LWE e RK sono supportati dal National Institutes of Health sovvenzioni R37 NS033506-16 e R01 NS060699-03. MPT è stato sostenuto da un Cancer Society Postdoctoral Fellowship americana Research (PF-10-057-01-MPC). La consulenza e la conoscenza del dottor Matteo Lyman e Dr. Oren Kobiler hanno contribuito a progettare la configurazione microscopio e metodi di imaging cellulare dal vivo. Abbiamo anche estendere grazie a Neal Barlow e Brian T. Kain di Nikon Instruments per la loro assistenza tecnica per l&#39;acquisto, l&#39;installazione e la performance del microscopio.

Sezione 1 - Condizioni di controllo ambientale per la microscopia a fluorescenza live-cell <ol><li> 30 min prima di ogni esperimento di imaging collegare e iniziare il riscaldamento del microscopio stadio top incubatore. <ol><li> Accendere il microscopio, fonti di luce trasmessa e epifluorescente e controlli hardware automatizzati. Aprire il software di controllo del microscopio, NIS Elements, per la connessione al microscopio ed iniziare il raffreddamento della macchina EM-CCD. </li><li> Fissare Lens più caldo per obiettivo appropriato (60X o 100X immersione in olio). Nota: Selezionare lente dell&#39;obiettivo in base a tipo di esperimento. Il contrasto di interferenza differenziale 100X (DIC) è meglio per il monitoraggio di anterogradi assemblee virioni trasportano mentre l&#39;obiettivo di fase 60X è adatto a visualizzare diffusione anterograda. Un ingrandimento inferiore, obiettivi ad immersione non petrolifere non richiedono una lente più caldo in quanto non entrano in contatto diretto con il campione. </li><li> Attaccare stadio superiore incubatore sul palco motorizzato di mi<html> croscope. Assicurare l&#39;inserto appropriato che conterrà il campione è a posto. Collegare la linea di aria umidificata dal controllo incubatrice alla porta di ingresso sul palcoscenico superiore dell&#39;incubatrice. </li><li> Accendere incubatore e lente controlli più caldi e regolare le impostazioni di temperatura alle condizioni precedentemente verificati specifici per l&#39;obiettivo e il campione viene ripreso (vedi discussione). </li><li> Aprire la valvola di controllo del 5% di CO 2 / serbatoio atmosferico del 95% per fornire CO 2 dell&#39;aria integrato per mettere in scena top incubatore. La portata deve essere compresa tra 60 e 80 ml di gas al minuto. Tassi più veloci si tradurrà in una vasta disidratazione del campione, nonostante la camera di umidificazione. </li></ol></li><li> Aggiungere olio lente per lente dell&#39;obiettivo e collocare immediatamente la cultura che verrà ripreso nella fase top incubatore. </li><li> Raggiungere l&#39;equilibrio di temperatura in coltura per un minimo di 10 min. Un&#39;ora è preferito, in particolare per l&#39;imaging notte descritto nella Sezione 3. </li></ol>ve_title &quot;&gt; Sezione 2 - Imaging in tempo reale di anterograda Virion Transport Protocol Eventi <ol><li> Da sei a otto ore prima di imaging, infettare un piatto di 35 mm coprioggetto-fondo maturo, dissociate neuroni SCG con 1 x 10 6 unità formanti placca del virus di interesse (Vedi Tabella 1 per esempio i virus) con il metodo descritto in Taylor et al. 2012A 11. Se testare più di un virus, vaccinazioni off-set da 30-60 min per consentire l&#39;imaging di campioni sequenziali a volte simile post infezione. </li><li> Inserire piatto in fase top incubatore per un minimo di 10 minuti prima di eseguire qualsiasi esperimento. Mentre la temperatura si equilibra, il piano focale si sta spostando e avrà un impatto negativo eventuali esperimenti di imaging. </li><li> Utilizzando la luce trasmessa e l&#39;oculare del microscopio, trovare un corpo cellulare neuronale che ha una estensione assonale chiaramente isolato. In alternativa, utilizzare l&#39;appropriata illuminazione a fluorescenza per trovare una cellula che esprime DATECimporti della tabella di proteine ​​fluorescenti. È importante limitare l&#39;esposizione del campione ad illuminazione fluorescente, in questo passaggio e passaggi successivi, a causa della luce danno cellulare indotto e candeggio delle proteine ​​fluorescenti. </li><li> Attenuare illuminazione a fluorescenza per ridurre l&#39;intensità della luce di eccitazione a cui le cellule sono esposte. Impegnarsi luce attenuando densità neutra (ND) i filtri nel percorso luce di illuminazione a fluorescenza. Per i filmati che durano più di 1 min, un minimo di ND4 devono essere utilizzati per prevenire fotometabolismo di proteine ​​fluorescenti e ampia foto-danneggiamento degli assoni. Strutture altamente fluorescenti in genere può essere visualizzato con un ND8 filtro in posizione. </li><li> Utilizzando il software microscopio (Figura 2 e Supplemental Movie 1A), accendere la luce-percorso alla telecamera EM-CCD. </li><li> Determinare i tempi di imaging e le condizioni ottimali per ogni canale fluorescente. <ol><li> Avviare una finestra immagine dal vivo utilizzando il pulsante &quot;Play&quot;. &lt;/ Li&gt; <li> Determinare le impostazioni di esposizione della fotocamera ottimali per ogni proteina fluorescente. Non superare i 300 ms per canale come aberrazioni dinamiche di strutture virioni rapido movimento si verificherà. Utilizzare il guadagno EM della fotocamera per un ambiente di 300 (raccomandati dal produttore guadagno massimo), per ridurre al minimo il tempo di esposizione e migliorare il rilevamento dei segnali dim. Tempi di esposizione corretta dovrebbe produrre un&#39;immagine con bassa intensità di fondo e segnali ad alta specifiche. </li></ol></li><li> Dopo aver impostato esposizioni e trovare una regione ben definita di assone, il software deve essere configurato per eseguire l&#39;acquisizione di immagini automatizzato. Fermare la finestra di imaging dal vivo per evitare campione sbiancamento. <ol><li> Nel software NIS Elementi, selezionare il 6D - Definire / Esegui applicazione Experiment dal &quot;Applicazioni&quot; menu a discesa. </li><li> Nella finestra di acquisizione del ND, fare clic sulla scheda Ora che determinerà la frequenza di acquisizione delle immagini. Impostare l&#39;intervallo su &quot;No Delay&quot; e la durata di 5 min. Thsoftware e Viene quindi acquisire fotogrammi dell&#39;immagine alla massima frequenza possibile per la durata di 5 min. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Lambda&quot;, che permette di selezionare le configurazioni hardware pre-impostati utilizzati per l&#39;acquisizione di immagine multipla fluorescente. Fare clic sulla prima casella e nel successivo menu a discesa per selezionare una configurazione hardware appropriato. Ripetere l&#39;operazione per tutte le proteine ​​fluorescenti per essere ripreso. </li><li> Assicurarsi che le schede per &quot;XY Posizioni&quot;, &quot;Z-Series&quot; e &quot;Grande immagine&quot; sono de-selezionati. </li><li> Sopra le schede, selezionare la casella &quot;Save to File&quot; per salvare automaticamente le immagini sul disco rigido durante l&#39;acquisizione. Configurare il percorso e il nome file del file di output esperimento. Come esperimenti vengono eseguiti in sequenza, il software verrà aggiunto un numero sequenziale alla fine del nome file designato. </li><li> Una volta che tutte le schede sono state selezionate. Avviare l&#39;esperimento facendo clic sul pulsante &quot;Run-Now&quot;. </li><li> Ottimizzare la velocità di acquisizione delle immagini attraverso le impostazioni di esposizione e imagdimensione e. Usando una piccola regione dell&#39;area dell&#39;immagine-grado spesso accelerare velocità di acquisizione fotogrammi. Definire la regione di interesse con lo strumento ROI nel NIS-Elements, selezionando un&#39;area compresa tra il 25% e il 50% della superficie totale dell&#39;immagine. In alternativa, i tempi di esposizione più brevi potranno aumentare i tassi di acquisizione del telaio, ma diminuisce la qualità del segnale (vedi discussione). </li></ol></li></ol> Sezione 3 - Pernottamento Time-lapse imaging di anterograda spread Eventi <ol><li> Quattro ore prima di imaging, infettano una cultura neuronale compartimenti costruiti in 35 mm μ-Dish. Seminare corpi cellulari neuronali con 1 x 10 6 unità formanti placca del virus di interesse (Vedi Tabella 1 per esempio i virus) con il metodo descritto in Taylor et al. 2012b 12. </li><li> Posizionare delicatamente piatto cultura nella fase top incubatore. Garantire la posizione dell&#39;obiettivo è impostato sul lato del piatto. Portare lentamente l&#39;obiettivo a fuoco, assicuzione l&#39;obiettivo non spinge fino nel campione. Quando il campo fuoco è stato identificato, spostare lentamente l&#39;obiettivo verso il centro del piatto, vicino alla barriera interna demarking il lato interno del vano assone. Durante il movimento, assicurano la profondità fuoco viene mantenuta ed evitare spingendo nel campione. Flessione della superficie plastica dall&#39;obiettivo danneggiare gli assoni e la plastica. </li><li> Aggiungere circa 2 ml di calda (~ 37 ° C), tampone fosfato salino al piatto cultura esterno dell&#39;anello Teflon. Questo circonda la coltura neuronale con un anello di PBS per minimizzare campione disidratazione e fornire isolamento termico. </li><li> Attendere che la temperatura si stabilizzi per almeno 1 ora prima di iniziare l&#39;acquisizione di immagini automatica (3.8). Passi 3.5 tramite 3.7 possono essere configurati in questo periodo. </li><li> Limitare l&#39;intensità della luce al livello più basso possibile per coinvolgere tutti i filtri a densità neutra. Ciò consentirà l&#39;acquisizione di immagini frequente over lunghi periodi di tempo senza eccessivi foto-danneggiamento. Ridurre l&#39;illuminazione si tradurrà in basso segnale, richiedendo esposizioni più lunghe (vedi discussione). </li><li> Utilizzare le impostazioni di esposizione storici o prima di set-up sperimentale generare un piatto parallelo di cellule epiteliali infettate esprimono le proteine ​​fluorescenti bersaglio per stabilire le impostazioni di esposizione, come descritto nella sezione 2.5. </li><li> Dopo aver impostato fidi ai canali necessari, è tempo di configurare il software per l&#39;acquisizione delle immagini automatizzata. Fermare la finestra di imaging dal vivo per limitare campione sbiancamento. <ol><li> Nel software di elementi (Figura 2 e film supplementare 2), selezionare il 6D - Definire / Esegui applicazione Experiment dal &quot;Applicazioni&quot; menu a tendina per visualizzare la finestra di acquisizione del ND. </li><li> Nella finestra di acquisizione ND, fare clic sulla scheda Ora. Impostare l&#39;intervallo di &quot;5 min&quot;. Impostare la durata di 20 ore. Il campo loop verrà calcolata automaticamente per il numero di ripetizioni del program si esibirà. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Lambda&quot;. Fare clic sulla prima casella e nel successivo menu a discesa selezionare la configurazione lambda appropriato per contrasto di fase. Ripetere l&#39;operazione per le posizioni successive, selezionando le impostazioni appropriate per ciascuna proteina fluorescente per essere ripreso. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Grande immagine&quot;, che determina i parametri di immagini multiple per essere combinati in un unico grande campo di vista. Una zona di buone dimensioni composto da 5 x 2 immagini utilizzando un 7% di sovrapposizione cuciture. Ciò consentirà il massimo numero di celle per posizione per essere ripreso senza influire sulla frequenza di acquisizione delle immagini. Inoltre, deselezionare la casella di controllo per &quot;Shutter Chiudi attivo durante il movimento Stage&quot;. Questa opzione aumenta la velocità di acquisizione da parte di non chiudere persiane tra le immagini. </li><li> Selezionare la scheda &quot;XY posizioni&quot;, per identificare più posizioni che verranno sequenzialmente imaged in parallelo durante il corso del film durante la notte. Selezionare le posizioni che definiscono il centro Point per ogni grande area dell&#39;immagine. Selezionare 6-8 posizioni immagine del campione. Una buona zona immagine avrà piccoli gruppi di cellule in stretta apposizione di assoni chiaramente definiti. Cellule non dovrebbero essere impilati uno sopra l&#39;altro e assone bundling dovrebbero essere minimizzati. Il punto di messa a fuoco è il nucleo della cellula. Posizionare l&#39;obiettivo tale che un involucro nucleare chiaramente definito è visto per la maggior parte delle cellule. </li><li> Assicurarsi che la scheda &quot;Z-Series&quot; è deselezionata. </li><li> Configurare la funzione di salvataggio automatico, come descritto sopra nella sezione 2.6.5. </li><li> Testare l&#39;esposizione e le impostazioni di posizione con &quot;1 ciclo di tempo&quot;. Valutare le immagini risultanti per l&#39;illuminazione a luce trasmessa, messa a fuoco e l&#39;inquadratura. Se il focus si è spostato, reimpostare la messa a fuoco per ogni posizione nella scheda XY. Attendere 10 minuti e ripetere questo passaggio fino a fuoco è stabile. </li><li> Dopo che tutte le impostazioni sono stati verificati e testati, avviare l&#39;esperimento automatica facendo clic sul pulsante &quot;Esegui ora&quot;. </li></ol></li&gt; </ol> Sezione 4 - Elaborazione di immagini e di esportazione Data Export <ol><li> Set di dati ottenuti durante live-cell imaging di eventi di trasporto o di diffusione devono essere esportati dal software NIS Elements in tipi di file comunemente utilizzati per un successivo utilizzo in presentazioni e pubblicazioni (Supplemental Movie 3). Per esportare i filmati aprire l&#39;appropriato cruda ND2 file. Nel NIS Elements e selezionare la visualizzazione &quot;split-componente&quot; per visualizzare i canali desiderati fluorescenti. La riproduzione del file a una velocità adeguata; 5 fotogrammi al secondo è un buon punto di partenza per la visualizzazione di fast-trasporti. </li><li> Includere un timestamp per rappresentare un orologio in tempo reale durante la riproduzione del filmato. Fai clic destro sull&#39;immagine e selezionate, Add-informazione ND. Un contatore digitale apparirà nell&#39;angolo in alto a sinistra. <ol><li> Modificare il time-stamp per visualizzare le informazioni. Fare clic destro sul bancone e selezionare Modifica informazioni-ND. Nella successiva finestra di pop-up, modificare il testo in modo da riflettere l&#39;immaginariong parametri che sono importanti. Modifica del carattere, colore e dimensione per chiarezza. </li></ol></li><li> Vai al menu &quot;Modifica&quot; e trovare &quot;Crea vista istantanea&quot; oppure premere il tasto &quot;x&quot;. Questo comando apre la finestra &quot;vista istantanea&quot;. Selezionare &quot;Applica a tutti i fotogrammi&quot; per generare un 8-bit, RGB, file di esportazione-ready contenente i canali fluorescenti da tutto il film. </li><li> Salva come file. AVI per la compatibilità cross-platform. Impostare la velocità di riproduzione a 200 msec per fotogramma. I file avi. Generati da NIS elementi possono poi essere ulteriormente compressi con altri software di conversione nel tipo di file desiderato. </li></ol>

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Non abbiamo nulla da rivelare.

L&#39;obiettivo di imaging cellulare dal vivo sta osservando processi biologici che si verificano senza significative alterazioni con l&#39;atto di osservazione. Questo obiettivo è raggiunto attraverso l&#39;ottimizzazione tre variabili: il controllo ambientale, la velocità di formazione immagine, e l&#39;illuminazione a fluorescenza. Queste variabili interdipendenti devono essere bilanciati per ottenere condizioni di imaging vitali. I protocolli presentati utilizzano specifiche condizioni per produrre i risultati rap...

L&#39;infezione del sistema nervoso periferico (SNP) di alphaherpes virus come il virus herpes simplex (HSV) -1, -2, e virus pseudorabies (PRV) prevede diversi passaggi intricati e altamente regolamentato in tutto il ciclo vitale del virus. Trasporto all&#39;interno neuroni del sistema nervoso periferico è fondamentale durante gli eventi di entrambi infezione virale primaria e la successiva diffusione inter-host. I meccanismi molecolari che modulano due componenti del ciclo di vita virale; trasporto diretto delle assemblee virali di distanza dal corpo cellulare all&#39;interno di assoni (trasporto anterogrado) e la successiva trasmissione dei virioni di cellule sensibili (diffusione anterograda) sono importanti per la comprensione herpesvirus patogenesi. Il trasporto e l&#39;uscita di particelle virali in neuroni dipende montaggio di un virione maturo infettiva 1,2. Saggi precedentemente fissato, tra l&#39;immunofluorescenza (IF) e la microscopia elettronica (EM), sono stati usati per studiare lo stato di assemblaggio delle particelle e la protinterazioni ein connessi ai trasporti virione e la diffusione 3-6. Tuttavia la natura dinamica del trasporto di virioni e manufatti sperimentali introdotte dalla fissazione chimica confusa l&#39;interpretazione delle immagini fisse 7,8. Recentemente, un certo numero di proteine ​​di fusione virale-fluorescenti sono state descritte per HSV e PRV cui impatti trascurabili sulla funzionalità delle proteine. Proteina fluorescente verde (GFP) e proteine ​​fluorescenti rossi (mCherry o MRFP) fluorofori sono spesso in coppia per consentire l&#39;imaging di due dei tre componenti strutturali di un virione maturo: capside, tegumento, e glicoproteina 9-11. Imaging cellulare dal vivo di trasporto anterogrado utilizzando virus dual-etichettati visualizza lo stato di assemblaggio delle particelle virali durante il trasporto. Fluoroforo simili esprimendo ceppi virali vengono utilizzati per visualizzare il numero e la diversità dei genomi virali a seguito diffusione 12,13. Le proprietà delle proteine ​​fluorescenti (recensione in 14,15) di grande impattola capacità di visualizzare assemblee virali o cellulari. Le proprietà intrinseche della proteina fluorescente, tra cui auto-interazione e di stabilità, devono essere considerati durante la progettazione e la sperimentazione di nuovi fusioni proteiche per la conservazione della funzionalità di tipo selvaggio. In concomitanza con la fusione di proteine ​​fluorescenti, due ben caratterizzati in sistemi di colture cellulari in vitro sono impiegate per l&#39;imaging cellulare dal vivo di infezione da herpes virus: dissociata 16 e 17 compartimenti stagni (Figura 1A) ratto superiori gangli (SCG) neuroni cervicali. In entrambi i sistemi, embrione del SCG sono sezionati, dissociato da corpi cellulari singoli, e cromato per la coltura in vitro 18. Neuroni SCG sono parte del sistema nervoso autonomo e possono essere facilmente coltivate e differenziati per il fattore di crescita neuronale (NGF) in un maturo polarizzato stato ex vivo. Neuroni SCG dissociate formano una rete estesa di assoni che permette fo la visualizzazione di particelle virali in quanto sottoposti trasporto anterogrado 6. Culture SCG compartimenti stagni forniscono isolamento fluidico del corpo cellulare dei neuroni (vano S) e termini assoni distali (vano N) 19. Un certo numero di protocolli dettagliati per la costruzione e l&#39;uso di neuroni compartimenti utilizzando originale 20 o modificati Campenot camere di 17 sono stati pubblicati in precedenza. Isolamento fluidico permette di infezione selettiva dei corpi cellulari neuronali e l&#39;individuazione di virioni progenie dopo il trasporto a isolate Termini assoni. Placcatura cellule epiteliali nei termini prima dell&#39;infezione fornisce cellule riceventi per la diffusione dell&#39;infezione virale. Ci sono molti elementi essenziali importanti per tutti gli esperimenti di imaging cellulare dal vivo, ma la più rilevante per i nostri protocolli sono: acquisizione automatica immagine, illuminazione fluorescente, velocità di formazione immagine e di controllo ambientale. Per tutti gli esperimenti di imaging, utilizziamorovesciata, automatizzato, microscopio a epifluorescenza illuminazione (Figura 1B). Il microscopio è costruito attorno al Nikon Eclipse Ti base e si avvale di un certo numero di sistemi motorizzati controllati da computer per riconfigurare rapidamente il microscopio durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine automatizzato. Per l&#39;illuminazione a fluorescenza, usiamo un ampio spettro di mercurio lampada ad arco che può essere attenuato con filtri a densità neutra lungo il sentiero dell&#39;illuminazione. Filtri di eccitazione limitano lo spettro di illuminazione fluorescente e quando accoppiato con multi-pass specchi dicroici e filtri di emissione di fluorescenza visualizzare i composti fluorescenti specifici. I filtri di eccitazione e di emissione sono montati, veloce commutazione ruote portafiltri indipendenti per consentire una rapida acquisizione sequenziale dei canali fluorescenti differenti. La velocità di acquisizione dell&#39;immagine è ulteriormente rafforzata con una telecamera EM-CCD sensibile e veloce, utile per il rilevamento di segnali di bassa intensità e breve immagine tempi di lettura. Controllo ambientale sulla microscope è raggiunto con un alto stadio riscaldato incubatore e un riscaldatore lente obiettivo di mantenere i campioni a temperature elevate, mentre un umidificata e CO 2 atmosfera arricchita viene passato nell&#39;incubatore. Il microscopio è tenuto in una stanza buia con temperatura ambiente mantenuto vicino ai 25 ° C e luce esterna minimizzato con tende oscuranti su tutte le finestre. I seguenti protocolli descrivono l&#39;uso di questo sistema per il trasporto anterogrado e dosaggi diffusione. Un certo numero di alternative esistono per il controllo per le variabili di imaging cellulare dal vivo. Il controllo delle impostazioni di microscopia può essere eseguita manualmente o tramite sistemi automatizzati dipendenti dal software proprietario. Illuminazione a fluorescenza può essere ottenuto con sorgenti laser alogeno, LED o. La velocità di formazione immagine viene modificata dalla velocità di commutazione filtro e il tempo di visualizzare il segnale con il sistema di rilevamento associato. Controllo ambientale può essere realizzato con hardware specializzato sul mifase croscope, recinto di tutto o parte del microscopio in una scatola riscaldata e umidificata, o elevando la temperatura della stanza in cui verrà eseguita microscopia. Ciascuna di queste alternative presenta vantaggi e svantaggi relativi a costi e prestazioni. Nel protocollo successivo, abbiamo dettaglio l&#39;uso di cellule vive per studiare rapido trasporto anterogrado e la diffusione di anterograda alphaherpes virus attraverso l&#39;uso di ceppi virali ricombinanti. In tempo reale l&#39;imaging cellulare dal vivo visualizza capside, tegumento, e / o della glicoproteina co-localizzazione su strutture dinamiche in fase di trasporto all&#39;interno assoni 11. Pernottamento timelapse di imaging di colture neuronali compartimenti visualizza assonale uscita virione e l&#39;infezione di cellule suscettibili 12. I protocolli presentati qui sono stati ottimizzati per l&#39;uso con il nostro sistema di imaging particolare, ma sono presentati in termini generali relativi ai quattro elementi di imaging cellulare dal vivo. Nella discussione abbiamovolontà ulteriore dettaglio alcuni ottimizzazione che è necessario per la sperimentazione di successo.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm glass bottom culture dish</td>
 <td>MatTek Corporation; Ashland, MA </td>
 <td>P35G-1.5-20-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm &mu;-Dish </td>
 <td>Ibidi USA LLC, Verona, WI </td>
 <td>81156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope body </td>
 <td>Nikon Instruments Inc. </td>
 <td>Nikon Eclipse Ti</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized microscope X-Y stage</td>
 <td>Prior Scientific; Rockland, MA </td>
 <td>H117 ProScan Flat Top</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized filter wheels</td>
 <td>Prior Scientific</td>
 <td>HF110 10 position filter wheel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent illumination source </td>
 <td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada </td>
 <td>X-Cite 120Q </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-band Fluorescence filter sets</td>
 <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td>
 <td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td>
 <td>iXon3 897 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chamlide stage top environmental incubator</td>
 <td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td>
 <td>TC-L-10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective lens heater</td>
 <td>Bioptecs; Butler, PA</td>
 <td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Analysis software</td>
 <td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td>
 <td>NIS Elements </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread

Progressi nelle tecniche di microscopia di fluorescenza di cellule vive, così come la costruzione di ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine ​​di fusione fluorescenti hanno permesso visualizzazione in tempo reale di trasporto e diffusione del virus alphaherpes infezione di neuroni. L&#39;utilità di nuove proteine ​​di fusione fluorescenti a membrana virale, in involucri, e capsidi, in collaborazione con l&#39;imaging cellulare dal vivo, identificato assemblee di particelle virali in fase di trasporto all&#39;interno di assoni. Utensili simili sono stati impiegati con successo per analisi di cellula-cellula diffusione di particelle virali per quantificare il numero e la diversità di virioni trasmessi tra le cellule. È importante sottolineare che le tecniche di imaging cellulare dal vivo di trasporto anterogrado e la diffusione producono una ricchezza di informazioni tra le velocità delle particelle di trasporto, distribuzioni di particelle, e le analisi temporali della localizzazione delle proteine. Accanto a classici tecniche genetiche virali, queste metodologie hanno fornito spunti criticiin importanti questioni meccanicistici. In questo articolo descriviamo in dettaglio i metodi di imaging che sono stati sviluppati per rispondere alle domande fondamentali della alphaherpes trasporto e diffusione del virus.

Anterograda Trasporti L&#39;applicazione di questo protocollo per le infezioni delle dissociate culture SCG con PRV 348, un ceppo ricombinante PRV esprimono GFP-US9 e proteine ​​di fusione della membrana GM-mCherry, ha facilitato la visualizzazione del trasporto anterogrado di virioni (Figura 3 e Movie supplementare 4). L&#39;incorporazione di queste proteine ​​di fusione in particelle virali risultati nella loro rilevazione sul trasporto puncta, e le c...

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

L&#39;imaging cellulare dal vivo di infezioni da virus alphaherpes consente l&#39;analisi degli eventi dinamici di trasporto diretto e la diffusione intercellulare. Qui vi presentiamo le metodologie che utilizzano ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine ​​di fusione fluorescenti per facilitare la visualizzazione delle assemblee virale durante l&#39;infezione di neuroni primari.

Imaging cellulare dal vivo di Alphaherpes Virus Trasporti anterograda e Diffusione

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

live-cell-imaging-alphaherpes-virus-anterograde-transport

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K Views.  Montana State University. L'imaging cellulare dal vivo di infezioni da virus alphaherpes consente l'analisi degli eventi dinamici di trasporto diretto e la diffusione intercellulare. Qui vi presentiamo le metodologie che utilizzano ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine ​​di fusione fluorescenti per facilitare la visualizzazione delle assemblee virale durante l'infezione di neuroni primari.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

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Immunologia e infezioni

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

Un virus fluorescente di Luciferasi-fluorescente Reporter per l'imaging dal vivo e la quantificazione dell'infezione virale

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Imaging in tempo reale della rigenerazione della ghiandola sottomandibolare del topo

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Autore in primo piano: Studio delle interazioni tra macrofagi e cellule epiteliali nella rigenerazione delle ghiandole salivari dopo un infortunio 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...