Imaging in vivo è stata eseguita utilizzando il IVIS Shared Resource presso l&#39;Università del Colorado Cancer Center (sostenuto da sovvenzioni P30-CA046934). Citometria a flusso è stato eseguito presso la citometria a flusso di risorse condivise, University of Colorado Cancer Center (sostenuto da sovvenzioni P30CA046934). Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health (RO1CA137078 a DKG). ABLS è membro del Programma di Sviluppo Pediatric Scientist, sostenuta da sovvenzioni dal American Academy of Pediatrics, il Pediatric Society americana e il Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (K12-HD000850).

Tutti gli esperimenti su animali hanno seguito le norme regolamentari approvate dalla University of Colorado Institutional Animal Care ed uso comitato. Il protocollo ha dimostrato è stato approvato dalla University of Colorado Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa. 1. Fosfo-proteine ​​Western Blot <ol><li> Preparazione dei lisati <ol><li> Linee cellulari cultura che esprimono il recettore tirosina chinasi di interesse. Celle di raccolta e la piastra 3-5 x 10 6 cellule / campione in 400 microlitri mezzo di crescita in un piatto di coltura tissutale a 48 pozzetti. Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 2-3 ore. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione 5x TKI nel terreno di coltura e incubare per 60 min. </li><li> Preparare tampone di lisi con HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, 10% (v / v) glicerolo, 1% (v / v) Triton X-100, e inibitori della proteasi. Se le culture non saranno trattati con pervanadate prima del raccolto, aggiungere gli inibitori della fosfatasi (orthova sodio 1 mMnadate e 0,1 mM sodio molibdato) al tampone di lisi. </li><li> Preparare pervanadate (PV) soluzione inibitore fosfatasi immediatamente prima dell&#39;uso. Preparare una soluzione di 0,3% di perossido di idrogeno (ATTENZIONE) in tampone fosfato freddo salino (PBS) in un tubo scuro su ghiaccio (1:100 diluizione di una soluzione madre 30%). Far bollire una aliquota di 0,2 M di sodio orthovanadate (OV, ATTENZIONE) soluzione madre per 5 min. Diluire 1:10 in PBS per fare 20 soluzione OV mm a temperatura ambiente (RT). Mescolare 0,3% di perossido di idrogeno e 20 mM OV 1:1 e incubare al buio a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Diluire PV in mezzo completo (60 microlitri PV + 940 microlitri di media). Aggiungere 100 ml di PV diluito / bene. Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 3 minuti e poi posizionare piastra su ghiaccio. </li><li> Raccogliere le cellule in provette per microcentrifuga freddo a 2500 rpm per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 120 microlitri di tampone di lisi. Incubare in ghiaccio per 15 min. Chiarire il lisato in una microcentrifuga freddo a 6.000 rpm per 3 min. Trasferimento supernatant in una nuova provetta freddo. Conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Immunoprecipitation <ol><li> Spin down G proteine ​​sefarosio perline in microcentrifuga a 1.000 rpm per 1 min. Rimuovere il surnatante e lavare perle 2x con 1 ml di PBS freddo. Aggiungere un volume uguale di PBS per ottenere un impasto 50%. Aggiungere l&#39;anticorpo primario e 20 microlitri 50% di proteine ​​G perline per ogni campione. Incubare per 2 h - O / N a 4 ° C su un rotatore. </li><li> Pulse giù perline in una microcentrifuga freddo a 9.000 giri. Rimuovere il surnatante e lavare perle 2x con 150 microlitri di buffer di lisi freddo. Spin in microcentrifuga freddo a 1.000 rpm per 1 min. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 20 microlitri del campione 2X SDS tampone con 2-mercaptoetanolo (ATTENZIONE). Utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C. </li><li> Campioni bollire per 5 minuti e correre su un gel tris-glicina SDS-PAGE. Trasferire le proteine ​​su una membrana di nitrocellulosa e rilevare fosfo-proteina mediante western blot. </li><li> Risciacquare blot con acqua e poi incubare a 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,8), 0.1 M β-mercaptoetanolo (ATTENZIONE) per 30 min a 50 ° C. Risciacquare 2x con acqua e poi lavare per 60-90 min a 5-6 cambi di TBS-T per rimuovere strippaggio soluzione. </li><li> Controllo totale-proteina mediante western blot. </li></ol></li></ol> 2. Metilcellulosa Assay <ol><li> Aliquota 4 ml di metilcellulosa terreno base umana in 50 ml provette coniche con un grande foro ago estremità smussata sterile. (Nota:. Metilcellulosa può essere suddiviso in aliquote e conservato a -20 ° C. Scongelare a RT O / N prima dell&#39;uso) </li><li> Aggiungere 500 pl di 10x TKI o veicolo in terreno di crescita a 4 ml di metilcellulosa e miscela vortex per 10 sec. </li><li> Harvest e le cellule di conteggio. Preparare una sospensione di cellule in mezzo di coltura in una concentrazione, che è 10 volte superiore alla concentrazione cellulare finale. Aggiungi sospensione cellulare 500 microlitri di miscela di metilcellulosa. Vortex per 10 secondi e lasciate riposare per 10 minuti per rimuovere le bolle. </li><li> Redigere 4 ml di miscela di metilcellulosa utilizzando una siringa da 5 ml e larg sterilee portava l&#39;ago punta smussata. Evitare la redazione di bolle. Pipettare 1 ml della miscela metilcellulosa al centro di tre 35 millimetri piastre di coltura tissutale. Agitare i piatti fino a quando il fondo è completamente ricoperta di metilcellulosa. </li><li> Per ogni piatto metilcellulosa, preparare una sterile piastra di coltura tissutale 10 centimetri con due ulteriori 35 millimetri di tessuto piastre di coltura riempiti con acqua sterile per garantire un ambiente umido. Culture posto in acqua guaina incubatore a 37 ° C in 5% di CO 2 per 10-14 giorni. </li><li> Contare le colonie dopo 1-2 settimane. Colonie dovrebbero essere più di 20 celle e non sovrapposte. Le colonie possono essere contati utilizzando un microscopio invertito dotato di un palco microscopio con una griglia o utilizzando un contatore di colonie automatizzato. Variazioni delle dimensioni delle colonie o morfologia in risposta al trattamento con TKI dovrebbero essere valutati. Per migliorare il rilevamento da contatore di colonie, le colonie macchia con l&#39;aggiunta di 60-100 ml di (3 - (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro solution (MTT, 5 mg / ml di H 2 O, conservare a -20 ° C, proteggere dalla luce, ATTENZIONE) goccia a goccia sulla superficie di ciascuna piastra e incubare per 8 ore a 37 ° C in 5% di CO 2. </li></ol> 3. Morbido Agar Assay <ol><li> Preparare 1% nobile agar per strato di fondo, 0,7% nobile agar per strato superiore e 2x mezzo di crescita. Equilibrare crescita media 2 volte in un bagno d&#39;acqua a 42 °. Calore 1% e 0,7% nobile agar in un forno a microonde (circa 1 min/100 ml) ed equilibrare in un bagno d&#39;acqua 42 ° C. Mescolare parti uguali di 1% agar e 2x medio e separatamente lo 0,7% agar e 2x di media in 50 ml coniche. Piano 10 ml di soffice impasto / piastra di sei ben agar per ogni strato. </li><li> Label 6 pozzetti piastre di coltura tissutale. Riempire ogni pozzetto con la miscela agar molle 1,5 ml 1%. Evitare di bolle durante la placcatura. Lastre secche con coperchio off in cappa sterile per 30 min. </li><li> Contare le celle. Preparare una sospensione di cellule in mezzo di coltura in una concentrazione, che è 500x superiore alla Concentrati cellulare finaleon. Aggiungere sospensione cellulare al 0,7% miscela agar, mescolare bene ed erogare 1,5 ml della miscela di cellule agar sulla parte superiore dello strato di agar 1%. Lasciate che lo strato superiore solidificare per 30 minuti. </li><li> Preparare il terreno di coltura contenente 1x TKI o il controllo del veicolo. Aggiungere 2 ml di terreno con concentrazione desiderata di TKI sulla parte superiore dello strato superiore agar. </li><li> Incubare culture per 10 giorni a 37 ° C in 5% CO 2. Rimuovere e sostituire il mezzo sovrapponendo ogni 3 giorni. </li><li> Quando le colonie sono visibili ad occhio nudo, medie aspirare sovrapponendo e aggiungere la soluzione nitro-blu tetrazolio 200 ml (1 mg / ml NBT in H 2 O, conservare a 4 ° C, proteggere dalla luce, ATTENZIONE). Ritorno a incubatore per 24-48 ore. Spostarsi a 4 ° C per almeno 2 ore prima di conteggio. Piastre Stained possono essere conservati a 4 ° C per un mese. Contare le colonie usando un microscopio o un contatore di colonie automatico. </li></ol> 4. Valutazione della fosfo-proteina Inibizione in vivo <ol><li> Raccogliere cells crescente in fase log mediante centrifugazione in una centrifuga da tavolo a 1500 rpm per 5 min. Lavare le cellule una volta con PBS sterile e risospendere in PBS ad una concentrazione appropriata (tipicamente 1-5 x 10 7 cellule / ml). Trapianto cellule in un volume di 100 microlitri in 6-12 settimane di età topi dell&#39;NSG mediante iniezione endovenosa nella vena caudale utilizzando una siringa da insulina 28 G. Posto l&#39;animale in un dispositivo di immobilizzazione, riscaldare la coda in un bicchiere di acqua tiepida per dilatare le vene, e pulire la coda con un tampone clorexidina prima dell&#39;iniezione. Dopo l&#39;iniezione, applicare pressione al sito di iniezione con una garza sterile fino a quando si arresta l&#39;emorragia. Trapianto di almeno 3 animali / gruppo. Mantenere il mouse su acqua contenente 1 mg / ml gentamicina solfato. </li><li> Quattordici giorni dopo il trapianto, trattare gli animali con TKI o solo veicolo ed i campioni raccolti per l&#39;analisi di inibizione bersaglio. Pesare animali e trattare con una dose adeguata (mg / kg di peso corporeo) di TKI o del veicolo. Somministrare il trattamento in un volume di 5 ml / kg di peso corporeo per via intraperitoneale (ip) iniezione o 10 ml / kg di peso corporeo mediante sonda gastrica. Per l&#39;iniezione ip, frenare il mouse manualmente e iniettare nel quadrante inferiore destro dell&#39;addome utilizzando un ago G 29. Per sonda gastrica, frenare il mouse manualmente e tenere l&#39;animale in posizione verticale. Posizionare il tubo sonda gastrica in bocca sulla lingua e nella parte posteriore della bocca. Applicare una leggera pressione per passare il tubo attraverso l&#39;esofago e nello stomaco. Premere lo stantuffo della siringa per somministrare il trattamento. Se lo stantuffo non deprime facilmente l&#39;ago sonda gastrica deve essere rimosso e riposizionato. Preparare formulazioni TKI immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Se il trattamento pervanadate è desiderato, preparare la soluzione PV 20 min prima del raccolto come descritto sopra (passo 1.1.4) e diluire in media con 1 mM MgCl 2 e 100 U / ml DNasi (120 microlitri PV + 880 microlitri di media). Nota: PV è stabile per almeno 1 ora dopo la diluizione. </li><li> Sacrifica animali da CO 2 narcosi al apTempo propriato (s) post-trattamento. Sezionare femori rimuovendo pelliccia, pelle e muscoli dall&#39;intero gamba in modo che le ossa sono completamente esposti. Rimuovere i femori dal ritaglio con dissezione forbici appena sotto l&#39;anca e di nuovo al di sopra del ginocchio. Trasferire in una piastra di Petri e filo midollo osseo con 1 ml di PBS freddo o soluzione PV diluita utilizzando una siringa e un ago G 27. Se il trattamento con PV, incubare a RT al buio per 10 min. </li><li> Preparare lisati e analizzare i livelli di fosfo-proteine ​​e totale di proteine ​​come sopra indicato (gradini 1.1.6-1.2.5). </li><li> Quantificare relativa fosfo-proteine ​​e livelli totali di proteine ​​per ogni campione mediante densitometria. Calcola phospho-protein/total-protein relativa al valore medio phospho-protein/total-protein per gli animali trattati con veicolo. </li></ol> 5. Valutazione delle attività anti-leucemia di TKI in tutti i modelli di xenotrapianto <ol><li> Se necessario, esporre topi a 200 cGy di radiazioni in un irradiatore RS-2000 uno giorno prior al trapianto. Topi Trapianto con linee di cellule di leucemia come descritto in precedenza (punto 4.1). Trapianto di almeno 6 topi per gruppo. Identificare topi pugno all&#39;orecchio. In alternativa, un pennarello nero può essere utilizzato per identificare topi con segni hash sulle loro code. Aggiungi arricchimento gabbie per ridurre il potenziale di gabbia compagno aggressione durante lo studio. </li><li> Trattare topi con una TKI o solo veicolo come descritto sopra (fase 4.2). Monitorare lo stato di salute dei topi ogni giorno tramite l&#39;esame fisico e la determinazione del peso. I sintomi attesi di leucemia (ridotto livello di attività, perdita di peso, paralisi degli arti posteriori, e infezioni oculari). La perdita di peso superiore al 10% -15% è di solito associata con la morte del mouse entro due giorni ed è tipicamente un endpoint surrogato per la morte in conformità con i requisiti standard di IACUC. </li><li> Monitorare l&#39;attecchimento e lo sviluppo di leucemia attraverso un sistema di imaging in vivo in bioluminescenza fino a 2x settimanale. Preparare una soluzione madre 200x D-luciferina (30 mg / ml) in sterile acque. Mescolare delicatamente per inversione fino a D-luciferina è completamente sciolto. Utilizzare immediatamente, o Aliquotare e congelare a -20 ° C. Prima di immagine che utilizzano un sistema di imaging in vivo in bioluminescenza, scongelare aliquote di D-luciferina a RT e diluire 1:2 in PBS ad una concentrazione finale di 15 mg / ml e filtro sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 micron. </li><li> Anestetizzare i topi prima di imaging con il 1,5% isoflurano inalato in ossigeno. Monitorare l&#39;anestesia sufficiente, caratterizzata da rilassamento muscolare, perdita di movimento, e la perdita di risposta alla stimolazione toe-pizzico. </li><li> Immediatamente prima di imaging, somministrare 150 mg / kg di peso corporeo D-luciferina mediante iniezione ip (10 ml di 15 mg / ml luciferina / g di peso corporeo). </li><li> Utilizzare un sistema di imaging bioluminescenza in vivo per catturare 2 serie di immagini sequenziali con 30, 60 e 90 sec esposizioni e un&#39;immagine finale con esposizione 120 sec. Dopo l&#39;imaging, i topi ritorno alle gabbie e monitorare per il recupero dall&#39;anestesia. A seconda dellaintensità di bioluminescenza, tempi di esposizione possono essere variati. Tempi di esposizione ottimale dovrebbe essere predeterminati per un determinato modello e continuino a concordare tale che le intensità di segnale per i singoli punti temporali sono comparabili in tutta l&#39;intero studio. </li><li> Determinare l&#39;intensità bioluminescenza per ogni mouse utilizzando Salone Immagine 3.2 software di acquisizione e analisi. Determinare i valori di flusso totale misurato in fotoni / secondo disegnando regioni di interesse (ROI) di dimensioni identiche per ciascun topo. </li><li> Sacrificare topi da CO 2 esposizione e dislocazione cervicale se moribonda, esponendo paralisi, in caso superiore al 15% di perdita di peso, o alla fine dello studio. Sezionare topi e le osservazioni dei record (ad esempio l&#39;allargamento della milza, fegato, linfonodi, o pallido midollo osseo). Sezionare femori e del midollo osseo a filo con PBS freddo utilizzando un ago G 27. </li><li> Raccogliere le cellule in una microcentrifuga a 2500 rpm per 5 min. Risospendere le cellule in PBS contenente 2% FBS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.Raccogliere le cellule e macchia con 20 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato, 1:1.000) e FITC-coniugato α-hCD45 (1:100) o IgG di topo anticorpo di controllo 1 isotipo (1:100) . Valutare la leucemia attecchimento con citometria a flusso. Gate sulla popolazione vitale (DAPI negativo) e determinare la percentuale di cellule CD45 + (blasti% midollo osseo). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione di nuovi inibitori della tirosina chinasi nel trattamento della leucemia acuta. Usando questo approccio, attività biochimiche e anti-leucemici vengono valutate prima in saggi cellulari in vitro e in modelli di xenotrapianto in vivo. Analisi immunoblot è stato utilizzato con successo per dimostrare l&#39;inibizione della chinasi tirosina bersaglio in cellule leucemiche dopo trattamento con TKI e di confrontare la potenza dei compost...

Leucemia linfoblastica acuta (ALL) è il tumore maligno più comune nei bambini 1,2. Il tasso di sopravvivenza globale per pediatrica TUTTI I B-lignaggio (B-ALL) è circa il 85%, ma sottotipi biologici specifici, tra cui T-LAL (T-ALL), hanno ancora peggiore prognosi, anche con gli attuali protocolli terapeutici. L&#39;ulteriore trattamento di recidivato ALL rimane una sfida 3. Sebbene la maggior parte dei pazienti adulti con leucemia acuta ottenere una remissione con up-front chemioterapia, molti pazienti soffrono ancora ricaduta 4. Regimi chemioterapici attuali nel trattamento della leucemia acuta sono noti per causare effetti collaterali a breve e lungo termine, tossicità associata. Pertanto, le terapie meno tossiche che colpiscono specificamente le cellule tumorali con effetti minimi sui tessuti normali sono molto necessari. Negli ultimi anni, l&#39;accento è stato posto sullo sviluppo del romanzo, agenti molecolare mirate con specificità per le cellule tumorali, spesso utilizzando la chimica iterativoper generare più composti attivi che devono poi essere comparati e la priorità 5. Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione pre-clinica di TKIs per il trattamento della leucemia acuta, che può essere utilizzato per la valutazione di un singolo composto o per confronto diretto dei composti multipli al fine di facilitare lo sviluppo della droga. Il metodo qui presentato consiste in quattro fasi. Prima della biochimica (1) e anti-leucemia (2) attività del composto (s) vengono valutate in coltura cellulare, allora inibizione del bersaglio viene confermata in modelli animali (3), e l&#39;efficacia terapeutica finalmente del TKI (s) è determinata in modelli di xenotrapianto leucemia ortotopico (4). Per questi studi, è importante scegliere linee cellulari aventi il ​​rappresentanti dei sottotipi biologici più comuni. Le linee cellulari devono essere selezionati, che entrambi, esprimono il target di interesse e manca il bersaglio di interesse, per indagare se gli effetti biologici sono medIATED attraverso l&#39;inibizione del target. Questo è particolarmente importante per lo sviluppo di piccole molecole inibitrici, che hanno effetti off-target che possono essere importanti per l&#39;attività anti-tumorale. È inoltre necessario scegliere una linea cellulare che dipende dal bersaglio per effetti funzionali quali la proliferazione o la sopravvivenza. Studi di validazione obiettivo preliminari (al di fuori del campo di applicazione del presente articolo) utilizzando RNA interference o altri mezzi specifici per inibire l&#39;obiettivo possono essere utilizzati per identificare le linee di cellule bersaglio-dipendente. E &#39;inoltre opportuno scegliere linee cellulari che possono formare xenotrapianti murini, in modo tale che i risultati delle colture di cellule possono essere più direttamente tradotti in esperimenti in vivo. Per la valutazione della attività biochimica mediata da TKIs nelle cellule leucemiche, una diminuzione della fosforilazione del recettore può essere utilizzato come indicatore di inibizione bersaglio. Analisi Western blot o ELISA saggi possono essere utilizzati, a seconda della disponibilità e specificità degli anticorpi.Se gli anticorpi con sufficiente specificità per il bersaglio sono disponibili, saggi ELISA sono preferibili in quanto sono più quantitativa ed efficiente. Nei casi in cui gli anticorpi con specificità sufficiente per ELISA non sono disponibili, western blot può essere necessario. In questo caso, immunoprecipitazione di una grande quantità di lisato può essere utile per la rivelazione di bersagli che sono in bassa abbondanza. Questo approccio è particolarmente rilevante per la misura di fosfo-proteine, che possono avere una breve emivita per consentire rapidi cambiamenti nella segnalazione in risposta a stimoli ambientali. Alcune proteine ​​fosforilate sono estremamente labile, molto probabilmente a causa della formazione di complessi con fosfatasi. Per il rilevamento robusto e coerente di queste proteine ​​fosforilate, può anche essere possibile trattare le cellule con pervanadate, un inibitore della proteina-tirosina fosfatasi irreversibile 6, per stabilizzare la proteina-fosfo prima della preparazione di lisati di cellule intere. Adeterminare se l&#39;attività biochimica provoca effetti anti-tumorali, processi biologici bersaglio-dipendenti possono essere monitorati in esperimenti basati su celle. Per le linee di cellule di leucemia, l&#39;attività anti-leucemia mediata da TKI può essere valutata mediante saggi formazione di colonie effettuati in metilcellulosa o soft agar 7. Soft agar può essere preferito in quanto si tratta di un terreno solido che è più suscettibile di manipolazione, se è necessario il trattamento ripetuto con un TKI. Mentre molti myloid leucemia (AML) linee cellulari acute formeranno colonie in agar morbido, la maggior parte tutte le linee cellulari saranno solo formano colonie in metilcellulosa, che è un mezzo semisolido. Anche se è possibile ricaricare medio e / o TKI in culture metilcellulosa, solo piccoli volumi possono essere usate e con frequenza limitata. Allo stesso modo, è più difficile da macchiare colonie senza interrompere in metilcellulosa. Studi preliminari dovrebbero definire la capacità delle linee cellulari idonee a formare colonie in metilcellulosa e / o agar morbido e tegli densità ottimale delle cellule in coltura in modo che le colonie non si sovrappongono e in numero sufficiente per ottenere statisticamente dati (normalmente 50-200 colonie per piastra da 35 mm Piastra). Mentre i test in vitro sono robusti e conveniente, e hanno meno implicazioni etiche di esperimenti sugli animali interi, l&#39;avanzamento di composti terapeutici richiede la prova di efficacia e sicurezza nei modelli animali. Per gli studi in vivo, linee cellulari di leucemia acuta umani possono essere ortotopicamente trapiantate in NOD.Cg-Prkdc SCID I l2rg tm1Wjl / SzJ (GFN) topi e TKI possono facilmente essere somministrati per iniezione o sonda gastrica. Alcune linee cellulari possono richiedere l&#39;esposizione di topi dell&#39;NSG ad una dose bassa linea cellulare-dipendente di radiazione al fine di xenotrapianti di stabilire, e in questo caso topi possono non tollerare gavage orale senza un periodo di recupero 5-10 giorni post-irradiazione. Questo manoscritto descrive generazione di B-ALL e T-ALL xenotrapianti usandolinee cellulari specifici (697 e Jurkat) come esempi ma xenotrapianti, possono essere stabilite topi dell&#39;NSG usando un&#39;ampia varietà di linee cellulari. Nel caso in cui altre linee cellulari sono più applicabili, il requisito per irradiazione, numero ottimale di cellule da trapiantare, ei tempi di insorgenza e la progressione della malattia deve essere determinato sperimentalmente. Idealmente, questi modelli avranno penetranza completa (ogni animale trapiantato sviluppa la leucemia), cinetica consistenti (leucemia progredisce in modo simile in tutti gli animali), e una finestra di trattamento ragionevole (idealmente 20-30 giorni tra l&#39;inizio del trattamento e la rimozione dallo studio a causa di malattia) . Il numero di cellule trapiantate può essere aumentata per migliorare penetranza e coerenza cinetica o diminuito per migliorare la finestra trattamento se necessario. Per determinare se TKI mediano l&#39;inibizione bersaglio in vivo, i campioni vengono prelevati da topi con xenotrapianti leucemia dopo il trattamento con TKI o unico veicolo. Idealmente, la dosed schema di somministrazione per questi esperimenti sono guidati da studi di farmacocinetica, che spesso possono essere eseguite da laboratori commerciali e che sono al di fuori del campo di applicazione del presente articolo. Se non sono disponibili dati di farmacocinetica, la concentrazione del composto richiesta per un&#39;efficace inibizione porta in coltura cellulare e la massima concentrazione sierica dopo una singola dose di TKI può essere utilizzata per definire la dose iniziale per studi sugli animali. Gli studi di farmacocinetica possono anche informare il momento della raccolta del campione di post-trattamento per gli studi di farmacodinamica e la via di somministrazione. L&#39;inibizione del target può essere valutata in qualsiasi organo interessato, ma i tessuti che sono più facilmente raccolti e trattati sono preferibili. Linee cellulari leucemiche più acuti stabilire nel fegato, midollo osseo, milza, sangue periferico e il sistema nervoso centrale, sebbene gli organi specifici interessati e la misura di attecchimento in questi organi varia tra modelli. Il protocollo presentato qui valuta fosfinibizione o-proteine ​​nel midollo osseo mediante analisi Western Blot, ma organi solidi possono essere più facili da raccogliere in modo coerente e richiedono un trattamento minimo o nullo prima del congelamento, consentendo meno opportunità per la degradazione di fosfo-proteine ​​durante la raccolta e l&#39;elaborazione del campione. Immunoistochimica può anche essere utilizzato per valutare tumori solidi o organi affetti da leucemia. Infine, l&#39;efficacia terapeutica del TKI (s) è determinata in modelli di xenotrapianto ortotopiche leucemia. Per questi studi, i tempi di inizio trattamento può essere variata, in modo che malattia è più o meno stabilita. Il trattamento può iniziare immediatamente dopo il trapianto per gli studi iniziali e poi essere in ritardo negli studi successivi fino a quando viene rilevato un carico di malattia significativa per approssimare più da vicino un modello di trattamento diagnostico. Idealmente, questi modelli animali hanno anche la capacità di misurazione non invasiva del carico di malattia. Abbiamo ottimizzato i metodi per l&#39;introduzione del lucifer lucciolaase gene in linee cellulari di leucemia utilizzando particelle virus-simili, consentendo non invasivo, analisi longitudinale di insorgenza della malattia e la progressione e la valutazione del carico di malattia nel midollo osseo e di organi solidi. Fondamentale per questo approccio è l&#39;uso di linee cellulari luciferasi targhetta monoclonali per prevenire variabilità nello sviluppo di luciferasi che esprimono leucemia associato all&#39;uso di linee cellulari policlonali ed è correlato al trattamento con TKI 8. Presi insieme, questi passaggi possono essere utilizzati per la valutazione di un singolo TKI o per il confronto diretto e il posizionamento di più TKIs. Mentre i protocolli qui presentati si concentrano sullo sviluppo di TKI, questi metodi possono essere adattati ad altri obiettivi e considerazioni per lo sviluppo di analisi sono descritti. Così, questa strategia può essere più largamente applicabile alla valutazione preclinica di agenti molecolarmente mirati per il trattamento della leucemia acuta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

Chinasi recettore tirosina sono stati implicati nello sviluppo e nella progressione di molti tumori, compresi sia leucemie e tumori solidi, e sono interessanti bersagli terapeutici druggable. Qui si descrive una strategia in quattro fasi efficiente per la valutazione pre-clinica di inibitori della tirosina chinasi (TKI) nel trattamento della leucemia acuta. Inizialmente, l&#39;analisi western blot è usato per confermare l&#39;inibizione bersaglio in cellule leucemiche in coltura. Attività funzionale viene quindi valutata mediante saggi clonogenici in metilcellulosa o culture soft agar. Composti sperimentali che dimostrano l&#39;attività in cellule saggi di coltura vengono valutate in vivo utilizzando NOD-SCID-gamma (NSG) topi trapiantati ortotopicamente con linee di cellule di leucemia umana. Vivo studi farmacodinamici iniziali nel valutare l&#39;inibizione di destinazione in blasti leucemici isolate dal midollo osseo. Questo approccio viene utilizzato per determinare la dose e lo schema di somministrazione necessaria per un efficace bersaglio inibizioneione. Studi successivi valutare l&#39;efficacia della TKI in vivo utilizzando luciferasi che esprimono cellule leucemiche, consentendo in tal modo non invasivo monitoraggio bioluminescente di carico leucemia e valutazione della risposta terapeutica mediante un sistema di imaging in vivo in bioluminescenza. Questa strategia è stata efficace per la valutazione dei TKI in vitro e in vivo e può essere applicata per l&#39;identificazione di agenti molecolarmente mirati con potenziale terapeutico o per confronto diretto e la prioritizzazione dei composti multipli.

I saggi qui presentata si valutano gli effetti biochimici e funzionali mediati da TKI e possono essere utilizzate per classificare nuovi composti in base al grado di inibizione bersaglio in vitro e in vivo, riduzione della formazione di colonie, e il ritardo nella leukemogenesis in topi trapiantati con dell&#39;NSG luciferasi- tagged cellule leucemiche. Analisi immunoblot è stato utilizzato per determinare l&#39;inibizione della forma fosforilata attiva della proteina bers...

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Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Chinasi recettore tirosina sono ectopica espresso in molti tumori e sono stati identificati come bersagli terapeutici nella leucemia acuta. Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione pre-clinica degli inibitori della tirosin-chinasi per il trattamento della leucemia acuta.

Valutazione pre-clinica della tirosina chinasi inibitori per il trattamento di leucemia acuta

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

pre-clinical-evaluation-tyrosine-kinase-inhibitors-for-treatment

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Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

18.0K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Chinasi recettore tirosina sono ectopica espresso in molti tumori e sono stati identificati come bersagli terapeutici nella leucemia acuta. Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione pre-clinica degli inibitori della tirosin-chinasi per il trattamento della leucemia acuta. 