LWE ור.ק. נתמכים על ידי המוסד האמריקאי הלאומי לבריאות מענקי R37 NS033506-16 ו R01 NS060699-03. MPT נתמכה על ידי מלגת אגודת אמריקנית לסרטן דוקטורים מחקר (PF-10-057-01-MPC). העצות והידע של ד&quot;ר מתיו ויימן ד&quot;ר אורן Kobiler סייעו בעיצוב תצורת המיקרוסקופ ושיטות הדמיה תא חיות. אנחנו גם להרחיב בזכות בארלו ניל ובריאן קין ט של ניקון מכשירים לסיוע הטכני שלהם ברכישה, ההתקנה והביצוע של המיקרוסקופ.

סעיף 1 - תנאי בקרה סביבתיים למיקרוסקופ פלואורסצנטי Live-תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 דקות לפני כל ניסוי הדמיה להתחבר ולהתחיל לחמם את המיקרוסקופ השלב העליון החממה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ, מקורות אור מועברים וepifluorescent, ופקדי חומרה אוטומטיים. פתח את תוכנת בקרת מיקרוסקופ, אלמנטי ש&quot;ח, כדי להתחבר למיקרוסקופ ולהתחיל קירור המצלמה EM-CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף עדשות חמה יותר למטרה המתאימה (או 60x או טבילת שמן 100X). הערה: בחר עדשה אובייקטיבית המבוססת על סוג הניסוי. התערבות ההפרש לעומת זאת 100X (DIC) היא הטובה ביותר עבור מעקב של מכלולי virion הובלת אנטרוגרדית תוך מטרת שלב 60x מתאימה כדי להמחיש התפשטות אנטרוגדית. ההגדלה נמוכה, טבילה מטרות שאינן נפט אינן דורשות עדשה חמה יותר כמו שהם לא ליצור קשר ישיר עם המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף שלב חממה עליונה על הבמה הממונעת של מייל<html> croscope. להבטיח את התותב המתאים שיקיים המדגם נמצא במקום. צרף את קו אוויר humidified משליטת החממה ליציאת הקלט על הבמה העליונה החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל חממה ועדשת פקדים חמים יותר ולהתאים את הגדרות לתנאי טמפרטורה מאומתים עבר ספציפיים למטרה והדוגמא שצלמה (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שסתום הבקרה על 5% CO 2/95% טנק אטמוספרי כדי לספק אוויר CO 2 בתוספת לשלב חממה עליונה. קצב הזרימה צריך להיות בין 60 ל 80 מ&quot;ל של גז לדקה. שיעורים מהר יותר יגרמו להתייבשות מדגם נרחבת למרות קאמרי humidifying. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שמן עדשה לעדשה אובייקטיבית ולמקם את התרבות שיהיה צילמו לשלב העליון החממה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר איזון של טמפרטורה בתרבות למינימום של 10 דקות. שעה אחת עדיפה, במיוחד עבור ההדמיה הלילה המתוארת בסעיף 3. </li></ol>ve_title &quot;&gt; סעיף 2 - הדמיה בזמן אמת של פרוטוקול התחבורה virion אנטרוגרדית אירועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שש עד שמונה שעות לפני ההדמיה, להדביק צלחת 35 מ&quot;מ coverslip התחתון של נוירונים SCG בוגרים, ניתק עם 1 x 10 6 יחידות פלאק להרכיב של הנגיף של עניין (ראה טבלת מס &#39;1 לוירוסים לדוגמה), תוך שימוש בשיטה המתוארת בטיילור ואחרים אל. 2012a 11. אם בדיקת וירוס אחד או יותר, חיסונים קיזוז על ידי 30-60 דקות, כדי לאפשר הדמיה של דגימות רציפות בזיהום הודעה פעמים דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס לתוך צלחת שלב העליונה חממה למינימום של 10 דקות לפני הפעלת כל ניסוי. בעוד טמפרטורת equilibrates, מישור המוקד עובר ויהיה להשפיע לרעה על כל ניסויי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אור מועבר והעינית של המיקרוסקופ, למצוא גוף תא עצבי שיש לו סיומת axonal בבירור מבודדת. לחלופין, השתמש בתאורה המתאימה לקרינה למצוא תא להביע detecכמויות טבלה של חלבוני ניאון. חשוב להגביל את החשיפה של מדגם לתאורת פלורסנט, בשלב זה והשלבים הבאים, בגלל נזק לתאים מושרה אור והלבנה של חלבוני ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליש תאורת הקרינה כדי להפחית את עוצמת אור עירור לתאים שנחשפים. לעסוק אור הממתן צפיפות ניטרלי (ND) במסנני הקרינה נתיב אור התאורה. עבור סרטים שנמשכים יותר מ 1 דקות, מינימום של ND4 חייבים לשמש כדי למנוע צילום הלבנת של חלבוני ניאון ותמונות נזק של אקסונים נרחבים. מבנים מאוד ניאון בדרך כלל יכולים להיות דמיינו עם מסנן ND8 במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת מיקרוסקופ (איור 2 ומשלימת הסרט 1A), להדליק את האור, הדרך למצלמה EM-CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע זמני הדמיה אופטימליים ותנאים לכל ערוץ ניאון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום חלון תמונה חי באמצעות כפתור &quot;הפעל&quot;. &lt;/ P&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הגדרות חשיפת המצלמה האופטימליות עבור כל חלבון פלואורסצנטי. לא תעלה על 300 אלפית שנייה לכל ערוץ כסטיות motional של מבני virion זזו מהר יתרחש. לנצל את רווח EM של המצלמה להגדרה של 300 (יצרן הציע רווח מרבי), כדי לצמצם את זמן חשיפה ולשפר את זיהוי של אותות עמומים. זמני חשיפה נכונים צריכים לייצר תמונה עם רקע בעוצמה נמוכה ואותות ספציפיים גבוהים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגדרת חשיפות ומציאת אזור מוגדר היטב של האקסון, יש להגדיר את התוכנה כדי לבצע רכישת תמונה אוטומטית. עצור את חלון ההדמיה לחיות כדי למנוע הלבנת מדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת אלמנטי ש&quot;ח, בחר 6 ד - הגדר / הפעלת יישום ניסוי מירידת &quot;יישומים&quot; למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון רכישת ND, לחץ על כרטיסיית הזמן שתקבע את תדירות רכישה של תמונה. הגדר את המרווח ל&quot; אין עיכוב &quot;ואת משך הזמן עד 5 דקות. הלאחר מכן תוכנת דואר תרכוש מסגרות תמונה בתדירות הגבוהה ביותר האפשרית עבור משך זמן של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;למבדה&quot;, המאפשרת בחירה של תצורות החומרה שנקבעו מראש המשמשות לרכישת תמונת ניאון מרובה. לחץ על התיבה הראשונה ולאחר מכן בירידה למטה בתפריט כדי לבחור תצורת חומרה מתאימה. חזור על פעולה עבור כל חלבוני הניאון להיות צלמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח את הכרטיסיות לפוזיציות &quot;XY&quot;, &quot;Z-סדרה&quot; ו &quot;תמונה גדולה&quot; הן דה שנבחרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעל לכרטיסיות, בחר בתיבה המסומנת &quot;שמור לקובץ&quot; כדי לשמור את התמונות באופן אוטומטי לדיסק הקשיח במהלך רכישה. הגדר את המיקום ואת שם קובץ של קובץ פלט הניסוי. כניסויים רציפים מבוצעים, התוכנה תוסיף את מספר סידורי בסוף שם הקובץ המיועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הכרטיסיות שנבחרו. ליזום את הניסוי על ידי לחיצה על הכפתור &quot;Run-עכשיו&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את קצב רכישת התמונה דרך הגדרות חשיפה ומתאר לעצמיגודל דואר. שימוש באזור קטן של שטח תמונה, מסוגל לעתים קרובות להאיץ את שיעורי רכישת מסגרת. הגדר את האזור של עניין באמצעות כלי ההחזר על ההשקעה בש&quot;ח-אלמנטים, בחירת אזור שבין 25% ל 50% משטח התמונה הכולל. לחלופין, זמני חשיפה קצרים יותר יגדילו את שיעורי רכישת מסגרת, אבל מקטין את איכות האות (ראה דיון). </li></ol></li></ol> סעיף 3 - זמן לשגות הדמיה של אירועי לילה מורחים אנטרוגדית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבע שעות לפני הדמיה, להדביק תרבות עצבית ממודרת נבנתה על 35 מ&quot;מ μ-תבשיל. לחסן גופי תאים עצביים עם 1 x 10 6 יחידות פלאק להרכיב של הנגיף של עניין (ראה טבלת מס &#39;1 לוירוסים לדוגמה), תוך שימוש בשיטה המתוארת בטיילור et al. 2012b 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות צלחת התרבות לשלב העליונה החממה. ודא את המיקום של המטרה מוגדר לצד המנה. לאט לאט מביא את המטרה אל מוקד, ensuring האובייקטיבי לא לדחוף לתוך המדגם. ברגע ששדה המיקוד זוהה, לנוע באיטיות במטרה למרכז הצלחת, ליד המחסום הפנימי demarking הצד הפנימי של תא האקסון. במהלך תנועה, להבטיח את עומק המיקוד נשמר ולהימנע מלדחוף לתוך המדגם. סטייה של משטח הפלסטיק על ידי המטרה תגרום ניזק לאקסונים והפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כ -2 מ&quot;ל של חם (~ 37 מעלות צלזיוס) בופר פוספט למנת התרבות חיצונית של טבעת הטפלון. זה מקיף את התרבות העצבית עם טבעת של PBS כדי למזער את ההתייבשות לדוגמה ומספקת בידוד תרמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר טמפרטורה לאזן עבור מינימום של שעה 1 לפני ייזום רכישת תמונה אוטומטית (3.8). שלבים 3.5 עד 3.7 יכולים להיות מוגדרים בתקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביל את עוצמת התאורה לרמה הנמוכה ביותר האפשרית על ידי העוסק כל מסנני הצפיפות ניטראליים. זה יאפשר רכישת תמונה תכופה oveפרקי זמן ארוכים ללא תמונה r-נזק מוגזם. הפחתת תאורה תגרום לאות נמוכה, הדורשת חשיפה ארוכה יותר (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהגדרות חשיפה היסטורי או לפני ניסיוני ההגדרה ליצור מנה מקבילה של תאי האפיתל נגועים להביע את חלבוני ניאון היעד להקים הגדרות חשיפה כמתואר בסעיף 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגדרת חשיפות לאפיקים הדרושים, זה זמן להגדיר את התוכנה לרכישת תמונה אוטומטית. עצור את חלון ההדמיה לחיות להגביל מדגם הלבנת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת אלמנטים (איור 2 וסרט משלים 2), בחר 6 ד - הגדר / הפעלת יישום ניסוי מהירידה &quot;יישומים&quot; למטה בתפריט כדי להעלות את חלון רכישת ND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון רכישת ND, לחץ על כרטיסיית השעה. הגדר את המרווח ל&quot; 5 דקות &quot;. הגדר את משך הזמן עד 20 שעות. שדה הלולאות יחושב באופן אוטומטי למספר חזרות prograמ &#39;יבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;למבדה&quot;. לחץ על התיבה הראשונה ולאחר מכן בירידה למטה בתפריט בחר בתצורה המתאימה למבדה בניגוד שלב. חזור לעמדות שלאחר מכן, בחירת התצורות המתאימות לכל חלבון פלואורסצנטי להיות צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;התמונה גדולה&quot;, הקובעת את הפרמטרים של מספר רב של תמונות כדי להיות משולבים לתוך שדה אחד גדול של נוף. אזור טוב בגודל מורכב 5 תמונות x 2 באמצעות חפיפה תפרים 7%. זה יאפשר למספר המרבי של תאים לכל עמדה להיות צילמו מבלי להשפיע על התדר של רכישת תמונה. כמו כן, בטל את סימון התיבה עבור &quot;תריס פעיל סגור במהלך תנועת הבמה&quot;. אפשרות זו משפרת את המהירות של רכישה על ידי לא סוגר תריסים בין תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;XY פוזיציות&quot;, כדי לזהות מספר רב של עמדות שיהיה צלמו ברצף במקביל במהלך הסרט בין לילה. בחר עמדות המגדירות את פו המרכזint עבור כל אזור בתמונה גדול. בחר 6-8 עמדות תמונה במדגם. שטח תמונה טוב יהיה אשכולות קטנים של תאים בפרד קרוב לאקסונים מוגדרים בבירור. תאים לא צריכים להיות נערם זו על גבי זו bundling האחרת והאקסון צריך להיות ממוזערים. נקודת המיקוד היא גרעין התא. מקם את המטרה כך שמעטפת גרעין מוגדר היטב נתפס עבור רוב התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח את הלשונית &quot;Z-הסדרה&quot; אינה מסומנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התכונה &#39;שמירה אוטומטית כאמור לעיל בסעיף 2.6.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את החשיפה והגדרות מיקום על ידי לחיצה על &quot;זמן הלולאה 1&quot;. להעריך את התמונות משודר לתאורת אור, מיקוד ומסגור כתוצאה מכך. אם המיקוד השתנה, לאפס את המוקד לכל עמדה תחת לשונית XY. חכה 10 דקות ולחזור על פעולה זו עד שהדגש הוא יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אומתו את כל ההגדרות ונבדקו, ליזום ניסוי האוטומטי על ידי לחיצה על הכפתור &quot;הפעל כעת&quot;. </li></ol></li&gt; </ol> עיבוד תמונה ויצוא - סעיף 4 נתוני יצוא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכי נתונים שהושגו במהלך לחיות תאי הדמיה של אירועי תחבורה או התפשטות צריכים להיות מיוצאים מהתוכנה שקל אלמנטים לסוגי קבצים בשימוש נפוצה לשימוש מאוחר יותר במצגות ופרסומים (משלימה סרט 3). כדי לייצא סרטים לפתוח את הקובץ המתאים nd2 הגלם. באלמנטי ש&quot;ח ובחר את התצוגה &quot;פיצול המרכיב&quot; כדי להמחיש את ערוצי הניאון הרצויים. השמעת הקובץ במהירות מתאימה, 5 מסגרות לשנייה היא נקודת התחלה טובה להדמיה של תחבורה מהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל חותמת זמן כדי לייצג את שעון בזמן אמת בעת צפייה בסרט. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר, הוסף ND-מידע. מונה דיגיטלי יופיע בפינה השמאלית העליונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערוך את חותמת הזמן כדי להציג את המידע. לחץ לחיצה ימנית על הדלפק ובחר עריכת ND-מידע. בחלון הקופץ שלאחר מכן, ערוך את הטקסט כדי לשקף Imagiפרמטרים ng שחשובים. עריכת גופן, צבע וגודל לבהירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכו לתפריט &quot;ערוך&quot; ולמצוא את &quot;יצירת תמונת מצב תצוגה&quot; או לחץ על המקש &quot;X&quot;. פקודה זו פותחת את החלון &quot;תצוגת תמונת המצב&quot;. בחר &quot;תחול על כל המסגרות&quot; לייצר 8 סיביות, RGB, קובץ יצוא מוכן המכיל את ערוצי ניאון מכל הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור כקובץ. אבי עבור תאימות בין הפלטפורמה. קבע שיעור השמעה ב 200 אלפיות שנייה לכל מסגרת. את קבצי AVI. נוצרו על ידי אלמנטי ש&quot;ח אז ניתן לדחוס עוד יותר עם תוכנת המרה אחרת לסוג הקובץ הרצוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, D. C., Baines, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+remodel+host+membranes+for+virus+egress.">Herpesviruses remodel host membranes for virus egress.</a> Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).</li><li>Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesvirus+assembly:+a+tale+of+two+membranes.">Herpesvirus assembly: a tale of two membranes.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).</li><li>Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+accumulation,+envelopment,+and+exit+in+growth+cones+and+varicosities+in+mid-distal+regions+of+axons.">Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons.</a> Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).</li><li>Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+Simplex+Virus+Capsids+Are+Transported+in+Neuronal+Axons+without+an+Envelope+Containing+the+Viral+Glycoproteins.">Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).</li><li>Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+gE/gI+and+US9+proteins+promote+transport+of+both+capsids+and+virion+glycoproteins+in+neuronal+axons.">Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons.</a> Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).</li><li>Tomishima, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins.">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+case:+Married+versus+Separate+models+of+alphaherpes+virus+anterograde+transport+in+axons.">Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons.</a> Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).</li><li>Antinone, S. E., Smith, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+herpesvirus+trafficking+in+neurons:+membrane+acquisition+directs+motion.">Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).</li><li>Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+a+fluorescent+tegument+component+in+single+pseudorabies+virus+virions+and+enveloped+axonal+assemblies.">Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies.</a> Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).</li><li>Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+an+alphaherpesvirus+membrane+protein+that+is+essential+for+anterograde+axonal+spread+of+infection+in+neurons.">Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons.</a> mBio. 3 (2), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+axon-to-cell+spread+involves+limited+virion+transmission.">Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesvirus+replication+compartments+originate+with+single+incoming+viral+genomes.">Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes.</a> mBio. 2 (6), (2011).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection.">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).</li><li>Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmented+neuron+cultures+for+directional+infection+by+alpha+herpesviruses.">Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).</li><li>Zareen, N., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+culturing+sympathetic+neurons+from+rat+superior+cervical+ganglia+(SCG).">Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG).</a> J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).</li><li>Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-to-Cell+Spread+of+Pseudorabies+Virus+in+a+Compartmented+Neuronal+Culture+System.">Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System.</a> Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).</li><li>Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+compartmented+cultures+of+rat+sympathetic+neurons.">Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).</li><li>Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-3+Mediates+Axonal+Sorting+and+Directional+Transport+of+Alphaherpesvirus+Particles+in+Neurons.">Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons.</a> Cell Host &amp; Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).</li><li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+use+bidirectional+fast-axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons.">Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).</li><li>Kramer, T., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphaherpesvirus+Infection+Disrupts+Mitochondrial+Transport+in+Neurons.">Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Cell Host &amp; Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).</li><li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution.">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).</li><li>Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+Hippocampal+Neurons+in+Culture.">Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

המטרה של הדמיה תא החי היא התבוננות בתהליכים ביולוגיים כפי שהם מתרחשים ללא שינוי משמעותי על ידי הפעולה של התבוננות. מטרה זו מושגת על ידי אופטימיזציה של שלוש משתנה: איכות סביבה, מהירות של הדמיה, ותאורת פלואורסצנטי. משתני היתר תלויים אלה חייבים להיות מאוזנת כדי להשיג תנ?...

זיהום של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) על ידי וירוסי alphaherpes כגון נגיף הרפס סימפלקס (HSV) -1, -2, ונגיף pseudorabies (PRV) כולל מספר שלבים מורכבים ופיקוח הדוק לאורך כל מחזור החיים של הנגיף. תחבורה בתוך הנוירונים של PNS היא קריטית באירועים של שניהם זיהום ויראלי ראשוני והתפשטות בין מארח שלאחר מכן. המנגנונים המולקולריים המווסתים שני מרכיבים של מחזור החיים של הנגיפים; התחבורה בבימויו של מכלולים נגיפיים הרחק מגופי תא בתוך אקסונים (הובלת אנטרוגרדית) והשידור הבא של virions לתאים רגישים (התפשטות אנטרוגרדית) הם חשובים להבנת הפתוגנזה ההרפס. התחבורה והיציאה של חלקיקים נגיפיים בתאי עצב תלוי בהרכבה של 1,2 virion זיהומית בוגר. מבחני בעבר קבועים, כולל immunofluorescence (IF) ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), שמשו כדי ללמוד את מדינת ההרכבה החלקיקים וprotאינטראקציות ein קשורות לתחבורת virion והתפשטות 3-6. עם זאת באופי הדינמי של virions ההובלה וממצאים ניסיוניים שהוצג על ידי קיבוע כימי מבולבל פרשנות קבועה תמונות 7,8. לאחרונה, מספר החלבונים נגיפיים היתוך-ניאון כבר תאר לHSV וPRV שיש השפעות זניחות על תפקוד חלבון. חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וחלבוני ניאון אדומים (mCherry או mRFP) fluorophores הם לזווג לעתים קרובות כדי לאפשר הדמיה של שתיים משלושת הרכיבים המבניים של virion בוגר: קופסית, קלפה, וגליקופרוטאין 9-11. לחיות הדמיה תא של התחבורה אנטרוגדית באמצעות וירוסים כפול שכותרתו מדמיין את מדינת ההרכבה של חלקיקים נגיפיים במהלך הובלה. fluorophore הדומה הביע זני נגיפים המשמשים לדמיין מספר והמגוון של הגנום נגיפי בעקבות התפשטות 12,13. את המאפיינים של חלבוני הניאון (הנסקרת ב 14,15) להשפיע באופן משמעותיהיכולת לדמיין מכלולים נגיפיים או סלולריים. את המאפיינים המהותיים של החלבון פלואורסצנטי, כולל אינטראקציות עצמיות ויציבות, יש לשקול בעת תכנון ובדיקת החלבון fusions חדשני לשימור טבע מהסוג פונקציונלי. בשיתוף עם איחודי חלבון פלואורסצנטי, שתי היטב מאופיינים במערכות תרבות תאים במבחנה מועסקים הדמיה תא חי של הידבקות בנגיף הרפס: 16 מנותקים וממודר 17 (איור 1 א) גרעיני עכברוש (SCG) נוירונים צוואר הרחם מעולים. בשתי המערכות, עוברי של SCG הם גזורים, ניתקו לגופי תא בודדים, ומצופה במבחנת culturing 18. נוירונים SCG הם חלק ממערכת העצבים האוטונומית ויכולים להיות מתורבתים בקלות ומובחן על ידי גורם גדילה עצבי (NGF) לvivo לשעבר המדינה מקוטבת בוגר. נוירונים SCG ניתקים יוצרים רשת מורחבת של האקסונים המאפשרת Fאו ההדמיה של חלקיקים נגיפיים כפי שהם עוברים הובלת אנטרוגרדית 6. תרבויות SCG ממודרים לספק בידוד fluidic של גוף התא העצבי (תא S) וTermini האקסון דיסטלי (תא N) 19. מספר הפרוטוקולים המפורטים לבנייה ולשימוש בתאי עצב ממודר באמצעות שונים Campenot תאי 17 או 20 מקורי כבר פורסם בעבר. בידוד Fluidic מאפשר לזיהום סלקטיבית של גופי תאים עצביים ואיתור של virions צאצאים לאחר ההובלה לטרמיני האקסון מבודד. ציפוי תאי האפיתל במשך טרמיני לפני ההדבקה מספק תאי נמען להתפשטות זיהום נגיפי. יש הרבה מרכיבים חיוניים חשובים לכל הניסויים ההדמיה התא חיים, אבל רלוונטי ביותר לפרוטוקולים שלנו הם: רכישה אוטומטית תמונה, תאורת ניאון, מהירות של הדמיה, ושליטה על הסביבה. עבור כל ניסויי ההדמיה, אנו משתמשים,, מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית epifluorescence תאורה (איור 1). מיקרוסקופ בנוי סביב ניקון אקליפס טי הבסיס ומעסיק מספר מערכות מחשב שבשליטת ממונעת למהירות להגדיר מחדש את המיקרוסקופ במהלך רכישת תמונה אוטומטית. תאורה הקרינה, אנו משתמשים במנורת קשת ספקטרום רחב כספית שיכולה להיות מוחלש עם מסנני צפיפות ניטראליים לאורך נתיב ההארה. מסנני עירור להגביל את הספקטרום של תאורת ניאון וכאשר יחד עם מראות dichroic מרובות עוברות ומסנני פליטת הקרינה לדמיין תרכובות ניאון ספציפיות. את מסנני העירור ופליטה הם רכובים בגלגלים עצמאיים, מהר מיתוג סינון כדי לאפשר רכישה רציפה מהירה של ערוצי ניאון שונים. המהירות של רכישת תמונה עוד יותר משופרת עם מצלמת CCD EM-רגישה ומהירה, שימושית לזיהוי של אותות בעצימות נמוכים ותדמית קצרה לקרוא פעמים. שליטה בסביבת microscאופ מושגת עם למעלה שלב חממה מחומם ודוד עדשת מטרה לשמור על דגימות בטמפרטורות גבוהות תוך אווירה מועשרת 2 CO humidified והוא עבר לחממה. מיקרוסקופ נשמר בחדר חשוך עם טמפרטורת הסביבה נשמר קרוב ל 25 מעלות צלזיוס ואור בחוץ ממוזערים עם וילונות האפלה על כל החלונות. הפרוטוקולים הבאים לתאר את השימוש במערכת זו להובלת אנטרוגרדית ומבחנים להתפשט. קיים מספר החלופות לשליטה למשתנים של הדמיה תא חי. השליטה על הגדרות מיקרוסקופיה יכולה להתבצע באופן ידני או באמצעות מערכות אוטומטיות תלויות בתוכנת קניינית. תאורת הקרינה ניתן להשיג עם ההלוגן, LED או מקורות לייזר. המהירות של הדמיה היא שונה על ידי המהירות של מיתוג מסנן ואת הזמן כדי להמחיש את האות עם מערכת זיהוי לזווג. בקרה סביבתית יכולה להיות מושגת באמצעות חומרה מיוחדת במיילשלב croscope, מתחם של חלק ממיקרוסקופ בתיבה מחוממת וhumidified או כל, או על ידי העלאת הטמפרטורה של החדר שבו מיקרוסקופיה תבוצע. כל אחת מחלופות אלה יש יתרונות וחסרונות הקשורים למחיר וביצועים. בפרוטוקול שלאחר מכן, אנחנו פירוט השימוש בהדמית תא חי ללמוד תחבורה אנטרוגדית מהירה והתפשטות של וירוסי אנטרוגדית alphaherpes באמצעות השימוש בזני נגיפי רקומביננטי. הדמיה תא חי בזמן אמת visualizes קופסית, קלפה ו / או גליקופרוטאין שיתוף לוקליזציה על מבנים דינמיים העוברים תחבורה בתוך 11 אקסונים. ההדמיה timelapse הלילה של תרבויות העצביות הממודרות מדמיין יציאה virion axonal וזיהום של תאים רגישים 12. הפרוטוקולים שהוצגו כאן כבר מותאמים לשימוש עם מערכת ההדמיה המסוימת שלנו, אבל מוצגים במונחים רחבים ביחס לארבעה היסודות של הדמיה תא חי. בדיון שהיינויפרט עוד כמה אופטימיזציה כי הוא הכרחי לניסויים מוצלחים.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm glass bottom culture dish</td>
 <td>MatTek Corporation; Ashland, MA </td>
 <td>P35G-1.5-20-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm &mu;-Dish </td>
 <td>Ibidi USA LLC, Verona, WI </td>
 <td>81156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope body </td>
 <td>Nikon Instruments Inc. </td>
 <td>Nikon Eclipse Ti</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized microscope X-Y stage</td>
 <td>Prior Scientific; Rockland, MA </td>
 <td>H117 ProScan Flat Top</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized filter wheels</td>
 <td>Prior Scientific</td>
 <td>HF110 10 position filter wheel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent illumination source </td>
 <td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada </td>
 <td>X-Cite 120Q </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-band Fluorescence filter sets</td>
 <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td>
 <td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td>
 <td>iXon3 897 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chamlide stage top environmental incubator</td>
 <td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td>
 <td>TC-L-10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective lens heater</td>
 <td>Bioptecs; Butler, PA</td>
 <td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Analysis software</td>
 <td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td>
 <td>NIS Elements </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread

התקדמות בטכניקות תא חי הקרינה מיקרוסקופיה, כמו גם הבנייה של זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון אפשרה להדמיה בזמן אמת של תעבורה והתפשטות של זיהום בנגיף alphaherpes של נוירונים. השירות של חלבוני היתוך ניאון רומן קרום ויראלי, קלפה, וcapsids, בשילוב עם הדמיה תא חי שנוצר על מכלולי חלקיקים נגיפיים העוברים תחבורה בתוך האקסונים. כלים דומים כבר מועסקים בהצלחה לניתוחים של תאי תאים פזורים של חלקיקים נגיפיים לכמת את המספר והמגוון של virions מועבר במגע בין תאים. חשוב לציין, בטכניקות של הדמיה תא החי של תחבורה והתפשטות אנטרוגדית לייצר שפע של מידע ובכלל מהירויות חלקיקי תחבורה, הפצות של חלקיקים, וניתוחים זמניים של לוקליזציה חלבון. לצד טכניקות גנטיות נגיפיות הקלסיים, מתודולוגיות אלה סיפקו תובנות קריטיותלשאלות מכניסטית חשובות. במאמר זה נתאר בפירוט את שיטות ההדמיה שפותחו כדי לענות על שאלות בסיסיות של תחבורה וירוס alphaherpes והתפשטות.

התחבורה אנטרוגדית יישום של פרוטוקול זה לזיהומים של תרבויות SCG ניתק עם PRV 348, זן PRV רקומביננטי לבטא חלבוני איחוי קרום GM-mCherry GFP-Us9 ו, יש להקל הדמיה של התחבורה אנטרוגדית של virions (איור 3 וסרט משלימה 4). שילוב של החלבונים האלה ההיתוך ?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread at JoVE.com

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

הדמיה תא חי של נגיף alphaherpes מאפשרת ניתוח של האירועים הדינמיים של תחבורה בבימויו והתפשטות בין תאית. כאן, אנו מציגים מתודולוגיות לנצל זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון כדי להקל על הדמיה של מכלולים במהלך הזיהום נגיפיים של נוירונים העיקרי.

הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

live-cell-imaging-alphaherpes-virus-anterograde-transport

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K Views.  Montana State University. הדמיה תא חי של נגיף alphaherpes מאפשרת ניתוח של האירועים הדינמיים של תחבורה בבימויו והתפשטות בין תאית. כאן, אנו מציגים מתודולוגיות לנצל זני נגיפי רקומביננטי המבטאים חלבוני היתוך ניאון כדי להקל על הדמיה של מכלולים במהלך הזיהום נגיפיים של נוירונים העיקרי.

Video: Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

לוציפראז-כתבת פלורסנט וירוס שפעת עבור הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

הדמיה חיה בזמן אמת של התחדשות בלוטה תת-לסתית של עכבר

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

מחבר זרקור: חקר אינטראקציות מקרופאג'-אפיתל בין תאים בהתחדשות בלוטת הרוק לאחר פציעה 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

חקירת אינטראקציות תאים-תאים בבלוטת הרוק באמצעות Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...