אנו מודים לכריסטין הולט וביל האריס על העזרה במיקרוסקופיה קונפוקלית. אנו מודים לדארן גילמור על מבני עמוד השדרה של הטיימר הפלואורסצנטי ואנה הוטנלוצ'ר על וקטור עמוד השדרה של טול 2-ליז. אנו מודים לסטיב רנשו על קו Tg (mpx:GFP)i114 . עבודה זו נתמכה על ידי MRC (MR/L019523/1), קרן Wellcome [204845/Z/Z/16/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] ומענק אייזק ניוטון נאמנות 19.23(n). C.C נתמך על ידי סטודנטית MRC DTP ובחלקו על ידי קרן Wellcome [204845/Z/Z/16/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] מענק. H.W. נתמך על ידי סטודנטיות DTP MRC. H.P. נתמך על ידי מענק לדוקטורט של Wellcome Trust (105391/Z/Z/14/Z) ובחלקו על ידי קרן Wellcome [204845/Z/Z/Z/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] מענק MRC (MR/ L019523/1).

<ol>
	<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li><li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration.">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases.">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li><li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells.">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).</li><li>Arnon, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK2-dependent+S1PR1+desensitization+is+required+for+lymphocytes+to+overcome+their+attraction+to+blood.">GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood.</a> Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li><li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4.">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don&#224;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient.">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li><li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+dynamics+of+an+endogenous,+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue.">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li><li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+receptor+internalization,+signaling+level,+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration.">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, 5702-5710 (2012).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase.">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).</li><li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish.">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics.">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2004).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li><li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Textural+features+for+image+Classification.">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+infection:+From+pathogenesis+to+cell+biology.">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).</li><li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals.">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li><li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Zebrafish+and+CRISPR/Cas9:+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline.">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy.">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים

השיטה המתוארת מאפשרת הדמיה חיה של דינמיקת הקולטן בתגובה לליגנדים אנדוגניים במקום במהלך תגובה דלקתית לנזק לרקמות. השימוש בכתבי נויטרופילים Cxcr1/Cxcr2 יכול להיות מורחב להגדרות פיזיולוגיות אחרות, כגון זיהום, מודלים של גידולים או סוגים אחרים של נזק לרקמות 14,25,26,27. בנוסף, קווי הצלה מהונדסים, שבהם הקולטן האנדוגני מדוכא ומציל על ידי קולטן מוטציה אקסוגנית, יכולים לספק כלים שימושיים לנתח את החשיבות של דפוסי נדידת נויטרופילים ספציפיים בתגובות חיסוניות. לדוגמה, מוטציות קולטן Cxcr1 אשר לקוי desensitization לגרום קיבוץ נויטרופילים בולט יותר באתרים דלקתיים14. רווח זה של פנוטיפ פונקציה יכול לשמש כדי להבין את התפקיד של קהילת נויטרופילים בתהליכים פיזיולוגיים שונים, למשל, תיקון פצעים, מחלה זיהומית, או התפתחות הגידול, ולהשלים את הקולטן knockdown / ניסויי נוקאאוט. המתודולוגיה מספקת גם בסיס להרחבת מגוון הכתבים הזמינים. הבחירה של כתב פלואורסצנטי חשוב לשקול ותלוי בשאלה הביולוגית. מצאנו כי המחזור המכונן של קולטני כימוקין אלה בנויטרופילים היה גבוה, בהשוואה לתאי אפיתל, וכי כתבים עם התבגרות מהירה (למשל, sfGFP) נדרשו לדווח על רמות הממברנה במצב יציב ולפתור הבדלים על גירוי נויטרופיל 8,14. לכן, יחסי ממברנה של sfGFP / tagRFP אינם ישימים למדידת הפנמה הנגרמת על ידי ליגנד בסוג תא זה, אבל התבנית של tagRFP מאפשר מעקב אחר גורלות תאיים של הקולטן, אשר יכול להיות שימושי במחקרים מסוימים. מצאנו גם כי האות התאי המרוכז יותר של tagRFP שימושי לסינון זחלים בודדים. גישה חלופית למדידת רמות הקולטן בקרום הפלזמה תהיה לבטא במשותף סמן קרום פלואורסצנטי בנויטרופילים או באותו טרנסג'ן9 או בטרנסג'ן עצמאי14. בתרחיש הקודם הטרנסג'ן יספק אמצעי נוסף לסינון הדגים ורמות הביטוי יהיו דומות בין הסמן לקולטן. הגישה השנייה תהיה מודולרית יותר, בכך שקו דגי זברה עם כתב קולטן יכול להיות משולב עם קווים עיתונאיים שונים. בכל מקרה, ראוי לציין כי כימות הממברנה של רמות הקולטן מאתגר נויטרופילים מקובצים באשכולות (ראה להלן). לבסוף, נציין כי הרחבה אפשרית של פרוטוקול זה תהיה לעקוב אחר ההדמיה החיה על ידי אימונוהיסטוכימיה לניתוחי לוקליזציה מפורטים יותר.
מערכת Transgenesis Tol2 מבוססת היטב7 ומקדם lysozyme C שימש בהרחבה לביטוי נויטרופיל11,15. הגישה הטרנסגנזה היא, אם כן, פשוטה יחסית ורמת הביטוי שהושגה עם מקדם זה גבוהה מספיק כדי לספק ניגודיות מספקת לניתוח דינמיקת הקולטן. מגבלה אפשרית היא שרמת הביטוי אינה מסכמת מחדש את רמות הביטוי של קולטן אנדוגני. טכנולוגיות CRISPR חדשות ניתן לפרוס כדי להקים קווי נוק-אין עבור קולטנים של עניין מסוים28. טכנולוגיות אלה עדיין מסורבלות וייתכן שאינן מבטיחות את רמות הביטוי הנדרשות להדמיה תת-תאית, אך פיתוחן המוצלח יהווה פריצת דרך חשובה להבנת דינמיקת האיתות האנדוגנית. אימותים פונקציונליים חשובים לפענוח נתונים עם מבני קולטן מהונדסים. לדוגמה, ניתן להשתמש בבדיקות זיהוי ליגנד כדי לקבוע כי חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי הוא פונקציונלי והצלה של פנוטיפים נוקאאוט יכול לשמש כדי לקבוע כי רמות ביטוי נויטרופיל מהונדס תואמות לפונקציונליות14. לבסוף, דרך ישירה יותר לאמת את היתוך הקולטן יהיה לנצל בדיקה פונקציונלית במבחנה עם קולטן מתויג לצד גרסאות שאינן מסומנותבתווית 14.
גישת הכימות מטפלת בקשיים ספציפיים בפילוח ממברנות מדויק בנויטרופילים ב- vivo. בתאים של טבע אפיתל, כימות של רמות הקולטן יכול להתבצע באופן אוטומטי על ידי נרמול רמות קולטן הממברנה לסמן בקרה, אשר יכול לבוא לידי ביטוי יחד או בנפרד9. אכן, יישמנו גישה כזו, כאשר אנו משתמשים בבדיקת זיהוי ליגנד בעובריםגסטריים 14. עם זאת, נויטרופילים עוברים שינויים מורכבים ומהירים בצורת התא ב- vivo, מה שהופך את פילוח הממברנה לקשה הן בדו-ממד והן בתלת-ממד14. זה אפילו יותר מאתגר כאשר נויטרופילים אשכול, אשר מתרחשת בהגדרות פיזיולוגיות רבות29. מדד הניגודיות מתגבר על מגבלה זו מכיוון שהוא אינו דורש פילוח ממברנות אלא משקף את המצב הכולל של התפלגות הקולטן בתא (membranous/smooth vs vesicular/dotty). חשוב לציין כי מדד הניגודיות יכול להיות מושפע מהניגודיות הכוללת של התמונה, ולכן נדרשת נורמליזציה של ערכי תאים בודדים להפניה פנימית כדי להסביר את השונות של האות בעוברים/דגימות שונים. לדוגמה, השתמשנו בערך הניגודיות הממוצע לתאים של נויטרופילים שאינם מגיבים ב- CHT (כלומר, נויטרופילים שנשארים נייחים ואינם נודדים לסנפיר הגחון)14. אפשרות נוספת תהיה לנרמל עם ערכי ניגודיות של סמן בקרה באותו תא. זה יספק פתרון כאשר הפניה פנימית של תאים שאינם מגיבים אינה זמינה ועשויה לפתור הבדלים כמותיים עדינים יותר בדינמיקת הקולטן בין תנאים שונים.
מיקום ההדמיה הוא משתנה נוסף שיש לקחת בחשבון. הסיבה לבחירת פצע הסנפיר הגחוני כאן, בניגוד לפצע סנפיר הזנב הנפוץ יותר מודל16,30, היא כי האתר של פציעה נמצא בקרבת האתר של מגורים נויטרופילים / מקור נודד. זה מאיץ את ציר הזמן של הבדיקה, כפי שלוקח יחסית מעט זמן עבור נויטרופילים להגיע. בנוסף, הוא מספק את ההזדמנות ללכוד את התנהגות התא הן במקור ההעברה (CHT) והן במיקום היעד של עניין (פצע). זה רלוונטי כאן, כי הרזולוציה המרחבית והזמן הנדרשת להדמיה תת-תאית קשה לשלב עם שדה ראייה גדול או סריקה מרובת מיקומים. לפיכך, בדיקת פצע הסנפיר הגחוני מאפשרת מעקב אחר התפתחות התגובה הנודדת ממקור הנדידה ולכידה סימולטנית של תנודות קולטן לא ספציפיות בתאים שאינם מגיבים. כפי שהוזכר לעיל, האחרון שימושי למטרות כימות כפי שהוא מספק התייחסות פנימית עבור דינמיקה לא ספציפית. במערכות אחרות, ייתכן שלא ניתן יהיה לקבל התייחסות פנימית כזו, ובמקרה זה ערכי הניגודיות של סמן קרום מבוטא במשותף יספקו שליטה חלופית.
לסיכום, אנו צופים כי המתודולוגיה חלה על מערכות אחרות וניתן לפרוס אותה למגוון מטרות. לדוגמה, אותם כתבים יכולים להיות מנוצלים בהגדרות דלקתיות אחרות, כגון הגדרות זיהום או מודלים אחרים של מחלות. הרפרטואר של קווי הכתב קולטן דגי הזברה יכול להיות מורחב לקולטני איתות אחרים, כדי להבין מנגנוני איתות או לדווח על דינמיקה ליגנד ב vivo. הגישה יכולה להיות משולבת עם טכניקות נוקאאוט / נוקאאוט כדי לחקור את הבסיס המכני של דינמיקה נצפית. לדוגמה, הפרעה של ביטוי ליגנד יכול להצביע על התלות ligand עבור דינמיקה קולטן נצפתה. בעתיד, אנו צופים כי המערכת יכולה להיות מעודנת עוד יותר לשלב נוק-אין החדרה של כתבים. בסופו של דבר, ממצאים המשתמשים במתודולוגיה זו יספקו תובנות חדשניות בעלות ערך מעבר לקהילת דגי הזברה, בהתחשב בשימור קולטני האיתות האלה ביונקים ובאתגר היחסי של עריכת מחקרים אלה באורגניזמים גדולים יותר.

נדידת לויקוציטים היא בעלת חשיבות עליונה לתגובות חיסוניות. תאי מערכת החיסון הם תאי נדידה טיפוסיים, המסוגלים להפליא לחצות רקמות וכלי דם ולחוש מגוון של רמזי הדרכה כימיים לנדוד לכיוון חיידקים או תאים מארחים אחרים בעלי חשיבות. הדרכה נכונה מסתמכת על ההכרה של כימותרפיה, ביניהם כימותרפיה מייצגת את הקטגוריה הבולטת ביותר1. כימותרפיה מזוהה על ידי קולטנים ספציפיים מאוד של חלבון 7 transmembrane G. עם כריכת כימוקין, קולטני כימוקין משנים קונפורמציה המובילה להפעלה של חלבוני G טרימריים הקשורים ואת הניתוק שלהם לתת-יחידות איתות פונקציונליות המקדמות שינויים ציטו-שלדיים ונדידה מכוונת1. משנית, קולטני chemokine הם זרחן, ושינוי זה מוביל desensitization למשוך, אשר יכול להיות ואחריו רגישות מחדש מהירה / מיחזור או השפלה תאית ורגולציה למטה מפני השטח של התא2. דינמיקה קולטן אלה להשפיע על משך ומינון של איתות שהתקבלו על ידי התאים אבל איך הם משפיעים על התנהגות הגירת לויקוציטים היה קשה להבהיר ב vivo.
מעקב אחר דינמיקת קולטנים בלוקוציטים חיים במערכות יונקים מסורתיות מתמודד עם מספר אתגרים. עבור מחקרים חיים, היתוך קולטן עם חלבונים פלואורסצנטיים חייב לבוא לידי ביטוי בתאים. זה מאתגר בלוקוציטים ראשוניים, במיוחד בנויטרופילים, ומחקרים עד כה השתמשו בקווי תאי נויטרופיל פונדקאיים כדי לבטא קולטני כימוקין 3,4. דור של מודלים עכבר מהונדסים, שבו לויקוציטים מבטאים קולטן פלואורסצנטי או קולטנים מוטנטיים עם פגמים מסחריים אינפורמטיביים 5,6, כרוך בהשקעה ניכרת של זמן ומשאבים. גם במקרים אלה, רזולוציית ההדמיה והניגודיות לדינמיקה של קולטן הדמיה בבעלי החיים יכולה להיות מוגבלת ומחקרים השתמשו באימונוהיסטוכימיה בקטעי רקמות קבועות5. בהתחשב באתגרים טכניים אלה, ההבנה שלנו כיצד דינמיקת קולטנים כימותרפיים משפיעה על התנהגות התאים בסביבת רקמות חיות מוגבלת כיום.
כאן אנו מספקים מתודולוגיה לניטור סחר בקולטן בנויטרופילים של דגי זברה. דגי זברה ניתנים למתיחה גנטית, כמו עכברים, אך טרנסגנזה היא יחסית פשוטה יותר באמצעות שימוש במערכות טרנספוזון יעילות ומניפולציה ישירה של זיגוטה7. הזחל השקוף מקובל באופן אידיאלי על הדמיה. הדינמיקה קולטן chemokine כבר דמיינו בתאי נבט קדמוניים ואת פרימוריום הקו לרוחב על ידי ביטוי של היתוך המתאים עם כתבים פלואורסצנטיים 8,9,10. זחלי דגי זברה מצוידים בנויטרופילים בוגרים בעלי תכונות גנטיות ותאיות שמורות מאוד ביחס לנויטרופילים של יונקים. דינמיקת איתות תת-תאית כגון דינמיקת שלד ציטוספת שלד ורגולטורים של קוטביות כבר דמיינו בתאים אלה על ידי הדור של קווים מהונדסים מתאימים 11,12,13. לאחרונה, דמיינו וניתחנו פונקציונלית דינמיקה של קולטן כימוקין בנויטרופילים במהלך תגובות דלקתיות לנזק לרקמות14. כאן, אנו מתארים את הדור של קווי כתב מהונדסים לאיתות כימוקין בנויטרופילים, הכנת עוברים להדמיה חיה, בדיקת פצעים לחקר איתות נויטרופילים והפרוטוקול לרכישה וניתוח של תמונות. אנו מספקים גם פרוטוקול צדדי כדי לבדוק תגובות קולטן chemokine ליגנדים מועמדים, אשר שימושי בעת ניסיון להקים דפוסי זיהוי ליגנד בקולטנים לא אופייניים. טכניקות אלה ניתן להשתמש בשילוב עם מניפולציות גנטיות נוספות, כגון עיכוב של ביטוי כימוקין אנדוגני או דור של קולטנים מוטנטיים עם סחר מושרה ליגנד שונה, כדי לחקור כיצד דינמיקת איתות ספציפית להשפיע על התנהגות לויקוציטים ב vivo. הקווים הטרנסגניים המבטאים קולטני chemokine מתויגים פלואורסצנטית יכולים לשמש גם ככתבים עבור שיפועים כימוקין אנדוגני, אשר אחרת קשה לזהות על ידי כתמי נוגדנים ישירים. המתודולוגיה המתוארת מספקת היקף להרחבת דור הכתבים לקולטנים אחרים של איתות חיסוני.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

הדרכת לויקוציטים על ידי שיפועים כימיים חיונית לתגובות חיסוניות. נויטרופילים הם התאים הראשונים שגויסו לאתרים של נזק לרקמות שבהם הם מבצעים פונקציות מיקרוביאלית קריטיות. הסחר שלהם בלוקים אלה מתוזמר על ידי כמה כימותרפיה דלקתית, כולל כימותרפיה. ברמה המולקולרית, איתות כימותרפי מוסדר על ידי סחר תאי של הקולטנים המתאימים. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד שינויים תת-תאיים בקולטני כימוקין משפיעים על דינמיקת נדידת לויקוציטים ברמת התא והרקמות. כאן אנו מתארים מתודולוגיה להדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקה קולטן כימוקין בנויטרופילים במהלך תגובות דלקתיות לנזק לרקמות. כלים אלה חשפו כי דיפרנציאל chemokine קולטן סחר נויטרופילים נויטרופילים מתאם קיבוץ נויטרופילים ופיזור באתרים של נזק לרקמות. יש לכך השלכות על הבנתנו כיצד תגובות דלקתיות נפתרות מעצמן. הכלים המתוארים יכולים לשמש להבנת דפוסי נדידת נויטרופילים במגוון הגדרות פיזיולוגיות ופתולוגיות וניתן להרחיב את המתודולוגיה לקולטנים אחרים של איתות.

פציעת סנפיר גחון מלווה בהתגייסות מהירה של נויטרופילים מה-CHT לסנפיר הגחון והתקבצות בשולי הפצע, תוך 30-60 דקות (איור 1). דמיינו את ההפצה של שני קולטני כימוקין, Cxcr1 ו- Cxcr2, המתבטאים על ידי נויטרופילים של דגי זברה24 ומכירים Cxcl8a ו- Cxcl8b14, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. יצרנו שני קווים מהונדסים מתאימים, Tg(lyz:Cxcr1-FT) ו- Tg(lyz:Cxcr2-FT), שבהם נויטרופילים מבטאים מבנה טיימר פלואורסצנטי (FT) של הקולטן, כלומר היתוך עם טנדם של sfGFP ו- tagRFP (איור 2 והפניה14). השימוש בשני הפלואורופורים נועד לאפשר ניטור של מגוון רחב של גורלות קולטנים ולספק הערכות של זמן תחלופת חלבונים בקרום הפלזמה, שכן קולטנים מסונתזים חדשים היו פלואורסצצים בירוק והופכים בהדרגה לאדומים ככל שהם מתבגרים 8,14. עם זאת, קולטנים אלה נמצאו בעלי מחזור מכונן מהיר בקרום פלזמה נויטרופיל וכי זמן המגורים היה קצר יותר מאשר זמן ההתבגרות של tagRFP, עם sfGFP מראה לוקליזציה ממברנה ו tagRFP מראה לוקליזציה של כלי רכב במצב יציב (וידאו משלים 1 ושופט14). לכן, התמקדנו בהפצה של sfGFP כדי לפקח על הפנמה הנגרמת על ידי ליגנד באתרים של נזק לרקמות. דפוס התפלגות הקולטן כונתה באמצעות מדד הניגודיות, המדווח על הבדלים בעוצמה בין הפיקסלים הסמוכים. הרציונל הוא שכאשר התפלגות הקולטן היא מממברנית וחלקה, ערך הניגודיות נמוך. כאשר התפלגות הקולטן היא שלפוחית ונקבה יותר, אז ערך הניגודיות גבוה (איור 3).
שיטה חלופית היא לכמת את היחס בין רמות הקולטן (עוצמת sfGFP) על פני רמות של סמן קרום בקרה למשל CFP ממברנה (mCFP) (איור 3). שתי השיטות יכולות לזהות הפנמת קולטן, כפי שצוין על ידי דפוס הפצת קולטן שלפוחית יותר ברחבי העולם בתא (ערך ניגודיות גבוה יותר) או רמות קולטן נמוכות יותר בקרום (יחס sfGFP / mCFP נמוך יותר). עם זאת, מדד הניגודיות יכול היה לזהות גם הפנמת קולטן באשכולות נויטרופילים בפצע, שבהם פילוח הממברנות היה פחות מדויק ולא ישים (איור 3). באמצעות מדד זה, הצלחנו לכמת את ההבדלים הנראים לעין בין סחר Cxcr1 ל- Cxcr2 בנויטרופילים בפצעים (איור 4 ווידאו משלים 2). Cxcr1-FT מופנם בתאים הממוקמים בפצע ואילו Cxcr2-FT נשאר מממברני בנויטרופילים בפצע (איור 4A-C, וידאו משלים 2 ווידאו משלים 3). דיכוי של Cxcl8a ו- Cxcl8b, באמצעות טיפול מורפולינו, השפיע באופן דיפרנציאלי על הפנמה Cxcr1-FT בפצעים (איור 4C,D). כדי לאמת עוד יותר כי Cxcr1-FT מגיב Cxcl8a, ביצענו בדיקות תגובה chemokine בעוברים מוקדמים. מצאנו כי Cxcr1-FT מופנם באופן משמעותי בעוברים שבהם Cxcl8a התבטא במשותף (איור 5). בסך הכל תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן לפרוס את השיטות המתוארות כדי למדוד הפנמה של קולטן המושרה על ידי כימוקין בנויטרופילים ולבסס את זהותו של ליגנד המתווך תופעות אלה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> איור 1: נדידת נויטרופילים לפצעי סנפיר גחון. (A) (משמאל) קריקטורה של 3 זחלים dpf המציג את המיקום של רקמת המטופויאטית caudal (CHT), מחזור ונוס (VC, כחול), סנפיר הגחון (VF) ואתר הפצע. (מימין) קריקטורה המתארת את אזור הפצע (W) עם נויטרופילים מקבל מגויס מן CHT ו קיבוץ על הפצע. מקלעת הוורידים (CVP) של רקמת ה- CHT מצוירת בכחול. (B) תמונת שדה בהירה (משמאל) והקרנה קונפוקלית (מימין) המציגה את פצע הסנפיר הגחוני ואת התפלגות הנויטרופילים בזחלי Tg(mpx:GFP) בשעה 2 שעות לאחר הפציעה. קווים מקווקווים מציגים קווי מתאר של VF ו- CHT. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. תמונה מצוירת ופלואורסצנטית שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> איור 2: הדמיה חיה של סחר בקולטן כימוקין בנויטרופילים. (A) מבנים המשמשים לביטוי מהונדס ספציפי לנויטרופילים של Cxcr1-FT (טיימר פלואורסצנטי) ו- Cxcr2-FT. תחזיות קונפוקליות של נויטרופילים בראש זחל מהונדס 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), למעלה; Tg(lyz:Cxcr2-FT), למטה) המציג ערוצי tRFP (מגנטה) ו- sfGFP (ירוק). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (ב) ערכה אנטומית של זחל 3 dpf כמו באיור 1A. מתחת לזחל יש תוכניות המתארות את אזור הפצע (W) עם נויטרופילים שמתגייסים מה- CHT (למעלה) או מבצעים כימוטקסיס עם הכניסה לסנפיר הגחון (למטה). ריבוע מקווקו מציין אזור בתמונה בתצלומי בזק מימין. (C) נויטרופילים בזחלי Tg(lyz:Cxcr1-FT) (מוצג sfGFP) בעת גיוס מ- CHT (לוחות עליונים) או כימוטקסיס לכיוון הפצע (לוחות תחתון). החצים מציגים את אותם תאים לאורך זמן. נקודות זמן בתמונה הימנית הן דקות שחלפו לאחר התמונה משמאל. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (D) ייצוג סכמטי של גישה ניסיונית להדמיה חיה של סחר בקולטן כימוקין. לוחות A-C ששונו מ- ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> איור 3: דוגמאות לכימות של דינמיקת קולטן. נויטרופילים בודדים (כחולים) או מקובצים באשכולות (ירוק) בפצעים או נויטרופילים לא מגויסים ב- CHT (אדום, כתום) חולקו ונותחו בשיטות שונות כדי להשוות תוצאות. אותם תאים לדוגמה המוצגים נותחו בשתי שיטות כדי לקשר את מה שנראה בתמונה עם טווח הערכים שחולצו. (א) פני השטח של התאים לדוגמה שנבחרו היו מפולחים בהתבסס על הגדרת מתאר בערוץ sfGFP. (B) ניגודיות חושבה מהתאים לדוגמה המוצגים ב- A. (C) הממברנה של התאים לדוגמה שנבחרו היו מפולחים בהתבסס על הגדרת מתאר בערוץ CFP. לאחר מכן בוצע ניתוח יחסי של sfGFP/CFP. (ד) היחס בין sfGFP/CFP חושב על התאים לדוגמה המוצגים ב- C. קווי שגיאה מייצגים S.E.M. מתאים בודדים, במקרים של n>1, הערכים כאן לא שימשו לניתוח סטטיסטי אלא רק כדי להדגים מדידות שהושגו בשיטות הכימות השונות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. איור שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> איור 4: דינמיקה דיפרנציאלית של Cxcr1 ו- Cxcr2 בתגובה לפציעה. (A) הקרנה קונפוקלית של נויטרופילים ב Tg(lyz:Cxcr1-FT) או Tg(lyz:Cxcr2-FT) זחלים בפצע ב 80 דקות לאחר פציעה (ערוץ sfGFP מוצג). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.  (B) נויטרופיל Cxcr1-FT מוגדל (משמאל) ו- Cxcr2-FT (מימין) בפצע. קולטן ירוק מוצג באפור. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (C) ניגודיות מנורמלת (ניגודיות לנויטרופיל בודד מנורמלת לניגודיות הממוצעת של תאים שאינם מגויסים ב- CHT). cxcl8a מתייחס הזרקה של חסימת חיבור יחד עם מורפולינו חוסם תרגום עבור cxcl8a. cxcl8b מתייחס הזרקה עם מורפולינו חוסם חיבור עבור cxcl8b. עבור Tg(lyz:Cxcr1-FT): n = 24 תאים (CHT), n = 47 תאים (פצע) מ 8 זחלים. עבור Tg(lyz:Cxcr1-FT) עם מורפולינוס: n = 28 תאים (Cxcl8a-MO) מ 5 זחלים, n = 16 תאים (Cxcl8b-MO) מ 5 זחלים. עבור Tg(lyz:Cxcr2-FT): n = 10 תאים (CHT) ו n = 20 תאים (פצע) מ 3 זחלים. הנתונים אוגדו מזחלים עצמאיים שנרכשו ב-1-5 מפגשי הדמיה. מבחן קרוסקל-וואליס עם מבחן ההשוואות המרובה של דאן עבור Tg(lyz:Cxcr1-FT), מבחן מאן-ויטני דו-זנבי לא מזווג עבור Tg (lyz:Cxcr2-FT). (D) הקרנה קונפוקלית של נויטרופילים ב- Tg (lyz:Cxcr1-FT) זחלים מהונדסים שטופלו ב - cxcl8a morpholino (MO) (משמאל) ו - cxcl8b MO (מימין) מגיבים לפצעי סנפיר (ערוץ sfGFP המוצג בירוק). תמונה שצולמה בנקודות זמן של הצטברות נויטרופילים שווה ערך (85 דקות לאחר פציעה בתמונה השמאלית ו -45 דקות לאחר פציעה בתמונה הימנית). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. איור שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> איור 5: בדיקת תגובה של צ'מוקין בעוברים מוקדמים. פרוסות קונפוקל סריקת לייזר של עוברים gastrulating מראה ביטוי והפצה של Cxcr1-FT. 100 pg של Cxcr1-FT mRNA הוזרק לתוך אחד ביצי תא שלב עם או בלי 150 pg Cxcl8a mRNA. קולטנים ירוקים ואדומים מוצגים בערוצים נפרדים. סמן CFP קרום בקרה (mCFP) מוצג בערוץ ציאן. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. איור שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרט משלים 1: נויטרופילים מהונדסים בראש זחל Tg(lyz:Cxcr1-FT) (משמאל) ו- Tg(lyz:Cxcr2-FT) (מימין) ב-3 dpf. sfGFP(ירוק), tagRFP (מגנטה). מרווח המסגרות הוא 30 שניות וקצב הפריימים הוא 5 fps. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. מקורו של הסרטון הוא בפסוק 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.</a>
סרט משלים 2: נויטרופילים ב- Tg(lyz:Cxcr1-FT) (משמאל) ו- Tg(lyz:Cxcr2-FT) (מימין) זחלים מהונדסים המגיבים לפצעי סנפיר. הסרט מתחיל תוך 10 דקות לאחר הפציעה ונמשך 60 דקות. sfGFP (ירוק), tagRFP (מגנטה). מרווח המסגרות הוא 30 שניות וקצב הפריימים הוא 10 fps. CHT = רקמת המטופויאטית caudal. VF = סנפיר גחון. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. מקורו של הסרטון הוא בפסוק 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.</a>
סרט משלים 3. דוגמאות נוספות של נויטרופילים מ זחלים מהונדסים Tg(lyz:Cxcr1- FT) מהונדסים (זחלים שונים מאלה המוצגים בסרטון 2), שנרכשו ברזולוציה גבוהה יותר, המציגים הפנמת קולטן (ערוץ sfGFP המוצג בירוק) עם התגייסות ב- CHT או עם הכניסה וכימוטקסיס בסנפיר הגחוני. מרווח המסגרות הוא 30 שניות וקצב הפריימים הוא 2 fps. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. מקורו של הסרטון הוא בפסוק 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.</a>
קובץ משלים 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לביצוע הדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקת קולטן כימותרפיה בנויטרופילים של דגי זברה

הדמיה חיה של קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה במהלך תגובות לפצעים

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K Views.  University of Cambridge. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לביצוע הדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקת קולטן כימותרפיה בנויטרופילים של דגי זברה

Video: Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

הדמיה חיה של קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה במהלך תגובות לפצעים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video