בתחום ההדמיה vivo בוצע באמצעות משותפים המשאבים IVIS באוניברסיטת קולורדו במרכז הסרטן (נתמך על ידי P30-CA046934 מענק). cytometry הזרימה בוצע בcytometry הזרימה משותף המשאבים, אוניברסיטת קולורדו במרכז הסרטן (נתמך על ידי P30CA046934 מענק). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (RO1CA137078 לDKG). ABLS הוא עמית של תכנית הפיתוח של מדען הילדים, נתמכת על ידי מענקים מהאקדמיה האמריקנית לרפואת הילדים, האגודה האמריקנית לרפואת הילדים, ומכון יוניס קנדי ​​שרייבר הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם (K12-HD000850).

כל הניסויים מעורבים חיות בעקבות תקני הרגולציה אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדי קולורדו. הפרוטוקול הפגין אושר על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדי קולורדו. 1. Phospho חלבון כתם המערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת lysates <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורות תאים המבטאות את תרבות טירוזין קינאז רצפטור של עניין. קציר תאים וצלחת 3-5 x 10 6 תאים / מדגם ב400 מדיום גידול μl בצלחת תרבית רקמה 48 היטב. לדגור על 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 2-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון 5x TKI 100 μl במדיום גידול ודגירה של 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה עם 50 HEPES מ&quot;מ (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) גליצרול, 1% (v / v) טריטון X-100, ומעכבי פרוטאז. אם תרבויות לא יטופלו עם pervanadate לפני הקציר, להוסיף מעכבי phosphatase (orthova נתרן 1 מ&quot;מmolybdate nadate ו0.1 מ&quot;מ נתרן) למאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן pervanadate (PV) פתרון מעכב phosphatase מייד לפני השימוש. הכן פתרון 0.3% של מי חמצן (זהירות) בפוספט שנאגרו מלוח קר (PBS) בצינור כהה על קרח (1:100 דילול של מניות פתרון 30%). מרתיחים aliquot של 0.2 M orthovanadate נתרן פתרון מניות (OV, זהירות) במשך 5 דקות. לדלל 1:10 ב PBS לעשות 20 פתרון מ&quot;מ OV בטמפרטורת חדר (RT). מערבבים 0.3% מי חמצן ו20 מ&quot;מ OV 1:1 ו דגירה בחושך ב RT עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל PV לבינוני מלא (60 PV μl + 940 בינוני μl). הוספה של PV בדילול מלא / 100 μl כן. לדגור על 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 3 דקות ולאחר מכן למקם את הצלחת על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים בצינורות microfuge קרים ב2,500 סל&quot;ד במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ותאי resuspend ב 120 μl של חיץ תמוגה. לדגור על קרח במשך 15 דקות. להבהיר את lysate בmicrofuge קרים ב6,000 סל&quot;ד למשך 3 דקות. העבר supernatant לצינור קר טרי. חנות ב -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים sepharose G חלבון בmicrofuge ב1,000 סל&quot;ד דקות 1. הסר supernatant ולשטוף את חרוזים 2x עם 1 מיליליטר PBS הקר. הוסף נפח שווה של PBS לעשות slurry 50%. הוספת נוגדן ראשוני ו20 μl חרוזים G חלבון 50% לכל דגימה. דגירה עבור שעה 2 - O / N ב 4 ° C על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דופק את חרוזים בmicrofuge קרים ב9,000 סל&quot;ד. הסר supernatant ולשטוף את חרוזים 2x עם 150 μl מאגר תמוגה הקרה. ספין בmicrofuge הקרים ב1,000 סל&quot;ד דקות 1. הסר supernatant וגלול resuspend ב 20 לדוגמא 2X SDS μl הצפת עם 2-mercaptoethanol (זהירות). השתמש באופן מיידי או בחנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מרתיחים במשך 5 דקות ולרוץ על ג&#39;ל טריס-גליצין-SDS. מעביר את החלבונים לממברנה ניטרוצלולוזה ולזהות phospho-חלבון על ידי כתם מערבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הכתם עם מים ולאחר מכן לדגור ב2% SDS, 62.5 מ&quot;מ טריס (pH 6.8), 0.M 1 β-mercaptoethanol (זהירות) ל30 דקות ב50 ° C. יש לשטוף 2x עם מים ולאחר מכן לשטוף ל60-90 דקות ב5-6 שינויים של TBS-T כדי להסיר הפשטת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי מוחלט של חלבון על ידי כתם מערבי. </li></ol></li></ol> 2. Assay methylcellulose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 4 מיליליטר של מדיום בסיס האנושי methylcellulose ל50 מיליליטר צינורות חרוטי באמצעות מחט סטרילית סוף גדול נשא בוטה. (הערה:. ניתן aliquoted Methylcellulose ומאוחסן ב -20 ° C. הפשירו ב RT O / N לפני השימוש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 10x TKI או רכב במדיום גידול ל4 מיליליטר של methylcellulose ותערובת מערבולת 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ותאי ספירה. הכן את ההשעיה תא במדיום גידול בריכוז, שהוא גבוה יותר מאשר 10x ריכוז התא הסופי. הוסף השעיה תא 500 μl לתערובת methylcellulose. ורטקס עבור 10 שניות ולתת לשבת במשך 10 דקות כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את 4 מיליליטר של תערובת methylcellulose באמצעות מזרק 5 מיליליטר וlarg סטריליהדואר נשא מחט הסוף בוטה. הימנע מעריכת בועות. לוותר על 1 מיליליטר של תערובת methylcellulose למרכז שלוש צלחות תרבית רקמת 35 מ&quot;מ. לערבל את המנות עד שהתחתית מכוסה לחלוטין עם methylcellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת methylcellulose, להכין צלחת תרבות 10 סנטימטר סטרילי רקמות עם שתי צלחות נוספות 35 מ&quot;מ רקמת תרבות מלאים במים סטריליים כדי להבטיח סביבה לחה. תרבויות מקום במים במעייל החממה ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 10-14 יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות לאחר 1-2 שבועות. מושבות צריכים להיות יותר מ 20 תאים ולא חופפים. ניתן לספור מושבות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בבמה מיקרוסקופ עם רשת או באמצעות דלפק מושבה אוטומטית. שינויים בגודל מושבה או במורפולוגיה בתגובה לטיפול עם TKI גם צריכים להיות מוערכים. כדי לשפר את זיהוי על ידי מונה מושבה, מושבות כתם על ידי הוספת 60-100 μl של (3 - (4,5-דימתיל-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium סול ברומידution (MTT, 5 מ&quot;ג / מיליליטר H 2 O, החנות ב -20 ° C, להגן מפני אור, זהירות) טיפה חכמה על פני כל צלחת ודוגר במשך 8 שעות ב 37 ° C ב 5% CO 2. </li></ol> 3. רך אגר Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1% אגר אצילי לשכבת תחתונה, 0.7% אגר אצילי לשכבת עליונה ו2x מדיום גידול. לאזן מדיום גידול 2x באמבט מים 42 מעלות צלזיוס. מחממים 1% ו0.7% אגר אצילי במיקרוגל (כ 1 מיליליטר min/100) ולאזן באמבט מים 42 מעלות צלזיוס. לערבב חלקים שווים של אגר 1% ובינוניים 2x ובנפרד אגר 0.7% ובינוניים 2x ב50 conicals מיליליטר. תכנית 10 מיליליטר של תערובת / צלחת שש היטב אגר רכה לכל שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות תרבית רקמת 6 גם לייבל. ממלא כל היטב עם 1.5 מיליליטר 1% תערובת אגר רכה. למנוע בועות בציפוי. צלחות יבשים עם מכסים מעל במכסת מנוע סטרילית ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים. הכן את ההשעיה תא במדיום גידול בריכוז, שהוא גבוה יותר מאשר 500x concentrati התא הסופיהלאה. הוסף השעיה תא ל0.7% תערובת אגר, מערבב היטב ולוותר 1.5 מיליליטר של תערובת התאים אגר על החלק העליון של השכבה אגר 1%. בואו לחזק את השכבה העליונה ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום גידול המכיל 1x TKI או שליטה ברכב. הוסף 2 מיליליטר של מדיום עם ריכוז רצוי של TKI על גבי השכבה אגר העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרבויות ל10 ימים ב 37 ° C ב 5% CO 2. להסיר ולהחליף את המדיום שכיסה כל 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מושבות הם גלויים לעין בלתי מזוינת, הבינוני לשאוב כיסה ולהוסיף פתרון 200 μl ניטרו-tetrazolium הכחול (1 מ&quot;ג / מיליליטר NBT בH 2 O, לאחסן ב 4 ° C, להגן מפני אור, זהירות). לחזור חממה ל24-48 שעה. מעבר ל4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני הספירה. ניתן לאחסן את הצלחות ויטראז על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד. ספירת מושבות באמצעות מיקרוסקופ או דלפק מושבה אוטומטית. </li></ol> 4. הערכה של עיכוב phospho חלבון בvivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף גאמות גוברת בשלב יומן על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה בראש הטבלה ב1,500 סל&quot;ד במשך 5 דקות. לשטוף את התאים פעם עם PBS סטרילי ו resuspend ב PBS בריכוז מתאים (בדרך כלל 1-5 x 10 7 תאים / מיליליטר). תאים להשתלות בהיקף של 100 μl ל6-12 עכברי NSG ישנים שבוע על ידי הזרקה תוך ורידית לזנב וריד באמצעות מזרק אינסולין 28 G. מניחים את החיה בעוצר, מחמם את הזנב בכוס של מים חמים כדי להרחיב את הוורידים, ולנקות את הזנב עם ספוגית כלורהקסידין לפני הזריקה. לאחר הזרקה, יפעיל לחץ על אזור ההזרקה באמצעות גזה סטרילית עד שדימום ייפסק. השתלה לפחות 3 חיות / קבוצה. לשמור על העכברים במים המכילים 1 מ&quot;ג / סולפט gentamycin מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבע עשרה ימים לאחר השתלה, טיפול בבעלים חיים עם TKI או כלי רכב בלבד, ודגימות קציר לניתוח של עיכוב היעד. שוקלים בעלי חיים ולטפל במינון מתאים (מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף) של TKI או רכב. לנהל טיפול בנפח של 5 מיליליטר / kמשקל גוף גרם בזריקה (IP) intraperitoneal או 10 מיליליטר / קילוגרם משקל גוף על ידי gavage האוראלי. להזרקת ה-IP, לרסן את העכבר באופן ידני ולהזריק ברבע הימני התחתון של הבטן באמצעות מחט G 29. לgavage האוראלי, לרסן את העכבר באופן ידני ולהחזיק את בעלי החיים זקופים. מניחים את צינור gavage בפה על הלשון ולחלק האחורי של הפה. להפעיל לחץ קל כדי להעביר את הצינור דרך הוושט ולתוך הקיבה. לוחץ על המתג המזרק כדי לנהל טיפול. אם הבוכנה לא לדכא בקלות את מחט gavage יש להסיר ומיקומו. הכן את הניסוחים TKI מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם טיפול pervanadate הוא רצוי, להכין פתרון PV 20 דקות לפני הקציר כפי שתואר לעיל (שלב 1.1.4) ולדלל לבינוני עם 1 מיקרומטר MgCl 2 ו100 U / ml DNase (120 PV μl + 880 בינוני μl). הערה: PV הוא יציב במשך שעה לפחות 1 לאחר דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את בעלי חיים על ידי CO 2 הרדמה בapזמן propriate (ים) שלאחר טיפול. לנתח עצמות ירך על ידי הסרת פרווה, עור ושרירים מהרגל כולה, כך שהעצמות חשופות לחלוטין. הסר את עצמות הירך על ידי גזירה עם מספריים לנתח ממש מתחת למפרק הירך ושוב מעל למפרק הברך. מעביר לצלחת פטרי ומח עצם מיושר עם 1 מיליליטר PBS הקר או פתרון PV מדולל באמצעות מזרק ומחט G 27. אם טיפול עם PV, לדגור על RT בחושך במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן lysates ולנתח רמות phospho חלבון וסך הכל החלבון כפי שצוין לעיל (צעדים 1.1.6-1.2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת phospho חלבון יחסית ורמות כולל של החלבון עבור כל דגימה באמצעות צפיפות. חישוב יחסי phospho-protein/total-protein לערך phospho-protein/total-protein הממוצע לבעלי חיים שטופלו ברכב. </li></ol> 5. הערכה של פעילות נגד לוקמיה של TKIs בכל דגמי xenograft <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, לחשוף את העכברים ל200 cGy של קרינה בirradiator RS-2000 prio יום אחדr להשתלה. עכברי השתלה עם שורות תאים לוקמיה כפי שתואר לעיל (שלב 4.1). השתלת עכברים לפחות 6 לכל קבוצה. זהה את העכברים על ידי ניקוב אוזן. לחלופין, טוש שחור יכול לשמש כדי לזהות עכברים עם סימני חשיש על זנבותיהם. להוסיף העשרה לכלובים כדי להפחית את הפוטנציאל לתוקפנות בן זוג בכלוב במהלך תקופת המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בעכברים עם TKI או רכב רק כפי שתוארו לעיל (שלב 4.2). לנטר את מצב בריאותם של עכברים יומיים באמצעות בדיקה גופנית ונחישות במשקל. סימפטומים צפויים של לוקמיה (הקטין את רמת פעילות, ירידה במשקל, שיתוק גפיים האחורי, ודלקות עיניים). ירידה במשקל יותר מ -10% -15% מזוהים בדרך כלל עם מותו של העכבר בתוך יומיים, והוא בדרך כלל נקודות קצה פונדקאיות למוות בהתאם לדרישות IACUC סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על קליטתם והתפתחות של לוקמיה באמצעות מערכת vivo בפליטת אור הדמיה עד 2x שבועי. הכן פתרון 200x D-וציפרין המניה (30 מ&quot;ג / מיליליטר) בsteriמים le. מערבבים בעדינות על ידי היפוך עד D-וציפרין הוא נמס לגמרי. השתמש באופן מיידי, או aliquot והקפאה ב -20 ° C. לפני ההדמיה באמצעות vivo מערכת הדמיה פליטת אור ב, להפשיר aliquots של D-luciferin ב RT ולדלל 1:02 ב PBS לריכוז סופי של 15 מ&quot;ג / מיליליטר ולסנן לעקר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים לפני ההדמיה עם 1.5% isoflurane בשאיפה בחמצן. לפקח הרדמה מספיק, מאופיינת בהרפיית שרירים, אובדן התנועה, ואובדן של תגובה לגירוי הבוהן קמצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני ההדמיה, לנהל 150 מ&quot;ג / D-וציפרין קילוגרם משקל גוף על ידי הזרקת ה-IP (10 μl של 15 מ&quot;ג / מיליליטר וציפרין / גרם של משקל גוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת הדמיה פליטת אור in vivo ל2 סדרה של תמונות עם חשיפות רציפה 30, 60 ו90 שניות ותמונה סופית עם חשיפת שניות 120 ללכוד. לאחר הדמיה, להחזיר עכברים לכלובים ולפקח על התאוששות מהרדמה. בהתאםעוצמת פליטת אור, יכולים להיות מגוונים זמני חשיפה. זמני חשיפה אופטימליים צריכים להיות קבועים מראש למודל נתון וכל זמן עולה בקנה אחד כזה שעוצמות האות לנקודות זמן בודדות הן השוואה על פני כל המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת עוצמת פליטת אור לכל עכבר באמצעות תמונת Living תוכנת רכישה וניתוח 3.2. לקבוע ערכי שטף כולל שנמדדו בפוטונים / שני על ידי ציור אזורים של עניין (ROI) בגודל זהה על כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברים על ידי CO 2 חשיפה ונקע בצוואר הרחם אם ננטש, מציג שיתוק, במקרה של יותר מ 15% ירידה במשקל, או בסוף המחקר. לנתח עכברים ותצפיות שיא (למשל הגדלה של בלוטות לטחול, בכבד, או הלימפה; חיוור מח עצם). לנתח עצמות ירך ומח עצם לשטוף עם PBS הקר באמצעות מחט G 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים בmicrofuge ב2,500 סל&quot;ד במשך 5 דקות. Resuspend תאי PBS המכילים 2% FBS ו דגירה במשך 5 דקות ב RT.איסוף תאים ואת כתם עם 20 מ&quot;ג / מיליליטר DAPI (dihydrochloride 4,6-diamidino-2-phenylindole, 1:1,000) וα-hCD45 FITC-מצומדת (1:100) או נוגדן שליטת אלוטיפ 1 העכבר IgG (1:100) . להעריך engraftment לוקמיה באמצעות cytometry זרימה. שער על האוכלוסייה בת קיימא (DAPI שלילי) ולקבוע אחוז CD45 + התאים (תקיעות מח עצם%). </li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics.+2010.">Cancer Statistics. 2010.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li><li>Kaatsch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+childhood+cancer.">Epidemiology of childhood cancer.</a> Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).</li><li>Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia:+where+are+we+going+and+how+do+we+get+there?.">Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?.</a> Blood. 120, 1165-1174 (2012).</li><li>Forman, S., Rowe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myth+of+the+second+remission+of+acute+leukemia+in+the+adult.">The myth of the second remission of acute leukemia in the adult.</a> Blood. 121, 1077-1082 (2013).</li><li>Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitors+in+acute+and+chronic+leukemias.">Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias.</a> Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).</li><li>Mikalsen, S., Kaalhus, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+pervanadate+and+permolybdate.+Connexin43,+phosphatase+inhibition,+and+thiol+reactivity+as+model+systems.">Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems.</a> J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).</li><li>Zips, D., Thames, H., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+anticancer+agents:+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation.</a> In Vivo. 19, 1-7 (2005).</li><li>Christoph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+leukemia+cell+lines+in+vitro+and+in+mouse+xenografts:+Effects+of+monoclonal+and+polyclonal+cell+populations+on+intensity+and+kinetics+of+photon+emission.">Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission.</a> J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).</li><li>Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+measurements+of+human+tumour+cells+by+soft+agar+assays+are+influenced+by+the+culture+conditions.">Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).</li><li>Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+soft-agar+methods+for+assaying+chemosensitivity+of+human+tumours+in+vitro:+malignant+melanomas.">Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas.</a> Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).</li><li>Rudin, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+drug+discovery+and+development.">Molecular imaging in drug discovery and development.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).</li><li>Barrett, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescent+imaging+of+primary+patient+acute+lymphoblastic+leukemia:+a+strategy+for+preclinical+modeling.">Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling.</a> Blood. 118, 112-117 (2011).</li><li>Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה של מעכבי טירוזין קינאז רומן בטיפול בלוקמיה חריפה. שימוש בגישה זו, פעילויות ביוכימיות ונגד לוקמיה מוערכות ראשונה במבחנים מבוססי תאים במבחנה ולאחר מכן במודלי xenograft in vivo. ניתוח immunoblot נוצל בהצלחה כדי להדגים עיכוב של טירוזין ...

לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) היא המחלה ממארת השכיחה ביותר בקרב ילדי 1,2. שיעור ההישרדות הכללי עבור כל ילדים B-שושלת (B-ALL) הוא כ 85%, אך תת ספציפיים ביולוגיים, כולל T-שושלת ALL (T-ALL), יש לי הפרוגנוזה עדיין עני יותר אפילו עם פרוטוקולים טיפוליים הנוכחיים. טיפול נוסף של ALL הישנות עדיין מהווה אתגר 3. למרות שהרוב המכריע של חולים מבוגרים עם לוקמיה חריפה להשיג הפוגה עם כימותרפיה-up מול, חולים רבים עדיין סובלים הישנות 4. משטרים כימותרפיות הנוכחיים בטיפול בלוקמיה חריפה ידועים כגורמים לתופעות לוואי לטווח קצר וארוך הקשורים ברעילות. לכן, טיפולים פחות רעילים שמתמקדים בתאי סרטן עם השפעה מינימאלית על רקמות נורמליות יש צורך במידה רבה. בשנים האחרונות, הושם דגש על הפיתוח של רומן, סוכנים מולקולריים ממוקדים עם סגוליות לתאי סרטן, לעתים קרובות תוך שימוש בכימיה איטרטיביכדי לייצר חומרים פעילים רבים אשר חייבים לאחר מכן להשוות ועדיף 5. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של TKIs לטיפול בלוקמיה חריפה, שניתן להשתמש בם לצורך ההערכה של תרכובת בודדת או להשוואה ישירה של תרכובות מרובות על מנת להקל על פיתוח תרופה. השיטה המוצגת כאן מורכבת מארבעה שלבים. ראשון ביוכימי (1) ונגד לוקמיה (2) פעילות של המתחם (ים) מוערכות בתרבית תאים, ולאחר מכן עיכוב של היעד אישר בדגמים (3) בעלי חיים, ויעילות לבסוף טיפולית של TKI (ים) נקבע במודלי xenograft לוקמיה orthotopic (4). למחקרים אלה, חשוב לבחור שורות תאים רלוונטיות, שהם נציגים של תת הביולוגיים הנפוצים ביותר. שורות תאים יש לבחור, ששניהם, מבטאים את היעד של עניין ואין להם את היעד של ריבית, כדי לבדוק האם הם med השפעות ביולוגיותiated על ידי עיכוב של היעד. זה רלוונטי במיוחד לפיתוח של מעכבי מולקולה קטנים, שיש לי מחוץ יעד תופעות שעשויות להיות חשוב לפעילות אנטי סרטניים. כמו כן יש לבחור שורת תאים שתלויה ביעד להשפעות פונקציונליות, כגון ריבוי או הישרדות. מחקרים ראשוניים אימות היעד (מחוץ להיקף של מאמר זה) באמצעות התערבות RNA או באמצעים ספציפיים אחרים כדי לעכב את היעד יכולים לשמש כדי לזהות שורות תאי יעד תלוי. כמו כן, רצוי לבחור שורות תאים שיכולים ליצור xenografts העכברית, כך שתוצאות תרבית תאים יכולות להיות באופן ישיר יותר בתרגום לin vivo ניסויים. להערכה של פעילות ביוכימית בתיווכו של TKIs בתאי סרטן דם, ירידה בזרחון הקולטן יכולה לשמש כאינדיקציה לעיכוב היעד. יכולים להיות מועסקים מבחני ניתוח כתם מערבי או ELISA, בהתאם לזמינות והספציפיות של נוגדנים.אם נוגדנים עם סגוליות מספיק ליעד זמינים, מבחני ELISA עדיפים כפי שהם יותר כמוני ויעילים. במקרים בהם נוגדנים עם סגוליות מספיק עבור ELISA אינם זמינים, ניתוח כתם מערבי עשוי להיות נחוץ. במקרה זה, immunoprecipitation של כמות גדולה של lysate יכולה להיות שימושית לזיהוי של מטרות שנמצאות בשפע נמוך. גישה זו היא רלוונטית במיוחד למדידת phospho-חלבונים, אשר עשוי להיות זמן מחצית חיים קצרים, כדי לאפשר לשינויים מהירים באיתות בתגובה לגירויים סביבתיים. כמה חלבוני פוספורילציה הם יציבים מאוד, סביר להניח כתוצאה מהיווצרות מורכבת עם phosphatases. לגילוי חזק ועקבי של חלבוני פוספורילציה האלה, זה יכול להיות גם אפשרי לטיפול בתאים עם pervanadate, מעכב החלבון phosphatase-טירוזין בלתי הפיך 6, כדי לייצב את phospho החלבון לפני הכנת lysates תא כולו. אללקבוע אם פעילות ביוכימית תוצאות בהשפעות אנטי סרטניים, ניתן לנטר תהליכים ביולוגיים היעד תלוי בניסויים מבוססי תאים. לשורות תאי סרטן דם, פעילות אנטי לוקמיה בתיווכו של TKIs ניתן להעריך באמצעות מבחני הקמת המושבה בוצעו בmethylcellulose או רך אגר 7. אגר רך עשויים להיות מועדף כמו זה הוא מדיום מוצק כי הוא יותר נוח למניפולציה אם טיפול חוזר ונשנה עם TKI הוא הכרחי. בעוד רבים שורות תאים לוקמיה myloid (AML) חריפות תהווה מושבות באגר רך, רוב כל שורות תאים רק ליצור מושבות בmethylcellulose, שהיא מדיום מוצק למחצה. למרות שניתן לרענן בינוני ו / או TKIs בתרבויות methylcellulose, ניתן להשתמש בם רק בנפחים קטנים ובתדירות מוגבלת. כמו כן, קשה יותר כדי להכתים מושבות מבלי לשבש אותם בmethylcellulose. מחקרים ראשוניים צריכים להגדיר את היכולת של שורות תאים מתאימות כדי ליצור מושבות בmethylcellulose ו / או אגר ולא רכיםהוא צפיפות אופטימלית של תאים בתרבית כך שהמושבות הן שאינן חופפות ובמספר מספיק כדי להשיג סטטיסטי הנתונים רלוונטיים (בדרך כלל 50-200 מושבות בכל צלחת 35 מ&quot;מ). בעוד שבמבחני חוץ גופית הם חזקים וחסכוניים, ויש פחות השלכות אתיות מאשר ניסויים בבעלי חיים כולו, קידום של תרכובות טיפוליות דורשת הוכחת היעילות ובטיחות במודלים של בעלי חיים. במחקרי vivo, שורות תאים לוקמיה חריפות אנושיות ניתן להשתיל orthotopically לSCID NOD.Cg-Prkdc אני l2rg tm1Wjl / SzJ עכברים (NSG) וTKIs יכולים להינתן בקלות על ידי הזרקה או gavage האוראלי. שורות תאים מסוימות עשויות לדרוש חשיפה של עכברי NSG למנת שורה תלויה נמוכה של קרינה סלולרי על מנת שxenografts להקים, ובמקרה הזה עכברים לא יכולים לסבול gavage האוראלי ללא תקופת ההחלמה 5-10 יום שלאחר הקרנה. כתב יד זה מתאר דור של B-ALL ו-T-ALL xenografts באמצעותקווי תאים ספציפיים (697 וJurkat) כדוגמאות אבל xenografts ניתן להקים בעכברי NSG תוך שימוש במגוון רחב של שורות תאים. במקרה ששורות תאים אחרים הן ישימות יותר, הדרישה להקרנה, מספר אופטימלי של תאים להשתלה, ועיתוי של תחילת מחלה והתקדמות צריכה להיקבע באופן ניסיוני. באופן אידיאלי, דגמים אלה יהיו penetrance מלאה (כל בעל חיים המושתלים מתפתח לוקמיה), קינטיקה העקבית (לוקמיה מתקדמת באופן דומה בכל בעלי החיים), וחלון טיפול סביר (באופן אידיאלי 20-30 ימים שבין תחילת טיפול וההסרה ממחקר בשל מחלה) . מספר התאים המושתלים יכול להיות מוגבר כדי לשפר penetrance ועקביות קינטית או ירד כדי לשפר את חלון הטיפול במידת צורך. כדי לקבוע אם TKIs לתווך עיכוב יעד in vivo, דגימות שנאספו מעכברים עם xenografts לוקמיה לאחר טיפול עם TKI או כלי רכב בלבד. באופן אידיאלי, במינוןלוח הזמנים של ד של ממשל לניסויים אלה מודרכים על ידי מחקרי פרמקוקינטיקה, אשר לעתים קרובות יכול להיות מבוצעים על ידי מעבדות מסחריות ומחוץ להיקף של מאמר זה. אם הנתונים הפרמקוקינטי זמינים, הריכוז של תרכובת הנדרשת לעיכוב יעיל יעד בתרבית תאים והריכוז בסרום המרבי הבאים מנה בודדת של TKI ניתן להשתמש כדי להגדיר את המינון ההתחלתי למחקרים בבעלי חיים. מחקרי פרמקוקינטיקה גם יכולים ליידע את העיתוי של איסוף דגימה לאחר טיפול ללימודי pharmacodynamic והתוואי של ממשל. עיכוב של היעד ניתן להעריך בכל איבר מושפע אך רקמות שנאספות בקלות ומעובד עדיפות. שורות תאים לוקמיה חריפות ביותר להקים בכבד, מח עצם, במערכת העצבים המרכזית הטחול, דם היקפי, ואף האיברים הספציפיים השפיעו ואת מידת קליטתם באיברים אלה משתנה בין דגמים. הפרוטוקול המובא כאן מעריך phosphעיכוב o-חלבון במח עצם באמצעות ניתוח כתם מערבי, אבל איברים מוצקים עשוי להיות קל יותר למסוק באופן עקבי ודורש עיבוד מינימאלי או לא לפני ההקפאה, ומאפשר פחות הזדמנויות לשפלה של phospho-חלבונים במהלך איסוף דגימה ועיבוד. גם אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש כדי להעריך את גידולים או איברים מושפעים מלוקמיה מוצקים. לבסוף, היעילות הטיפולית של TKI (ים) נקבעה במודלי xenograft לוקמיה orthotopic. למחקרים אלה, התזמון של תחילת טיפול יכול להיות מגוון, כך שהמחלה היא מבוססת יותר או פחות. טיפול עשוי להתחיל מייד לאחר השתלה למחקרים ראשוניים ולאחר מכן יעוכב במחקרים הבאים עד נטל מחלה משמעותית מזוהה משוער מודל טיפול אבחון באופן הדוק יותר. באופן אידיאלי, יש גם מודלים של בעלי החיים אלה את היכולת למדידה לא פולשנית של נטל מחלה. יש לנו אופטימיזציה שיטות לכניסתה של לוציפר הגחליליתגן ASE לתוך שורות תאים לוקמיה באמצעות חלקיקים כמו וירוס, המאפשר ניתוח לא פולשני, אורך של התפרצות מחלה והתקדמות והערכה של נטל מחלה במח עצם ובאיברים מוצקים. קריטי לגישה זו הוא השימוש בשורות תאים מתויג לוציפראז חד שבטיים למניעת שונות בהתפתחות של לוקמיה-להביע לוציפראז הקשורים לשימוש של שורות תאי polyclonal ואינו קשור לטיפול בTKI 8. יחדיו, יכולים לשמש את השלבים הבאים להערכת TKI בודד או להשוואה ודירוג ישירים של TKIs מרובה. בעוד הפרוטוקולים שהוצגו כאן מתמקדים בפיתוח של TKIs, ניתן להתאים שיטות אלה למטרות אחרות ושיקולים לפיתוח assay מתוארים. לפיכך, אסטרטגיה זו עשויה להיות רחבה יותר ישים להערכה טרום הקלינית של סוכנים ממוקדים מולקולריים לטיפול בלוקמיה חריפה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

טירוזין קינאז רצפטור היה מעורב בפיתוח וההתקדמות של סרטן רבים, כולל שני לוקמיה וגידולים מוצקים, והם מטרות טיפוליות druggable אטרקטיביים. כאן אנו מתארים אסטרטגית ארבעת שלבים יעילים להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) בטיפול בלוקמיה חריפה. בתחילה, ניתוח כתם מערבי משמש כדי לאשר את עיכוב היעד בתאים לוקמיה בתרבית. פעילות פונקציונלית אז הוא הוערך באמצעות מבחני clonogenic בmethylcellulose או תרבויות אגר רכות. תרכובות ניסיוניות המדגימות פעילות במבחני תרבית תאים מוערכות in vivo באמצעות עכברי NOD-SCID-גמא (NSG) המושתלים orthotopically עם שורות תאים לוקמיה. במחקרי vivo pharmacodynamic ראשוניים להעריך עיכוב יעד בתקיעות leukemic מבודדת ממח העצם. גישה זו משמשת כדי לקבוע את המינון ואת לוח זמנים של ממשל נדרש ללעכב יעד אפקטיבייון. מחקרים מאוחרים יותר להעריך את היעילות של TKIs in vivo באמצעות לוציפראז לבטא בתאי סרטן דם, ובכך לאפשר לניטור bioluminescent לא פולשנית של נטל לוקמיה והערכת התגובה לטיפול באמצעות vivo מערכת הדמיה פליטת אור ב. אסטרטגיה זו הייתה יעילה להערכה של TKIs במבחנה in vivo ויכולה להיות מיושמת לצורך זיהוי של סוכנים ממוקדים מולקולריים עם פוטנציאל טיפולי או להשוואה ולתעדוף ישירים של תרכובות מרובות.

מבחני שהוצגו כאן להעריך את ההשפעות ביוכימיות ופונקציונליות בתיווכו של TKIs וניתן להשתמש בם לדרגת תרכובות רומן המבוססות על המידה של עיכוב היעד במבחנה in vivo, הפחתה של הקמת מושבה, ועיכוב בleukemogenesis בעכברים מושתל עם NSG לוציפראז- מתויג תאים לוקמיה. <p class="jove_content" style=";text-al...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia at JoVE.com

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

טירוזין קינאז רצפטור באים לידי ביטוי ectopically בסוגי סרטן רבים וזוהו כמטרות טיפוליות בלוקמיה חריפה. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה.

הערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

pre-clinical-evaluation-tyrosine-kinase-inhibitors-for-treatment

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

18.1K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  טירוזין קינאז רצפטור באים לידי ביטוי ectopically בסוגי סרטן רבים וזוהו כמטרות טיפוליות בלוקמיה חריפה. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה. 

Video: Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

השימוש fMRI אתגר תרופתי, מחקר קדם קליניים: בקשה מערכת 5-HT

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

שלפוחית ​​השתן Orthotopic גידול דגם ואת הערכת טיפול סרנה השלפוחית

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

טיפול של הכותנה העכברוש במחקרים להערכה טרום-הקלינית של וירוסי Oncolytic

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

דגם Murine Orthotopic פרה-קליני של סרטן ערמונית האדם

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

שימוש של מערכת הרדמה דיגיטלית זרימה נמוכה עבור עכברים וחולדות

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control seizures. However, a significant minority of patients continues to exhibit post-operative seizures, even in those cases in which the suspected source of seizures has been correctly localized and resected. The protocol presented here combines a clinical procedure routinely employed during the pre-operative evaluation of temporal lobe epilepsy (TLE) patients with a novel technique for network analysis. The method allows for the evaluation of the temporal evolution of mesial network parameters. The bilateral insertion of foramen ovale electrodes (FOE) into the ambient cistern simultaneously records electrocortical activity at several mesial areas in the temporal lobe. Furthermore, network methodology applied to the recorded time series tracks the temporal evolution of the mesial networks both interictally and during the seizures. In this way, the presented protocol offers a unique way to visualize and quantify measures that considers the relationships between several mesial areas instead of a single area.

This protocol describes a procedure to track the evolution of mesial network measures in temporal lobe epilepsy (TLE) patients. It is based on the combination of intracranial recordings with a novel numerical technique for data analysis. Specifically, we present a protocol for network analyses of foramen ovale recordings.

ניתוח רשת של הקלטות אלקטרודה foramen ovale בחולים עמידים בפני תרופות Temporal Lobe אפילפסיה

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

מודל הפרה-קליני של השתלת לב אורתוטופית

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

מודל טרום קליני של תרומת הלב לאחר מוות הדם

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...