생체 내 이미징에서 콜로라도 암 센터의 대학에서 IVIS 공유 자원 (부여 P30-CA046934에서 지원)를 사용하여 수행 하였다. 유동 세포 계측법은 유동 세포 계측법 공유 자원, 콜로라도 암 센터의 대학 (부여 P30CA046934에서 지원)에서 수행 하였다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (DKG에 RO1CA137078)에 의해 부분적으로 지원되었다. ABLS 소아과의 미국 아카데미, 미국 소아과 학회 및 아동 보건 인간 발달 (K12-HD000850)의 유니스 케네디 Shriver 국립 연구소에서 교부금에 의해 지원되는 소아 과학자 개발 프로그램의 연구원입니다.

동물을 포함한 모든 실험은 콜로라도 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 된 규제 기준을 따랐다. 입증 된 프로토콜은 콜로라도 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. 1. 인산화 단백질 서쪽 오점 <ol><li> 해물의 준비 <ol><li> 관심의 수용체 티로신 키나아제를 발현 농경 세포주. 수확 세포와 플레이트 3-5 × 10 48 잘 조직 배양 접시에 400 ㎕의 성장 배지에서 6 세포 / 샘플. 2 ~ 3 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 성장 매체에서 배 TKI 용액 100 μl를 추가하고 60 분 동안 품어. </li><li> 50 mM의 HEPES (pH를 7.5), 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 EDTA, 10 % (v / v) 글리세롤, 1 % (v / v) 트리톤 X-100, 및 프로테아제 억제제로 용해 버퍼를 준비한다. 문화가 이전에 수확 pervanadate으로 처리하지 않을 경우, 포스 파타 아제 억제제 (1 mM의 나트륨 orthova 추가용해 완충액에 nadate 및 0.1 ㎜ 몰리브덴 산 나트륨). </li><li> 사용 직전에 pervanadate (PV) 인산 가수 분해 효소 억제제 솔루션을 준비합니다. 얼음에 어두운 튜브 (30 % 원액의 1:100 희석)에 차가운 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 과산화수소 (주)의 0.3 % 용액을 준비한다. 0.2 M 나트륨 오르토 바나 데이트 5 분 (OV,주의) 원액의 나누어지는 끓인다. 실온 (RT)에서 20 mM의 OV 용액을 만들기 위해 PBS로 1:10 희석. 0.3 %의 과산화수소 및 20 mM의 OV 1:1로 혼합하고 20 분 동안 RT에서 어둠 속에서 배양한다. </li><li> 완전 배지 (60 μL의 PV + 940 ㎕의 배지)에 PV를 희석. 잘 희석 PV / 100 μl를 추가합니다. 3 분 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 부화 한 후 얼음에 플레이트를 배치합니다. </li><li> 5 분 동안 2,500 rpm에서 감기의 microfuge 튜브에 세포를 수확. 기음 뜨는 용해 버퍼 120 μL의 세포를 Resuspend. 15 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 3 분 동안 6,000 rpm에서 감기의 미세에 해물을 명확히. SUPE 이동신선한 차가운 관에 rnatant. -80 ° C.에 저장 </li></ol></li><li> 면역 <ol><li> 1 분 동안 1,000 rpm에서의 미세에 단백질 G 세 파로스 비즈를 스핀 다운. 상층 액을 제거하고 구슬이 1 ㎖ 차가운 PBS로 2 배 씻는다. 50 %의 슬러리를 만들기 위해 PBS의 동일 부피를 추가. 각 샘플 1 차 항체와 20 μL 50 %의 단백질 G 비즈를 추가합니다. O / N 4 ° C에서 회전에 - 2 시간 동안 품어. </li><li> 9,000 rpm에서 감기의 미세에있는 구슬을 펄스. 상층 액을 제거하고 구슬 150 μL 차가운 용해 버퍼와 배 씻는다. 1 분 동안 1,000 rpm으로 감기의 미세에 스핀. 2 - 머 캅토 에탄올 (주)와 20 μL 2X SDS 샘플 버퍼에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. -80 ° C에서 즉시 또는 상점 사용 </li><li> SDS-PAGE 트리스 - 글리신 젤에 5 분 및 실행에 대한 삶아 샘플. 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송하고 서양 얼룩에 의해 인산화 단백질을 감지합니다. </li><li> 물로 얼룩을 씻어하고, 2 % SDS에서 62.5 mM 트리스 (산도 6.8), 0을 품어.50 ° C에서 30 분 동안 1 M β-머 캅토 에탄올 (주의) 물로 배를 씻어 다음 솔루션을 박리 제거하는 TBS-T의 5-6 변경에 60 ~ 90 분 동안 세척한다. </li><li> 서양 얼룩에 의해 총 단백질을 감지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 메틸 셀룰로오스 분석 <ol><li> 멸균 큰 구멍 무딘 엔드 바늘을 사용하여 50 ML 원뿔 튜브에 메틸 인간의 기본 매체의 나누어지는 4 ML. (주 :. 프로필 메틸 사용 전에 RT O / N에서 C. 해동 ° 분취하고 -20에 저장 될 수있다) </li><li> 10 초 동안 메틸 셀룰로오스와 소용돌이 혼합물 4 ㎖에 성장 배지에서 10 배 TKI 또는 차량의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 수확과 수를 셀. 최종 세포 농도보다 10 배 더 높은 농도에서 성장 매체에 세포 현탁액을 준비합니다. 메틸 혼합물에 500 ㎕의 세포 현탁액을 추가합니다. 10 초 동안 소용돌이와 거품을 제거하는 10 분 동안 앉아 보자. </li><li> 5 ML의 주사기 및 멸균 larg의를 사용하여 메틸 혼합물 4 ㎖를 그리기전자는 무딘 엔드 바늘을 낳았다. 거품을 그리기하지 마십시오. 세 35mm 조직 배양 플레이트의 중심으로 메틸 혼합물 1 ㎖를 분배. 바닥이 완전히 메틸 셀룰로오스로 덮여 때까지 요리를 소용돌이 친다. </li><li> 각 메틸 플레이트를 들어, 다습 한 환경을 보장하기 위해 멸균 물이 가득 두 개의 추가 35mm 조직 배양 접시에 10cm 무균 조직 배양 접시를 준비합니다. 물에있는 장소의 문화가 10 ~ 14 일 5 % CO 2에서 37 ° C에서 인큐베이터를 재킷. </li><li> 1~2주 후 식민지를 계산합니다. 식민지는 20 개 이상의 세포와 중복되지해야합니다. 콜로니 격자 현미경 스테이지를 탑재 도립 현미경을 사용하여 또는 자동 콜로니 계수기를 이용하여 계산 될 수있다. TKI 치료에 대한 응답으로 식민지의 크기 나 형태의 변화도 평가되어야한다. (4,5 - 디메틸 -2 - 티아 졸릴) -2,5 - 디 페닐-2H-테트라 졸륨 브로마이드 졸 - (3 60-100 μL를 첨가하여 콜로니 카운터 스테인 콜로니에 의해 탐지를 향상시키는의 ution (MTT, -20 ° C에서 H 2 O, 상점에서 5 ㎎ / ㎖가, 빛,주의로부터 보호) 드롭 현명한 각 판의 표면에 5 % CO 2에서 37 ° C에서 8 시간 동안 배양. </li></ol> 3. 소프트 한천 분석 <ol><li> 아래 층, 상층 0.7 % 고귀한 한천 배 성장 매체 1 % 귀족 한천을 준비합니다. 42 ° C의 물을 욕조에 2 배 성장 매체를 평형. 열 1 % 전자 레인지 (약 1 min/100의 ML) 0.7 % 귀족 한천과 42 ° C의 물을 욕조에 평형. 1 %의 한천 배의 중간과 50 ㎖의 conicals에 별도로 0.7 %의 한천 배 매체의 동일한 부분을 섞는다. 각 층에 대한 부드러운 한천 혼합 / 여섯 잘 플레이트의 계획 10 ㎖. </li><li> 라벨 6 잘 조직 배양 플레이트. 1.5 ml의 1 % 부드러운 한천 혼합물로 잘 각을 입력합니다. 도금하는 동안 거품을 피하십시오. 30 분 동안 멸균 후드 뚜껑을 끈 건판. </li><li> 세포를 계산합니다. 최종 세포 concentrati보다 500X 높은 농도에서 성장 매체에 세포 현탁액을 준비에. 0.7 % 아가 혼합물에 세포 현탁액을 추가 잘 혼합하고 1 % 아가 층 위에 한천 세포 혼합액 1.5 ㎖를 분배. 상부 층은 30 분 동안 고화하자. </li><li> TKI 또는 차량 제어를 포함하는 1X 성장 매체를 준비합니다. 상단 한천 층 위에 TKI의 원하는 농도 매체의 2 ML을 추가합니다. </li><li> 5 %에서 37 ° C에서 10 일 동안 배양한다 CO 2. 3 일마다 제거하고 중첩 매체를 교체하십시오. </li><li> 식민지는 육안, 대기음 오버레이 매체에 볼 수 있으며 (4 ° C에서 H 2 O, 저장소에 1 ㎎ / ㎖ NBT 빛,주의로부터 보호) 200 ㎕의 니트로-테트라 졸 블루 솔루션을 추가합니다. 48 시간 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. 이전 세기에 적어도 2 시간 동안 4 ° C로 이동합니다. 스테인드 접시는 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 현미경 또는 자동화 된 식민지 카운터를 사용하여 식민지를 계산합니다. </li></ol> 4. 생체 내에서 포스 포 - 단백질 억제의 평가 <ol><li> C를 수집ELL 학생은 5 분 동안 1,500 rpm에서 테이블 탑 원심 분리기에서 원심 분리하여 로그 단계에서 성장. 무균 PBS로 한번 세척하고 세포를 적당한 농도로 PBS에 재현 탁 (전형적으로 1-5 × 10 7 세포 / ㎖). 28 G 인슐린 주사기를 사용하여 정맥 꼬리에 정맥 주사로 6-12주 된 NSG 마우스에 100 μL의 부피에 이식 세포. 혈관을 팽창하기 위해 따뜻한 물을 비커에 꼬리를 가열 전에 주입 클로르헥시딘 면봉으로 꼬리를 청소, 제한 수단에 동물을 배치합니다. 주사 후 출혈이 멈출 때까지 멸균 거즈를 이용하여 주입 부위에 압력을 적용한다. 이식 적어도 3 동물 / 그룹. 1 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 황산염을 함유하는 물에 마우스를 유지한다. </li><li> 포티 일 이식 후, 대상 억제 분석 TKI 또는 전용 차량 및 수확 샘플 동물을 취급합니다. 동물의 무게를 측정하고 적절한 복용량 TKI 또는 차량의 (체중 ㎎ / ㎏)으로 취급합니다. 5 ㎖ / K의 볼륨 처리를 관리경구 위관 영양법에 의해 복강 내 (IP) 주입 또는 10 ㎖ / kg 체중 기준 g 체중. IP 주입의 경우, 수동으로 마우스를 억제하고 29 G 바늘을 사용하여 복부의 우측 사분면에 주입. 경구 위관의 경우, 수동으로 마우스를 억제하고 직립 동물을 개최합니다. 혀를 통해 입의 뒷면에 입 위관 튜브를 놓습니다. 식도를 통해 위장으로 튜브를 통과하는 약간의 압력을 적용합니다. 치료를 관리하기 위해 주사기 플런저를 우울. 플런저 쉽게 우울하지 않으면 위관 영양법 바늘을 제거하고 재배치한다. 사용 직전에 TKI 제제를 준비합니다. </li><li> pervanadate 치료가 요구되는 경우 (단계 1.1.4) 상술 한 바와 같이 수확 전에 PV 용액을 20 분을 준비하고 1 μM MgCl2를 100 U / ㎖ DNA 분해 효소 (120 μL의 PV + 880 ㎕의 배지) 배지로 희석한다. 주 : PV가 희석 후 최소 1 시간 동안 안정하다. </li><li> AP에서 CO 2 마취에 의해 동물을 희생와 적합한 시간 (s) 후 처리. 뼈가 완전히 노출되도록 다리 전체에서 모피, 피부와 근육을 제거하여 대퇴골을 해부하다. 다만 고관절 아래에 다시 무릎 관절 위의 가위를 해부 클리핑하여 대퇴골을 제거합니다. 주사기와 27 G 바늘을 사용하여 1 ㎖ 차가운 PBS 또는 희석 PV 솔루션 페트리 접시와 플러시 골수에 전송합니다. PV로 처리하는 경우, 10 분 동안 어두운 데에서 RT에서 배양한다. </li><li> 해물을 준비하고 (단계 1.1.6-1.2.5) 전술 한 바와 같이 인산화 단백질과 총 단백질 수준을 분석 할 수 있습니다. </li><li> 농도계를 사용하여 각 샘플에 대하여 포스 포 - 단백질 및 총 단백질 수준을 정량화. 차량 처리 된 동물의 평균 phospho-protein/total-protein 값에 phospho-protein/total-protein 기준으로 계산합니다. </li></ol> 5. ALL 이종 이식 모델에서 TKIs의 반대로 백혈병 활동의 평가 <ol><li> 필요한 경우, RS-2000 조사기 언젠가 프리 오 방사선 200 CGY에 마우스를 노출이식에 대한 연구. (단계 4.1) 상술 한 바와 같이 백혈병 세포주와 함께 이식 생쥐. 그룹 당 이식 적어도 6 마우스. 귀 펀치 마우스를 확인합니다. 대안으로, 블랙 마커 그들의 꼬리에 해시 마크 가진 마우스를 식별하기 위해 사용될 수있다. 연구 기간 동안 케이지 메이트 침략의 가능성을 줄이기 위해 새장에 농축을 추가합니다. </li><li> (4.2 단계) 위의 설명에 따라 TKI 또는 차량과 쥐를 치료​​. 신체 검사와 체중 측정을 통해 매일 생쥐의 건강 상태를 모니터링합니다. 백혈병의 예상 증상 (활동 수준, 체중 감소, 뒷다리 마비, 눈의 감염을 감소). 체중 감량보다 10 % -15 %는 일반적으로 두 일 이내에 마우스의 죽음과 관련된 일반적으로 표준 IACUC의 요구 사항에 따라 사망을 대리 엔드 포인트입니다. </li><li> 매주 최대 2 배의 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 통해 생착과 백혈병의 개발을 모니터링합니다. steri에 200 배의 D-루시페린 원액 (30 ㎎ / ㎖)를 준비르 물. D-루시페린이 완전히 용해 될 때까지 반전에 의해 부드럽게 혼합한다. -20 ℃에서 바로 사용하거나, 나누어지는 동결 종래 RT에서 D-루시페린의 분취 량을 해동하고 15 ㎎ / ㎖ 및 필터는 0.2 ㎛의 필터를 통해 살균의 최종 농도로 PBS에 1:2로 희석, 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 이미징. </li><li> 산소 1.5 % 흡입 이소 플루 란과 영상 전에 마우스를 마취. 근육 이완, 운동의 손실 및 발가락 핀치 자극에 대한 반응의 손실을 특징으로 충분한 마취를 모니터링합니다. </li><li> 즉시 이미징 전에, IP 주사 (체중의 15 ㎎ / ㎖ 루시페린 / g의 10 μL) 150 ㎎ / ㎏ 체중 D-루시페린을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 연속 30, 60, 90 초 노출 및 120 초 노출 최종 이미지와 이미지의 2 시리즈를 캡처하기 위해 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 사용합니다. 촬영 후, 케이지에 마우스를 반환하고 마취에서 회복을 모니터링 할 수 있습니다. 에 따라생물 발광의 강도, 노광 시간이 변경 될 수있다. 최적의 노출 시간은 해당 모델에 대한 일정 및 개별 시점에 대한 신호 강도가 전체 연구에서 비교 것을 일관성 등을 보관해야합니다. </li><li> 생활 이미지 3.2 수집 및 분석 소프트웨어를 사용하여 각 마우스에 대한 생물 발광 강도를 결정합니다. 두 번째 각 마우스에 동일한 크기의 관심 영역 (ROI)을 그려 광자 / 측정 광속의 값을 결정합니다. </li><li> 보다 큰 15 %의 중량 손실이 발생, 마비를 나타내는, 빈사 또는 연구 끝에 경우 CO 2 노광 및 경추 탈구하여 마우스를 희생한다. 마우스 및 기록 관찰 (, 골수 창백한 비장, 간, 또는 림프절의 예 확대)을 해부하다. 27 G 바늘을 사용하여 대퇴골과 차가운 PBS로 세척 골수를 해부하다. </li><li> 5 분 동안 2,500 rpm에서의 미세 세포를 수집합니다. 2 % FBS를 함유하는 PBS에서 세포를 재현 탁하고 RT에서 5 분 동안 배양한다.20 ㎎ / ㎖ DAPI (4,6 - Diamidino -2 - 페닐 인돌 디 히드로 클로라이드, 1:1,000) 및 FITC - 복합 α-hCD45 (1:100) 또는 마우스 IgG의 1 이소 제어 항체 (1:100)와 세포와 얼룩을 수집 . 유동 세포 계측법을 사용하여 백혈병의 생착을 평가합니다. 가능한 인구에 게이트 (DAPI 음) 및 CD45 + 세포 (%의 골수 돌풍)의 비율을 결정합니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 원고는 급성 백혈병의 치료에 신규 한 티로신 키나제 억제제의 평가를위한 효과적인 전략을 설명한다. 이 방법을 사용, 생화학 및 항 백혈병 활동은 체외에서 세포 기반 분석에서 먼저 평가 한 후 생체 내에서 이종 이식 모델에 있습니다. 면역 블롯 분석은 성공적 TKIs 치료 후 백혈병 세포에서 표적 티로신 키나아제의 저해를 입증하는 직접 세포에서 여러 화합물의 효능을 비교하?...

급성 림프 구성 백혈병 (ALL)은 아이들 1,2에서 가장 흔한 악성 종양이다. 소아 B-계보 ALL (B-ALL)의 생존율은 약 85 %이지만, T-혈통 ALL (T-ALL) 등의 특정 생물 학적 아형, 심지어 현재의 치료 프로토콜을 여전히 가난한 예후가. 재발 ALL의 추가 처리는 도전 3 남아있다. 급성 백혈병 성인 환자의 대부분은 선행 화학 요법과 죄 사함을 얻을 수 있지만, 많은 환자는 여전히 재발 사를 겪고 있습니다. 급성 백혈병의 치료에 현재 항암 요법은 관련 독성 장단기 부작용을 일으키는 것으로 알려져있다. 그러므로, 구체적으로 정상 조직에 최소한의 효과 암세포를 표적으로 덜 독성 요법이 크게 요구된다. 최근 강조 신규 암세포에 대한 특이성 분자 타겟 에이전트 종종 반복적 인 화학을 이용하여 개발에 배치되었습니다다음에 비해 5 우선 순위를해야합니다 여러 활성 화합물을 생성 할 수 있습니다. 이 원고는 약물 개발을 용이하게하기 위해 하나의 화합물의 평가를 위해 또는 다중 화합물의 직접 비교에 사용될 수있는 급성 백혈병의 치료를위한 TKIs의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다. 여기에 제시된 방법은 네 단계로 구성되어 있습니다. 순 생화학 (1) 및 항 백혈병 (2) 화합물 (들)의 활동이 세포 배양에서 평가되고, 그 다음 대상의 억제는 동물 모델 (3)에서 확인하고, TKI 해제 최종적 치료 효능된다 동소 백혈병 이종 이식 모델에서 결정된다 (4). 이들 연구의 경우, 가장 일반적인 생물학적 아형의 대표이다 중요한 세포주를 선택하는 것이 중요하다. 셀 라인은 생물학적 효과 의대 여부를 조사하기 위해, 모두가 관심의 대상을 표현하고 관심의 대상이 결여 된, 선택해야대상의 억제에 의해 iated. 이것은 항 종양 활성을 위해 중요 할 수있다 표적 이탈 효과가 소분자 저해제의 개발에 특히 적합하다. 그런 증식 또는 생존 등의 기능 효과의 대상에 의존하는 세포 라인을 선택하는 것이 필요하다. 타겟을 억제하는 RNA 간섭 또는 다른 특정 수단을 사용하여 (이 문서의 범위 밖) 예비 타겟 검증 연구는 타겟 종속 세포주를 식별하기 위해 사용될 수있다. 그것은 세포 배양 결과는 더 직접적 생체 내 실험으로 변환 될 수 있도록 뮤린 이종 이식편을 형성 할 수있는 세포주를 선택하는 것이 바람직하다. 백혈병 세포에 의해 매개 TKIs 생화학 적 활성의 평가를 위해, 수용체 인산화의 감소는 표적 억제의 지표로서 사용될 수있다. 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA 분석법 항체의 가용성 및 특이성에 따라 채용 될 수있다.대상에 대한 충분한 특이 항체를 사용할 수있는 경우가 더 많은 양적 효율적으로, ELISA 분석 실험이 바람직하다. ELISA에 충분 특이 항체를 사용할 수없는 경우, 웨스턴 블롯 분석이 필요할 수 있습니다. 이 경우, 해물 많은 양의 면역 낮은 풍부에있는 표적의 탐지에 유용 할 수 있습니다. 이 방법은 환경 자극에 대한 응답으로 신호의 급격한 변화를 허용하는 짧은 반감기를 가질 수있다 인산화 단백질의 측정에 특히 적합합니다. 일부 인산화 단백질은 매우 불안정한 포스파타제와 함께 복합체 형성의 결과로 가장 가능성이 높다. 이러한 인산화 된 단백질의 강력하고 일관된 검출을 위해, 또한 종래 전체 세포 용 해물의 제조에 인산화 단백질을 안정화시키기 위해, pervanadate, 비가역 단백질 티로신 포스파타제 억제제 (6)로 세포를 처리하는 것이 가능할 수있다. 에생화학 적 활성은 항 종양 효과가 발생하는지 여부를 결정, 대상에 의존하는 생물 학적 과정은 세포 기반 실험에서 모니터링 할 수 있습니다. 백혈병 세포주, TKIs 의해 매개 항 - 백혈병 활성은 메틸 또는 소프트 한천 7에서 수행 콜로니 형성 어 세이를 사용하여 평가 될 수있다. 이 TKI 반복 치료가 필요한 경우 조작에 더 많은 의무가 고체 배지처럼 부드러운 한천이 바람직 할 수있다. 많은 급성 myloid 백혈병 (AML) 세포 라인은 소프트 아가에서 콜로니를 형성하는 동안, 대부분의 ALL 세포주는 반고체 배지 인, 메틸 셀룰로오스에서 콜로니를 형성 할 것이다. 이 메틸 셀룰로오스 배양 매체 및 / 또는 TKIs를 새로 고침 할 수 있지만, 단지 작은 볼륨은 사용 제한 주파수를 할 수 있습니다. 마찬가지로, 메틸 셀룰로오스에서 그들을 방해하지 않고 식민지를 염색하는 것이 더 어렵다. 예비 연구는 메틸 및 / 또는 소프트 한천 및 t에서 콜로니를 형성하기위한 적절한 세포주의 능력을 정의한다그는 문화에 세포의 최적의 밀도 식민지가 겹치지하고 충분한 수의 (35 mm 플레이트 당 보통 50 ~ 200 식민지) 통계적으로 관련 데이터를 얻을 수 있도록. 체외 분석 강력하고 비용 효율적인, 그리고 가지고 있지만 모든 동물 실험, 치료 화합물의 발전보다 적은 수의 윤리적 의미는 동물 모델에서 효능과 안전성의 증거가 필요합니다. 생체 내 연구의 경우, 인간의 급성 백혈병 세포주 orthotopically 내가 tm1Wjl / SZJ (NSG) 마우스 및 TKIs 쉽게 주입 또는 경구 위관 영양법으로 투여 할 수있다 l2rg NOD.Cg-Prkdc의 SCID에 이식 할 수 있습니다. 일부 세포주 이종 이식 수립하기 위해서는 방사선의 낮은 세포주에 의존 선량 NSG 마우스의 노출을 필요로 할 수 있으며,이 경우에는 마우스는 5 ~ 10 일 회복 기간 후 조사하지 않고 경구 위관을 허용하지 않을 수 있습니다. 이 원고는 사용 B-ALL과 T-ALL 이종 이식의 생성을 설명합니다예이지만 이종 이식편과 같은 특정 세포주 (697 및 된 Jurkat)은 세포주의 다양한 사용 NSG 쥐에서 설립 될 수있다. 다른 세포주가 더 적용되면 일 경우에는, 조사에 대한 요구 사항은, 이식 및 질환 발병과 진행의 타이밍 세포의 최적의 수는 실험적으로 결정되어야한다. 이상적으로,이 모델은 (인해 질병에 이상적 20-30일 연구에서 치료 및 제거의 시작 사이의) 완전한 penetrance (이식 모든 동물은 백혈병을 개발), 일관된 반응 속도 (백혈병은 모든 동물에서 유사하게 진행), 그리고 적절한 치료 창을해야합니다 . 이식 된 세포의 수는 penetrance 및 운동 일관성을 개선하기 위해 증가되거나 필요한 경우, 처리 윈도우를 개선하기 위해 감소 될 수있다. TKIs는 생체 내에서 대상 억제를 중재 여부를 확인하려면 샘플 TKI 또는 전용 차량과 치료 후 백혈병 이종 이식 생쥐에서 수집됩니다. 이상적으로, 선량이 실험에 대한 정부의 개발 일정은 일반 상업 실험실에서 수행하고이 문서의 범위를 벗어난다 할 수 약동학 연구에 의해 인도된다. 약물 동력 학적 데이터를 사용할 경우에, TKI의 단일 용량 다음 세포 배양에 효과적인 표적 억제 및 최대 혈청 농도에 필요한 화합물의 농도는 동물 연구에 대한 초기 투여 량을 정의하기 위해 사용될 수있다. 약동학 연구는 또한 약물 역학 연구 및 투여 경로에 대한 시료 채취 후 처리의 타이밍을 알릴 수 있습니다. 표적의 억제는 영향을받는 기관에서 평가 될 수 있지만, 대부분 쉽게 수집 및 처리되는 조직이 바람직하다. 특정 장기에 영향 비록 대부분 급성 백혈병 세포주, 간, 골수, 비장, 말초 혈액 및 중추 신경계에 확립하고 이러한 장기에 생착의 정도는 모델에 따라 변화한다. 여기에 제시된 프로토콜은 phosph을 평가O-단백질의 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 골수 억제, 그러나 고체 장기 지속적으로 수확하는 것이 더 쉬울 수 및 샘플 수집 및 처리하는 동안 인산화 단백질의 분해를위한 더 적은 기회를 허용하기 전에 동결에없이 또는 최소한의 처리를 필요로 할 수있다. 면역 조직 화학은 또한 고형 종양 또는 백혈병의 영향 장기를 평가할 수있다. 마지막으로, TKI (들)의 치료 효능은 동소 백혈병 이종 이식 모델에서 결정된다. 이들 연구의 경우, 처리 개시 타이밍은 질병이 다소간 확립 될 수 있도록, 변경 될 수있다. 치료는 초기 연구를 위해 이식 후 바로 시작할 수 있습니다 다음 중요한 질병 부담이 더 밀접하게 진단 치료 모델을 대략적으로 감지 될 때까지 후속 연구에서 지연. 이상적으로,이 동물 모델은 질병 부담의 비 침습 측정에 대한 능력이있다. 우리는 반딧불이 루시퍼의 도입을위한 방법을 최적화 한질병의 발병 및 골수와 고체 장기 질병 부담의 진행과 평가의 비 침습, 종 방향 분석을 허용 바이러스 입자를 사용하여 백혈병 세포주에 ASE 유전자. 이 방법은 긴급 클론 세포주의 사용과 관련된 루시 페라 제 발현 백혈병의 개발에 변동을 방지하기 위해 모노클로 루시페라아제 - 태그 된 세포주의 사용이며 TKI 8 치료 무관하다. 이와 함께,이 단계는 하나의 TKI의 평가를 위해 또는 여러 TKIs의 직접 비교하고 순위를 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜 TKIs의 개발에 초점을하지만,이 방법은 다른 대상에 적용 할 수 있으며, 분석 개발을위한 고려 사항이 설명되어 있습니다. 따라서,이 전략은 급성 백혈병의 치료에보다 광범위하게 적용 할 수있는 분자 타겟 에이전트의 전 임상 평가를 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

수용체 티로신 키나아제는 백혈병과 고형 종양을 모두 포함하여 많은 암의 발전과 진행에 연루되어 있고, 매력적인 druggable 치료 표적입니다. 여기에 우리가 급성 백혈병의 치료에 티로신 키나제 억제제 (TKIs)의 전 임상 평가를위한 효율적인 네 단계의 전략을 설명합니다. 처음에, 웨스턴 블롯 분석은 배양 된 백혈병 세포의 대상 억제를 확인하는 데 사용됩니다. 기능적인 활동은 다음 메틸 또는 부드러운 한천 문화 클론 원성 분석을 사용하여 평가됩니다. 세포 배양 분석 활동을 보여 실험 화합물은 인간의 백혈병 세포 라인 orthotopically 이식 NOD-SCID-감마 (NSG) 마우스를 사용하여 생체 내에서 평가됩니다. 초기의 생체 내 약력 학적 연구는 골수에서 분리 백혈병 폭발에 표적 억제를 평가한다. 이 방법은 효과적인 표적 억제에 필요한 투여 량 및 스케줄을 결정하는 데 사용이온. 후속 연구함으로써 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 백혈병 부담과 치료 반응의 평가의 비 침습적 모니터링 생물 발광을 허용 루시퍼 백혈병 발현 세포를 사용하여 생체 내에서 TKIs의 효능을 평가한다. 이 전략은 시험 관내 및 생체 내에서 TKIs의 평가에 효과가있다 및 치료 가능성을 가진 분자 타겟 에이전트의 식별을 위해 또는 여러 화합물의 직접적인 비교 및 우선 순위에 적용 할 수 있습니다.

여기에 제시된 분석은 TKIs 의해 매개되는 생화학 적 및 기능적 효과를 평가하고, 시험 관내 및 생체 내 표적 억제의 정도에 기초하여 신규 한 화합물을 평가하기 위하여 사용될 수 있으며, 콜로니 형성의 감소, 및 NSG 생쥐 leukemogenesis 지연 루시퍼 라제-이식 백혈병 세포를 태그. 면역 블롯 분석은 TKIs 치료 다음 백혈병 세포에서 표적 단백질의 활성 형태의 인산화?...

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Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

수용체 티로신 키나아제는 ectopically 많은 암에서 발현되는 급성 백혈병의 치료 표적으로 확인되었습니다. 이 원고는 급성 백혈병의 치료를위한 티로신 키나제 억제제의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다.

급성 백혈병의 치료에 대한 티로신 키나제 억제제의 전임상 평가

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

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Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

18.0K 조회수.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  수용체 티로신 키나아제는 ectopically 많은 암에서 발현되는 급성 백혈병의 치료 표적으로 확인되었습니다. 이 원고는 급성 백혈병의 치료를위한 티로신 키나제 억제제의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다. 

비디오: Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

사전 임상 연구에서 Pharmacological - 도전 fMRI의 사용 : 5-HT 시스템 신청

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

연구

의학

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Orthotopic 방광 종양 모델 및 Intravesical saRNA 트리 트먼트의 평가

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

종양 살상 바이러스의 전 임상 평가에 대한 연구에면 쥐의 취급

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

인간의 전립선 암의 전 임상 동소 이식 쥐 모델

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

마우스 및 쥐에 대한 낮은 흐름 디지털 마취 시스템의 사용

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

정형외 심장 이식의 전 임상 돼지 모델

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

순환사망 후 심장 기증 전 임상 모델

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

마우스에 있는 우심실 시스템 및 저산소증 유도된 폐 동맥 고혈압을 위한 침략적인 혈역학 평가

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...