מספיק מדמם להתרחשהחיידקים המוזרקים יזרום מתוך מחזור הדם. שנית, החיידק חייב להיות מוזרק ישירות לתוך מחזור הדם. אם קצה המחט לא בתוך הווריד או אם נוזל מתפשט זריקה לתוך הרחבה שק חלמון, העובר חייב להיות מושלך מן הניסוי. שלישית, באמצעות PVP40 כנשא להזרקת מ &#39; marinum יסייע למנוע את החיידקים מן שוקע בתוך מחט זכוכית. PVP40 משפר את ההומוגניות של השעיה, וכתוצאה מכך inocula יותר לשחזור בכל משך זמן של זריקות. PVP40 יכול לשמש גם למטרות ס זריקות typhimurium, אבל כאן זה פחות חשוב כי גודל גדול הקרינה בהיר של החיידקים מאפשר בקרה חזותית על הבידוד הזרקת במהלך הניסויים. עבור לתרגל את הזריקות אנו ממליצים להשתמש פנול אדום צבע (1% V / V) או 1 מיקרומטר כדורים ניאון זמין בצבעים שונים (Invitrogen). לאחר הטכניקה שולט, זה לוקח בערך 30 מינוטes להזריק 50-100 עוברים, כולל הזמן הדרוש יישור עוברים על צלחות agarose והתאמת נפח הזרקת חיידקים. בעוד זריקות תוך ורידי לתוך האי דם (פרוטוקול 5) או לתוך צינור של קיביה (פרוטוקול 6.1) משמשים בדרך כלל, על דרכים חלופיות של זיהום המתוארות במאמר זה וידאו הוכיחו שימושי ללמוד מקרופאג ו נויטרופילים chemotaxis (פרוטוקולים 6.2, 6.3 , ו - 6.4), ללמוד הצמיחה של זני חיידקים מוחלשים (פרוטוקול 6.5), ולהתאים את המודל זיהום דג הזברה עבור תפוקה גבוהה יישומים (פרוטוקול 6.6) 4-8. תיאר את שיטות הזרקת מיקרו יכול להיות מיושם גם על זריקות של 18 וירוסים, נבגי פטריות 19, 14, 20 או טפילים protozoan (מריה פורלנזה, תקשורת אישית). בנוסף שימושי הנהלים הזרקת המתוארות במאמר זה וידאו היא הליך תיאר לאחרונה להזרקה תת עורית של חיידקים לתוך zebrafish עוברים 21. נוהל זה יושם ללמוד phagocytosis של חיידקים על ידי נויטרופילים, שנמצאו חיידקים לבלוע ביעילות על משטחים רקמות אבל, בניגוד מקרופאגים, לא הצליחו כמעט phagocytose חיידקים על זריקה לתוך הדם או אל מלאות נוזל חללים בגוף. עבור העוברים תת עורי זריקות ממוקמים דומה באשר השריר זריקות זנב המתוארות במאמר זה וידאו, אבל את המחט מוחדרת מתחת לעור להזריק את החיידקים על somite. חשוב לקחת בחשבון כי מיקרו הזרקה היא למעשה תוואי מלאכותית של זיהום. עם זאת, עוברי מוקדם עמידות מאוד לחשיפה חיצונית פתוגנים חיידקיים. למעשה, מבחני טבילה, שבו עוברים שטופים ההשעיה חיידקי, לא לשחזור בידינו 22. בעוד כמה עוברי יכול להידבק על טבילה, ראינו שונות רבה בשיעורי התמותה והן אקספרסיון של גנים דלקתיים סמן בין עוברים מבחני בודדים כאלה. המיקרו הזרקה בשיטות המתוארות במאמר זה להשיג זיהומים לשחזור והם יעילים במיוחד כדי לחקור אינטראקציות חיידקים עם תאים חיסוניים מולדים המארחות. הגישה היעילה לכמת זיהום חיידקי עוברי בודדים היא לנתח את התמונות ניאון של עוברים נגועים מחוייט, תוכנה ייעודית כימות פיקסל 17, 23. גישה זו הוכח לתאם גם עם התוצאות של ספירת CFU לאחר ציפוי של עוברים נגועים. כמו כן, שינויים יחסית במספרים ליקוציט לכל העובר היה לכמת ידי ניתוח תמונה דיגיטלית ב מהונדס fluorophore קווי ליקוציט הכתב, גישה זו תהיה ישימה לכימות בתגובה המארח leukopoietic לזיהום 24. פונקציה של גנים מארח מולדים החיסון ניתן לחקור ביעילות על ידי שילוב של מודלים זיהום המתוארים vivoעם מציאה morpholino. Morpholinos הם מולקולות אנטיסנס סינתטיים כי היעד RNAs ספציפיים ולצמצם את הביטוי של גנים המוצרים כאשר מזריקים 1-סלולריים עוברי דג הזברה הבמה כפי שמוצג כתבות וידאו אחרים היומן הזה 10, 25. במחקרים morpholino מציאה, יש חשיבות רבה, כי כל הקבוצות העובר כדי להשוות מועלים בצורה נכונה לפני זריקות חיידקים. זה חשוב במיוחד, כי עוברים יש מערכת החיסון מפתחת המוסמכת שהופך יותר ויותר עם הזמן. ישנם כמה קווי הכתב מהונדס זמין כרגע להבחין בין תת קבוצות עיקריות החיסון המולדת, מקרופאגים, נויטרופילים עוברי דג הזברה. MPX ואת היזמים lyz שימשו כדי ליצור קווי הכתב נויטרופילים 16, 26, 27, ו csf1r (FMS) ו MPEG1 מקדמי שימשו להפקת כתבים מקרופאג 14, 28. בעוד CSF1R (FMS) באה לידי ביטוי ב xanthophores בנוסף, MPEG1 הביטוי הוא אך ורק מקרופאגים. כפי שניתן לראות במאמר זה וידאו, שפותחו לאחרונה MPEG1 קווי הכתב שימושיים ביותר עבור phagocytosis הדמיה חיידקי ידי מקרופאגים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> ספק </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> סיגמא </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco מידלברוק אגר 7H10 </td><td> בקטון, דיקנסון והחברה </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL מידלברוק העשרה OADC </td><td> בקטון, דיקנסון והחברה </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco מידלברוק 7H9 מרק </td><td> בקטון, דיקנסון והחברה </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL מידלברוק העשרה ADC </td><td> בקטון, דיקנסון והחברה </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;, Phenylthiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate מלח (Tricaine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> מתיל תאית </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque agarose (נמוך נקודת ההיתוך agarose) </td><td> Lonza בע&quot;מ </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 מיקרומטר, אדום ניאון (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 מיקרומטר, צהוב, ירוק ניאון (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens

דג הזברה (Danio rerio) עוברים משמשים יותר ויותר כמודל לחקר תפקוד של מערכת החיסון המולדת חוליות של אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן 1. את סוגי התאים העיקריים של מערכת החיסון המולדת, מקרופאגים ו נויטרופילים, לפתח במהלך הימים הראשונים של embryogenesis לפני ההבשלה של לימפוציטים הנדרשים תגובות הסתגלות המערכת החיסונית. להקל על קבלת מספר גדול של עוברים, נגישות בשל פיתוח חיצוני, שקיפות אופטית של בשלבים עובריים הזחל שלהם, מגוון רחב של כלים, משאבים גנטיים מוטציה נרחבים ואוספים של שורות הכתב מהונדס, כולם להוסיף צדדיות של דג הזברה המודל. סלמונלה enterica serovar Typhimurium (ס &#39;typhimurium) ו Mycobacterium marinum יכולים לשכון intracellularly ב מקרופאגים ו משמשים לעתים קרובות ללמוד בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות עוברי דג הזברה. את הזיהום של תהליכים אלה 2חיידקים פתוגנים הם מעניין להשוות בגלל ש &#39; זיהום typhimurium הוא חמור וקטלני בתוך יום אחד, בעוד מ &#39; זיהום marinum היא כרונית ניתן הדמיה עד שלב הזחל 2, 3. האתר של הזרקת מיקרו של חיידקים אל העובר (תרשים 1) קובע אם הזיהום יהיה להפוך במהירות מערכתי או יהיה בתחילה להישאר מקומי. זיהום מערכתי מהיר ניתן לקבוע על ידי מיקרו הזרקת חיידקים ישירות למחזור הדם דרך וריד הזנב על האי דם אחורי או דרך צינור של קיביה, ערוץ זרימת רחב על שק החלמון חיבור הלב vasculature את תא המטען. ב DPF 1, כאשר עוברים בשלב זה יש מקרופאגים פעילים phagocytically אבל הנויטרופילים לא הבשילו עדיין, הזרקת לאי דם עדיפה. על זריקות ב 2-3 DPF, כאשר עוברים גם פיתחו תפקודית (myeloperoxidase לייצור) נויטרופילים, הדביק של קיביה עדיף לא כמוהוא הזרקת באתר. ללמוד הגירה מכוונת של תאים מיאלואידית כלפי זיהומים מקומיים, חיידקים יהיה ניתן להזריק לתוך השריר הזנב, שלפוחית ​​otic, או למוח האחורי החדר 4-6. בנוסף, notochord, מבנה שנראה נגיש בדרך כלל תאים מיאלואידית, סיכון גבוה לזיהום מקומי 7. חלופה שימושי תפוקה גבוהה יישומים הוא הזרקה של חיידקים לתוך החלמון של העובר במהלך השעות הראשונות שלאחר ההפריה 8. שילוב של חיידקים ניאון וקווי דג הזברה מהונדס עם מקרופאגים או נויטרופילים פלורסנט יוצר נסיבות אידיאליות עבור הדמיה רב צבע בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות. מאמר זה יתאר וידאו פרוטוקולים מפורטים של זיהום תוך ורידי ומקומיים של עוברי דג הזברה עם ס &#39; typhimurium או מ &#39; marinum חיידקים עבור דימות פלואורסצנטי הבאות של אינטראקציה עם תאים של מערכת החיסון המולדת.

Watch this Scientific Journal Video about Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens at JoVE.com

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים, כגון<em&gt; סלמונלה typhimurium</em&gt; ו<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. מיקרו הזרקה של חיידקים רב צבע דימות פלואורסצנטי טכניקות חיוניים המעורבים ביישום מודלים של זיהום העובר דג הזברה.

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

infection-of-zebrafish-embryos-with-intracellular-bacterial-pathogens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.4K Views.  Leiden University. עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים, כגון סלמונלה typhimurium ו Mycobacterium marinum. מיקרו הזרקה של חיידקים רב צבע דימות פלואורסצנטי טכניקות חיוניים המעורבים ביי...

Video: Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

ויזואליזציה של מקרופאג Lytic תא המוות במהלך זיהום פטרת העוברים באמצעות מיקרוסקופ אינטרטל

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are limited. In addition, they exhibit adverse side effects in certain groups of people. Therefore, discovery of novel therapeutics for clinical toxoplasmosis is imperative. The first step of novel antibiotic development is to identify chemical compounds showing high efficacy in inhibition of parasite growth using a high throughput screening strategy. As an obligate intracellular pathogen, Toxoplasma can only replicate within host cells, which prohibits the use of optical absorbance measurements as a quick indicator of growth. Presented here is a detailed protocol for a luciferase-based growth assay. As an example, this method is used to calculate the doubling time of wild-type Toxoplasma parasites and measure the efficacy of morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl (LHVS, a cysteine protease-targeting compound) regarding inhibition of parasite intracellular growth. Also described, is a CRISPR-Cas9-based gene deletion protocol in Toxoplasma using 50 bp homologous regions for homology-dependent recombination (HDR). By quantifying the inhibition efficacies of LHVS in wild-type and TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficient parasites, it is shown that LHVS inhibits wild-type parasite growth more efficiently than &#916;cpl growth, suggesting that TgCPL is a target that LHVS binds to in Toxoplasma. The high sensitivity and easy operation of this luciferase-based growth assay make it suitable for monitoring Toxoplasma proliferation and evaluating drug efficacy in a high throughput manner.

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Presented here is a protocol to evaluate the inhibition efficacy of chemical compounds against in vitro intracellular growth of Toxoplasma gondii using a luciferase-based growth assay. The technique is used to confirm inhibition specificity by genetic deletion of the corresponding target gene. The inhibition of LHVS against TgCPL protease is evaluated as an example.

קביעת יעילות מעכבי כימית נגד הצמיחה טוקסופלזמה Gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...