נתמך בחלקו על ידי NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI גרנט מספר UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, וג&#39;ואן ס הולמס זיכרון קרן המחקר. MJH וGCO קיבלו תמיכה מג&#39;ואן ס הולמס זיכרון דוקטורים המלגה באוניברסיטת קליפורניה. מכשיר CSM התקבל משיטות מדעיות Creative: www.creative-sci.com. וקטור lentiviral התקבל מאוניברסיטת UCLA וקטור Core, אשר נתמך על ידי DK041301 CURE / P30.

1. החלק הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס שקופיות סעפת שקיעה סלולארי לשקיות עיקור וחותם עם קלטת החיטוי. להתמודד עם הצד מצופה טפלון של שקופית נייר בצד של הנרתיק כדי למנוע פיקדונות פלסטיק על הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקיות החיטוי במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות מכיס עיקור בתוך ארון בטיחות ביולוגי ומקום בצלחת פטרי סטרילית סטרילי 150 x 15 מ&quot;מ. עד ארבע שקופיות יכולה להתאים לכל צלחת. מניחים צלחת פטרי 35 x 10 מ&quot;מ בסמוך לשקופיות. להוסיף 2-3 מיליליטר של H 2 O סטרילי כדי לספק לחלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות טרום מעיל עם פולי-D ליזין ב 100 מיקרוגרם / מיליליטר באמצעות נפח מספיק כדי לכסות את כל היטב. לאחר שעה אחת בRT, לשאוב את הפתרון ולשטוף את פני השטח של באר פעמיים על ידי pipetting 1x PBS על פני השטח של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להוסיף פיברונקטין או רכיבי ECM אחרים, כדי להבטיח עמידה בתאים סרטניים חזקות. להוסיף פיברונקטין בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר בנפח מספיק that הבארות יהיו לא יבש בתוך פרק זמן קצר בRT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לשאוב את פתרון השאריות ולשטוף פעמיים על ידי pipetting מעלה ומטה עם 1x PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור PBS על הבארות עד הגידול מוכן לציפוי. שימוש מחליק באותו היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר בקבוק ומחוברות מסוג התאים סרטניים חסיד הרצוי. ספירת תאי קיימא באמצעות הדרת צבע Trypan הכחולה על ידי מיקרוסקופ וresuspend אור ב 5 x 10 6 תאים / מיליליטר בדוגמא בינונית לצמיחה נאותה נאגרה, בינוני של Dulbecco המינימלי החיוני (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), L- גלוטמין ופירובט נתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה ניאון של אוכלוסיית התאים חסיד היא רצויה, לתייג אוכלוסיית תאים חסיד עם פלורסנט לצבוע חיוני או צבע התפשטות תאים על ידי ביצוע הפרוטוקולים מסופקים על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצורה חלקה פיפטה 10 μl של מדיום שלם לבאר כל טיפול השקופיות לוקחים כדי למנוע יצירת בועות בwells, כמו אלה יכולים למנוע דבקות של תאי גידול אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5-5.0 x 10 4 תאים (5-10 μl של השעיה תא) למדיום בכל טוב (איור 1 א). התאם את המספר האופטימלי בהתאם לסוג התאים סרטני ואת מספר הימים של צמיחה הרצויה. תאי גידול גדולים יותר או תאים גדלו במהירות עשויים לדרוש פחות תאים בתחילה. להביא גם נפח של עד 40 μl על ידי הוספה בינונית ופיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל הבארות הם זורעים, לאפשר לתאים הסרטניים לדבוק בRT, ואז למקם את המכסה על צלחת פטרי 150 x 15 מ&quot;מ ובזהירות להעביר את הצלחת לחממת humidified CO / 5% 37 ° C 2 לפחות 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מדיום התרבות יומי. זהירות פיפטה חלק של המדיום בילה מmonolayer ולהחליף עם מדיום מלא טרי. הערה: בגלל ההתאדות, יותר נפח תצטרך להוסיף יותר מהוצא. ולס יהיה מוכן לassay כאשר אפילו, conflהשכבה של תאי uent היא הווה. זה בדרך כלל 1-3 ימים לאחר זריעה ראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות monolayer פעם עם PBS כמתואר בשלב 1.4 וגם המשך לשלב 2 אם monolayers הוא רצויים, או לשלב 1.13 להלן כדי לחלץ חלבוני ECM מהשכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 0.5% Triton-X (v / v) פתרון בינוני מלא ולהוסיף 30 μl היטב כל אחד. בואו monolayer לעכל במכסת מנוע למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם מדיום שלם על ידי pipetting כפי שתואר לעיל. הערה: שכבת ECM יכולה להיות גלויה על ידי מיקרוסקופ אור (איור 2). השתמש בשקופיות מייד, או לשמור במדיום מלא בCO 2 באינקובטור humidified במשך 1-2 ימים. אל תאפשר בארות להתייבש. </li></ol> 2. שקיעה של תאי T שאינם חסיד על שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה ניאון של אוכלוסיית תאים שאינם חסיד היא רצויה, לתייג אוכלוסיות שאינן חסיד תא עם צבע פלואורסצנטי חיוני, כגון CFSE, Cell Tracker האדום CMPTX, או eFluor670 על ידי ביצוע הפרוטוקולים מסופקים על ידי יצרן השעה לפחות 1 מראש של assay. לחלופין, לתפעל תאים לבטא חלבוני ניאון המקודדים על ידי וקטורים ויראליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי סעפת שקיעת תא בכיס החיטוי כמתואר ב1.2 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תא humidified המכיל שקופיות מצופים טפלון מן החממה והמקום בארון בטיחות ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות עם 1x PBS על ידי pipetting מעלה ומטה, ולאחר מכן להוסיף 45 μl של מדיום שלם המכיל לפחות 10% בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסעפת ממעטפת העיקור ולהחליק בזהירות בלמעלה מ הבארות עד &#39;הוו&#39; בסוף הסעפת נוגע התחתון של השקופית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שמדיום התרבות גלוי בכל אחד מהערוצים. אם אף נראה, תוריד את הסעפת ולהוסיף עוד מדיום למתאים היטב, ולאחר מכן להחליף ולבדוק שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.5 עבור כל channel של הסעפת, או לבארות רבות ככל רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים וגלול שאינם חסיד בלא פחות מ 1.0-2.0 x 10 5 / μl. צייר את 1 μl של תאים ולאט לאט פיפטה אותם לערוץ (איור 1 ג). לעשות את זה עבור כל רצוי גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את כל מנגנון התא טעון, כלומר, סעפת ושקופיות, בתוך מכסה המנוע ביו-20-30 דקות, כדי לאפשר את התאים בערוץ להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסעפת על ידי הנגיעה בשני הקצוות ובעדינות להרים אותו ישר מהשקופית כדי לא להפריע לתאים שנזרעו focally במרכז הבארות (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק היטב כל אחד כדי להבטיח שאינם חסיד התאים כבר זורעים בהצלחה במרכז גם להישאר בתוך ההיקף של ערוץ הסעפת. אינם חסיד התאים יהיו באופן אידיאלי מעט לדבוק monolayer או ECM וזה לזה, ולכן בעדינות נעו סביב השקופיות לא יגרמו Pelle התאt להתפזר. לא להדחף השקופיות. </li></ol> 3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ציוד מתאים ניסיוני, לבצע ההדמיה לאחר שקיעה הוא אישר. באופן אידיאלי, להשתמש במיקרוסקופ המצויד בתא CO 2 ולחות. תמונה בצריכת חשמל נמוך, כלומר, 4X או 10X, כדי לאפשר למספר רב של תמונות שיש לנקוט משטח גדול יותר, כך שהשלמות של הבאר ניתן לראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות דיגיטליות באמצעות תוכנה ללכידה תמונה. בצע brightfield ו / או הדמיה הקרינה רבת-ערוצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, להגדיר זמן לשגות להקליט תמונות בערוצים שונים על פני שטח נתון, או לשמור את שקופיות humidified וב/ 5% חממת 37 ° C CO 2 וידניות להוציא לתמונה בנקודות הזמן הרצויה (איור 1E &amp; F, מומלץ לנקודות זמן ארוכות יותר). </li></ol> 4. ניתוח ותצוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת עריכת תמונות, למזג אור וflתמונות uorescent לסוגי תאי שכבה אחת כל כך מרובים וסמנים שניתן לראות באותה התמונה. גרור ושחרר את קבצי תמונה לכל צבע פרט לתכנית ו, כאשר תתבקשו לעשות זאת, בחר באפשרות &quot;הוסף Layer &#39;כדי ליצור קובץ תמונה עם מספר שכבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגדלה גבוהה יותר, לקחת, ליישר, ולתפור תמונות ברחבי גם באופן דיגיטלי. יישר קבצים ע&quot;י הסתכלות באזורים שמורים בין שתי תמונות וכיסו תמונה אחת על גבי השני עד תמונה שלמה נוצרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ברים מיקרון לתמונות במהלך רכישה באמצעות התוכנה ללכידה כדי לקבוע מרחק תאים בודדים היגרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את נדידת התאים בזמנים שונים, להפוך את מפות הקרינה בעוצמה משטח עם תוכנת תמונה, כלומר, ImageJ, לכמת צבירת תא T ניאון או משתרעים על פני זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור חלקות פני השטח, לקחת תמונה שכבתית שנוצרה בשלב 4.1 ומתחת לחלון השכבות,בטל את סימון כל השכבות מלבד אלה המקביל לערוץ הרצוי. לדוגמא, אם עלילת משטח רצויה לדמיין ביטוי EMD, רק השכבות &quot;הירוקות&quot; המתאימות למסנן המשמש לסמן זה צריכה להיות גלויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטח את התמונה ולשמור אותו בפורמט קובץ המוכר (לדוגמא, png) ולטעון את התמונה לתכנית. על מנת ליצור את עלילת המשטח, לשנות את סוג התמונה ל8-bit, לשנות את הבהירות / ניגודיות לפי צורך כדי להפחית את הרקע, ובחר באפשרות &#39;לנתח מגרש / שטח&#39;. התמונות באיור 5 נוצרו על ידי בדיקת &#39;הצל&#39;, &#39;צייר ציר &quot;,&quot; אחת מצולע לקו&#39;, ותיבות סימון &#39;Smooth &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לקחת מדידות באמצעות הרדיוס או קוטר מהפקדת תא המוקד בזמן אפס ולהשוות לתאים בנקודה המרוחקת ביותר בזמנים שונים. הקוטר של בארות הטפלון הוא 6.0 מ&quot;מ. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fascin+in+the+migration+and+invasiveness+of+malignant+glioma+cells.">The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells.</a> Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).</li><li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays.">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37 (2), 208-215 (2005).</li><li>Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+in+human+astrocytoma+migration+and+proliferation+studied+in+a+microliter+scale+assay.">The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay.</a> Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).</li><li>Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+membrane+cytoskeleton+cross-linker+ezrin+in+medulloblastoma+cells.">The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells.</a> Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).</li><li>Berens, M. E., Beaudry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+monolayer+cell+migration+assay.">Radial monolayer cell migration assay.</a> Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).</li><li>Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+human+astrocytoma+migration.">Determinants of human astrocytoma migration.</a> Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).</li><li>Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+attachment+and+morphological+differentiation+in+a+pheochromocytoma+cell+line+and+embryonal+sensory+cells+by+the+extracellular+matrix.">Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix.</a> Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Hickey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+preclinical+study+findings+to+protocol+design:+translational+studies+with+alloreactive+CTL+for+gliomas.">Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas.</a> Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).</li><li>Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-shot,+multicycle+suicide+gene+therapy+by+replication-competent+retrovirus+vectors+achieves+long-term+survival+benefit+in+experimental+glioma.">Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma.</a> Mol Ther. 12, 842-851 (2005).</li><li>Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+a+tagged+chimeric+gammaretrovirus:+identification+of+novel+cis-acting+elements+that+modulate+splicing.">Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing.</a> J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).</li><li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+phases+of+distribution+and+tumor+targeting+by+T+cell+receptor+engineered+lymphocytes+inducing+robust+antitumor+responses.">Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).</li><li>Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-dependent+homotypic+aggregates+regulate+CD8+T+cell+effector+function+and+differentiation+during+T+cell+activation.">ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation.</a> J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).</li><li>Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+extracellular+matrix+from+sectioned+human+tissues.">3-D extracellular matrix from sectioned human tissues.</a> Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).</li><li>Prevention, C. f. D. C. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li><li>Alstergren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+and+directed+migration+of+murine+neutrophils+is+dependent+on+cell+surface+expression+of+CD44.">Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44.</a> Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).</li><li>Zhang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+antigen+precursor+protein+profiles+of+adult+and+pediatric+brain+tumors+identify+potential+targets+for+immunotherapy.">Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy.</a> J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

תאי גידול בהשעית תא בודד היו pipetted לתוך הבארות של שקופיות-רעול פנים טפלון. התאים הורשו לדבוק ולאחר מכן יצרו monolayers בhumidified 5% CO 2, 37 ° C חממה (איור 1 א). monolayers הוקם או חלבוני ECM נגזר מmonolayer יכול להיות שנקטפו למבחנים אלה (איור 1). לימפוציטים מסוג T מפעיל שכ?...

Assay נדידת תאי מחוגי חד שכבתי פותח במקור כדי למדוד את תכונות infiltrative של תאים סרטניים חסיד 1-4 בשקופיות מצופות במטריצה ​​תאית חלבונים (ECM) 5-7 או עם רכיבי ECM בודדים, כגון פיברונקטין או laminin 1,2. הטכניקה מעורבת זריעת השעיה תא בודדת של תאים סרטניים במרכז בארות באמצעות סעפת נירוסטה שקיעת תא (CSM). לאחר שקיעה, התאים הסרטניים היו לדבוק בתחתית הבאר והשינוי בקוטר של אוכלוסיית התא הראשונית לאורך הזמן שימש להקמת שיעור של תנועתיות אופקית. Assay נדידת תאי מחוגי חד שכבתי סיפק יתרון חזותי על פני שיטות קיימות אחרות שהעסיקו transwell צלחות לassay יכולות נדידה במבחנה של תאים; מבחני אלה אינם תורמים להדמיה 8. וכן, זה גם סיפק כמות גדולה של חופש בבחירת timepointזה כאשר הגירה נבחנת, ללא הגבלה על מספר הנקודות זמן חוקר יכול לבחור תמונה לאחר שקיעה. בגלל היכולת להעביר היא פונקציונלי חשובה לתאים שאינם חסיד, במיוחד בתחום של טיפול חיסוני או שבו הם יכולים לשמש ככלי רכב משלוח לוקטורים ויראליים, התאמנו השימוש בCSM להעריך את ההגירה של תאים שאינם חסיד סוגים על משטחי תאים סרטניים, בנוסף לחלבוני ECM. יתרון הנוסף של מיקרוסקופי לדמיין את הנדידה של תאים שאינם חסיד בmonolayers תאים סרטניים קיימא, על ECM המורכב מבודד מהגידול, או על רכיבי ECM פרט הופך assay זה צדדי. מבחני שמעסיקים בארות מצופים בחלבון תאי יחיד אינם משקפים במדויק את מצע רקמת ECM או גידול התאים היו להעביר דרך in vivo. כאן, אנו משמשים alloreactive לימפוציטים ציטוטוקסיות T (alloCTL), רגיש לhistocomp הגדולחלבונים מורכבים atibility (MHC) באמצעות תגובות תאים הסרטניים מעורבים הלימפוציטים בכיוון אחד (MLTR) או תגובות מעורבות הלימפוציטים (הקה&quot;ע) 9, כסוג התא שלנו נציג שאינו חסיד. בדקנו תאים של שני מוצא האדם והעכברי. כאשר הגירה נמדדה על משטחי גידול, תאי הגידול המועסקים היו מטרות או רלוונטיות באופן חלקי, בו מוצגות חלק מאותם החלבונים MHC מצאו על אוכלוסיית התאים המשמשת לרגישות effectors, או מטרות רלוונטיות באופן מלא, עם סט מלא של מולקולות MHC ש effectors היה רגיש כלפי. בחלק מהניסויים, שנהגנו CellTracker הניאון האדום CMPTX או צבע התפשטות תאי eFluor 670 להבחין בין תאי מפעיל והיעד. כמו כן נעשה שימוש התמרה עם קידוד וקטורים ויראליים לחלבוני ניאון כדרך נוספת כדי להמחיש את התאים. עבור מבחני מסוימים, אנחנו transduced alloCTL עם וקטורי retroviral המשכפלים (RRV) קידוד לאמרלד גרין (EMD) חלבון פלואורסצנטי 10,11; לothers, תאים סרטניים היו transduced עם וקטורי lentiviral הקידוד לmStrawberry. AlloCTL היה זרע דרך ערוץ של הסעפת למרכז או monolayers גידול תא או ECM נקטף מן monolayers תאים סרטניים. אינטראקציות תא חסיד ולא חסיד היו דמיינו ידי אור ו / או על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאורך זמן. תאי הפרעה בשכבת התאים הסרטניים בצריכת חשמל נמוך, או גידול עם גרעינים מקוטעים בהספק גבוה היו אינדיקטורים של פגיעה בתא על ידי תמוגה ואפופטוזיס, בהתאמה. אנו דיגיטליים יצרנו מפות ניאון עוצמת המשטח מראים את הנדידה של תאי T fluorescing לא חסיד על תרבויות monolayer. אנחנו גם ציינו cytotoxicity הולידה לmonolayer תא גליומה חסיד לאחר היווצרות אשכול alloCTL לא חסיד שמעליו. כמו כן, התמרה אופקית של RRV-EMD מalloCTL לmonolayer גליומה נצפתה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:239px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Teflon-masked microscope slides</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Cell Sedimentation Manifold</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 150mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 35mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">20 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:239px;">89003-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Distilled, deionized water (sterile)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypsin</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-054-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Celltracker Red CMPTX</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">TrypLE Express (optional)</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:239px;">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Tumor cell culture media (e.g. DMEM)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">AIM-V serum-free media</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">12055-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:203px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:239px;">FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">SPOT Advanced</td>
			<td style="width:203px;">Diagnostic Instruments</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td style="width:239px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:239px;">354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">31/2 x 51/4 Autoclave Pouches</td>
			<td style="width:203px;">Crosstex</td>
			<td style="width:239px;">SCXS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Cell Proliferation eFluor 670</td>
			<td style="width:203px;">eBioscience</td>
			<td style="width:239px;">65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radial mobility and cytotoxic function of retroviral replicating vector transduced, non-adherent alloresponsive t lymphocytes

אנו מדווחים הסתגלות רומן של assay נדידת תאי מחוגי חד שכבתי, שפורסם לראשונה למדוד את הגירת רדיאלי של תאים סרטניים חסיד על חלבוני מטריצת חוץ תאיים, למדידת תנועתיות של תאי מערכת חיסון שכותרתו fluorescently, אדם שאינו חסיד או מפעיל עכברי. טכניקה זו מעסיקה סעפת נירוסטה ולהחליק טפלון 10 היטב להפקיד focally תאי T שאינם חסיד לתוך הבארות מוכנות עם שני monolayers תאים סרטניים ומחוברות או חלבוני מטריקס. מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור ו / או רב-ערוצית משמש כדי לעקוב אחר התנועה וההתנהגות של תאי מפעיל לאורך זמן. צבעי ניאון ו / או וקטורים ויראליים שהקוד לtransgenes ניאון משמש תווית באופן דיפרנציאלי סוגי התאים להדמיה. שיטה זו שונה מדומה מסוג במבחני חוץ גופית העוקבים אחר הגירה / פלישה אופקית או אנכית ניצול תאי שקופיות, אגר או transwell צלחות. Assay מאפשר הדמיה נתונים מפורטים לbדואר שנאסף עם סוגי תאים שונים נבדלים בסמני ניאון ספציפיים; אפילו תת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים (כלומר, transduced / nontransduced) יכולות להיות במעקב. מגרשי הקרינה בעוצמה משטח נוצרים באמצעות ערוצי הקרינה ספציפיים שמתאימים לסוג התא הנודד. זה מאפשר להדמיה טובה יותר של ניידות תא החיסון שאינו חסיד בזמנים מסוימים. ניתן לאסוף ראיות של פונקציות תא מפעיל אחרות, כגון cytotoxicity או העברה של וקטורים ויראליים ממפעיל למקד תאים, כמו גם. לכן, השיטה מאפשרת לחוקרים לתעד מיקרוסקופיים אינטראקציות תא אל התא של דיפרנציאלי שכותרתו, שאינו חסיד עם תאים חסיד מסוגים שונים. מידע זה עשוי להיות רלוונטי במיוחד בהערכת סוגים ביולוגי מניפולציות או הופעלו תאים חיסוניים, שבו הוכחה ויזואלית של פונקציונליות רצויה עם תאי מטרה סרטנית לפני השימוש בם לטיפול בסרטן.

<html> וקטורים ויראליים קידוד לחלבוני ניאון יכולים לשמש בנוסף ל, או במקום, צבע ניאון. התמרה ויראלית צריכה להתבצע מראש של assay תנועתיות. שני סוגים חסיד ולא חסיד תא יכולים להיות דיפרנציאלי שכותרתו. הפרוטוקול עבור התמרה יהיה תלוי בסוג של וקטור המועסק. כאן, אנו transduced alloCTL ב...

Watch this Scientific Journal Video about Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes at JoVE.com

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

radial-mobility-cytotoxic-function-retroviral-replicating-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.7K Views.  UCLA David Geffen School of Medicine. We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality. 

Video: Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...